Extracto
Antecedentes
A pesar de la evidencia que activó los macrófagos actúan en un microambiente inflamatorio que promueve tumores gástricos a través de β- señalización catenina, los efectos de la señalización de β-catenina en la metástasis de células de cáncer gástrico y la relación de estas células y la zona macrófagos asociados a tumores no han sido directamente estudiado.
Métodos
la tinción inmunohistoquímica fue empleado para analizar a 103 pacientes. Un ensayo de invasión se utilizó para evaluar la relación entre los macrófagos y las células de cáncer gástrico. ß-catenina se lleva a cabo con ganancia de función y enfoques de pérdida de función. Para evaluar el mecanismo de regulación de β-catenina en las células de cáncer gástrico, Western Blot y la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa se utilizaron.
Resultados
El aumento de la densidad de los macrófagos se asoció con una etapa avanzada y supervivencia de los pobres . líneas celulares de cáncer gástrico co-cultivadas con macrófagos medio condicionado mostraron una mayor acumulación nuclear de β-catenina y el aumento de la capacidad invasora. AKT pero no ERK regulado translocación β-catenina. MMP7 y CD44, tanto β-catenina genes aguas abajo, estaban involucrados en la invasión de células de cáncer gástrico macrófagos activados.
Conclusión (s)
En conjunto, los datos clínicos sugieren que la infiltración de macrófagos se correlaciona con el aumento de grado y mal pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico sometidos a resección radical. Los macrófagos pueden inducir la invasividad mediante la activación de la vía de β-catenina
Visto:. Wu MH, Lee WJ, Hua KT, Kuo ML, Lin MT (2015) de macrófagos de infiltración induce cáncer gástrico invasividad mediante la activación de la β-catenina . PLoS ONE 10 (7): e0134122. doi: 10.1371 /journal.pone.0134122
Editor: Fabricio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, ITALIA
Recibido: 16 Septiembre, 2014; Aceptado: July 6, 2015; Publicado: July 30, 2015
Copyright: © 2015 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:.. Este trabajo fue apoyado por becas de Consejo Nacional de Ciencia, Taiwán (NSC 98-2314-B-002-055-MY2)
Conflicto de intereses: los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es uno de los cánceres más comunes en todo el mundo y casi dos tercios de estos pacientes morirán de. su enfermedad. [1] GC está estrechamente asociado con
Helicobacter pylori
infección, lo que conduce a la inflamación crónica. [2] Este microambiente inflamatorio se caracteriza por la presencia de leucocitos de acogida con principalmente macrófagos, tanto en el estroma de sostén y tejidos tumorales. [3] las investigaciones indican que las respuestas inflamatorias asociadas a tumores, tanto locales como sistémicos, son factores independientes importantes en la progresión tumoral y la metástasis. [4, 5] sin embargo, los vínculos entre estos mediadores moleculares y la inflamación crónica no se comprenden plenamente .
la activación de la vía Wnt es un paso importante en la carcinogénesis. Las mutaciones a lo largo de la vía de Wnt-β-catenina se producen en aproximadamente el 90% de los carcinomas colorrectales y hepatocelulares y en aproximadamente 30% de GC. [6, 7] Además, factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) derivado de macrófagos activados promueve actividad β-catenina en células de GC. [8, 9] Sin embargo, a pesar de evidencia de que activa los macrófagos actúan en un microambiente inflamatorio para promover la tumorigénesis gástrico a través de la señalización de β-catenina, los efectos de la señalización de β-catenina activado en la metástasis de células GC y la relación de estas células con los macrófagos asociados a tumores circundantes (TAM) no se han estudiado directamente.
con base en los hallazgos anteriores, la hipótesis de que la vía de β-catenina también pueden estar involucrados en la regulación de los macrófagos inducida por metástasis GC. En este estudio, se examinó por primera vez la densidad de los macrófagos infiltrados y la expresión de β-catenina en los tejidos de carcinoma gástrico mediante inmunohistoquímica (IHC). Se demostraron las características clínico-patológicas del carcinoma gástrico y el pronóstico. Además, hemos encontrado que los macrófagos inducen la translocación nuclear de β-catenina y mejoran la capacidad de invasión de las células de GC. Nuestros hallazgos demuestran y apoyan además un vínculo importante entre TAM y su mediador de señalización corriente abajo, β-catenina, en la regulación de la metástasis GC.
Material y Métodos
Pacientes y muestras
el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Junta y humano de Revisión Institucional de la National Taiwan University hospital. Se obtuvo el consentimiento por escrito para el uso de las muestras con fines de investigación de todos los pacientes antes de la cirugía. La información del paciente se convierte en anónima y DE-identificado antes del análisis.
En el estudio participaron de forma retrospectiva 205 pacientes con diagnóstico de GC que recibieron resección quirúrgica radical en el Departamento de Cirugía General, Universidad Nacional de Taiwán desde enero de 1998 a enero de 2002. De estos, 102 pacientes que carecían de los datos de seguimiento o que murieron de complicaciones perioperatorias fueron excluidos y los 103 pacientes restantes se incluyeron en los análisis. clinicopathological variables se clasificaron según la clasificación TNM (5ª edición, 1997) y las características se resumen en la Tabla 1. La supervivencia global (OS) se define como el intervalo entre la cirugía y la muerte o entre la cirugía y el último seguimiento de los pacientes supervivientes.
Anticuerpos monoclonales y IHC
Las muestras resecadas de GC fueron fijadas en formol e incluidos en parafina. Las secciones se examinaron para TAM infiltración y β-catenina usando un anticuerpo anti-CD68 monoclonal (clon KP1, DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca) y el anticuerpo monoclonal β-catenina (clon 15B8, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), respectivamente.
Evaluación de la inmunotinción
Para evaluar la densidad de macrófagos CD68 + infiltrarse en los tejidos, cortes de tejido fueron examinados por una junta certificada patólogo (IC enero) a baja potencia (100 ×) y los cinco más representativo campos se seleccionaron a 400 × magnificación. Los resultados se contaron manualmente y se expresaron como la suma del número de células en cinco 400 × campos microscópicos para cada área de cada muestra.
Cell Cultura
células GC AGS, N87 (comprado de la American Type Culture Collection (Manassas, VA)), MKN45 (adquirido en la investigación de la ciencia Banco de Recursos de Salud (Osaka, Japón)) y TSGH (adquirido de la Colección Biorecursos y el Centro de Investigación (Hsinchu, Taiwán)) y celular de monocitos humanos línea THP-1 (comprado de American Type Culture Collection (Manassas, VA)) las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Life Technologies, Inc., Rockville, MD) con 10% de suero bovino fetal (FBS, Life Technologies, Inc. ) y 2 mM L-glutamina (Life Technologies, Inc.).
células THP-1 se sembraron en placas de cultivo y inducidas a diferenciarse en macrófagos mediante la incubación con 100 ng /ml 12-O-tetradecanoilforbol-13 acetato (TPA, Sigma-Aldrich) durante 24 h. Los macrófagos se lavaron tres veces con medio RPMI que contiene 10% de FBS, se incubaron en este medio durante otras 24 h para eliminar el efecto de TPA y se incubaron en medio libre de suero durante otras 24 h. Los sobrenadantes del cultivo cosechados y agrupados se utilizan como macrófagos medio condicionado (CM) como se describe anteriormente. [5, 10]
proliferación /viabilidad Ensayo
células GC fueron sembradas en placas de 96 pocillos y co-cultivadas con o sin CM macrófagos. La proliferación /viabilidad se determinó por un ensayo colorimétrico usando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) (Sigma-Aldrich).
In Vitro Ensayo de Invasión
El ensayo de invasión se realizó utilizando transwell cámaras de cultivo de células (Millipore Corp., Billerica, MA). Las células invasoras se contaron a 400 × magnificación en 10 campos diferentes para cada inserto. El experimento se repitió tres veces.
Extracción de ARN y RT-PCR
Después de la estimulación con o sin CM macrófagos durante 6 h, se recogieron las células de GC y el ARN total extraído usando el kit de reactivo Trizol ( Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. cDNA se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores para MMP7 (adelante: 5'-AGTCAATCCTGCCTTCTTAGCC, inversa: 5'-GCTCCCACCTTCCCTCTTGG), CD44 (adelante: 5'-TGCCGCTTTGCAGGTGTAT, revés: 5'-TCCCATGTGAGTGTCTGGTAGC), ciclina D1 ( hacia adelante: 5'-CCCAGCCATGGAACACCA, revés: 5'-GGAGGGCGGATTGGAAATGA), c-myc (adelante: 5'-AAAGAAGGTGTTGGGGTCGG, revés: 5'-TGGCTCCCCCTGTTATTTGG) y GAPDH (adelante: 5'-GGGTGATGCAGGTGCTACTT, inversa: 5'-GGCAGGTTTCTCAAGACGGA) .
nuclear y citoplasmática Fraccionamiento
Después de la estimulación con o sin CM macrófagos durante 6 horas, las células se lisaron GC en 300 l de tampón de lisis en hielo y centrifugar a 5.400 rpm. El sobrenadante se recogió como una fracción citosólica. fracciones nucleares se recogieron, a continuación, ejecutar en la electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) para el análisis de transferencia de Western.
Western Blotting Análisis
Después de la estimulación con CM macrófagos, las células se lavaron con PBS , raspado en tampón RIPA y se centrifugó. Los lisados celulares se sometieron a 10% SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore Corp.) La membrana se sondeó usando anticuerpos primarios para la β-catenina, AKT, ERK, JNK (SC1496, SC8312, SC154, SC474, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, EE.UU.), MMP7 (MAB3322, CHEMICON, Temecula, CA, EE.UU.), CD44 (ab51037, Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.), c-myc (GTX103436, GeneTex, la ciudad de Hsinchu , Taiwán), la ciclina D1 (SC246, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA), β-actina (ab8226, Abcam), HDAC1, p-AKT, p-ERK, p-JNK (SC7872, SC7985-R, SC7383, SC6254, Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA) y el anticuerpo secundario (Santa Cruz Biotechnology).
inmunocitoquímica
el anticuerpo anti-β-catenina totales se utilizó como anticuerpo primario y anti ratón inmunoglobulina G (IgG) Alexa 594 se utilizó como anticuerpo secundario. cubreobjetos fueron montadas utilizando medio de montaje que contiene DAPI para la tinción nuclear.
lentiviral producción y la infección
ARN de horquilla corta (shRNAs) fueron adquiridos de la facilidad de la base nacional de RNAi en Sínica Académico (Taipei, Taiwán). La secuencia diana de β-catenina shRNA 1 era 5'CCGGTCTAACCTCACTTGCAATAATCTCGAGATTATTGCAAGTGAGGTTAGATTTTTG-3 '; la de β-catenina shRNA 2 era 5'-CCGGTTGTTATCAGAGGACT-AAATACTCGAGTATTTAGTCCTCTGATAACAATTTTTG-3 '. El vector lentiviral y sus vectores de empaquetamiento fueron transfectadas en células de empaquetamiento 293T mediante transfección con fosfato de calcio. Brevemente, las células se dividieron 293T (10
6) en 10 cm
2 platos 1 día antes de la transfección. Luego, las células se transfectaron con 10 g shRNA vectores y 10 g de pCMVΔR8.91 (el vector de empaquetamiento) y 1 g de pMD.G (vector de sobre). Después de 5 h de incubación, el medio de transfección se reemplazó con medio de cultivo fresco. Cuarenta y ocho horas más tarde, se recogió el medio que contiene lentivirus-de la transfección y se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min para sedimentar los restos celulares, el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45-m, y las células diana fueron infectados con fresco lentivirus que contiene medio (suplementado con 8 mg /ml de polibreno) durante 24 h.
análisis estadístico
el análisis estadístico de las características clínicas se realizó utilizando la χ
2 de prueba y el grado de infiltración entre los dos grupos se compararon mediante la prueba t. Las curvas de supervivencia se construyeron utilizando el método de Kaplan-Meier y la significación estadística se analizaron mediante la prueba de log-rank. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Correlación de variables inmunohistoquímicas con características clínico en pacientes GC
El análisis inmunohistoquímico mostró un patrón de tinción citoplásmica CD68 para los macrófagos. CD68 + macrófagos se distribuyeron a lo largo de los tejidos peritumorales y intratumorales pero sólo escasamente dispersas en la mucosa normal (Fig 1A-1C). La densidad de los macrófagos CD68 + fue especialmente alta en la etapa 4 lesiones (pT4) tumorales tumorales patológica en comparación con lesiones pT1 (Figura 1D). Para determinar la asociación entre las características clínicas y la densidad de macrófagos CD68 +, + cargos de macrófagos CD68 se dividieron en los de arriba y por debajo de los valores medios. Se encontró que el número de macrófagos CD68 + que se asocia con la profundidad del tumor y la etapa (p = 0,001 y p = 0,043, respectivamente) (Tabla 1). Esta observación sugiere que los macrófagos CD68 + pueden ser importantes en la promoción de la invasión tumoral. Para un análisis más detallado, se trazaron las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier para determinar la asociación de los macrófagos con la supervivencia (Figura 2). La densidad de macrófagos CD68 + en el tejido tumoral se asoció negativamente con la supervivencia global (p = 0,0073). Los pacientes con un elevado número de macrófagos CD68 + tumorales tenían una supervivencia general más corta que aquellos con un bajo número de macrófagos CD68 +.
La inmunotinción contra CD68 se realizó en portaobjetos de tejido de pacientes con cáncer gástrico. CD68 + macrófagos tinción era escaso en la mucosa gástrica normal (A). Se detectaron células CD68 +, tanto en el estroma tumoral y el nido (B & amp; C). La densidad de macrófagos CD68 + en tumor patológico estadificación (pT) 1 (D) y pT4 (E) lesiones tumorales.
El aumento de expresión y más fuerte señal de β-catenina se observaron mediante tinción IHC en los tumores. En la mayoría de los casos, la expresión de β-catenina se encuentra principalmente en el citoplasma (Fig 3A). Curiosamente, una fuerte tinción nuclear de células GC β-catenina se asoció con CD68 + macrófagos en las lesiones tumorales, especialmente frente a la invasión tumoral (Fig 3B). Sobre la base de estos resultados, la hipótesis de que la infiltración de macrófagos puede activar la señalización de β-catenina en las células tumorales gástricas, que luego probablemente conduce a la invasión en la malignidad gástrica.
β-catenina fue altamente expresado en los tumores. (A) En la mayoría de los casos, la expresión de β-catenina se encuentra principalmente en el citoplasma. Sin embargo, (B) una fuerte tinción nuclear de β-catenina en las células de GC se asoció positivamente con CD68 + macrófagos en las lesiones tumorales.
Requisitos de los macrófagos de la invasión tumoral en GC y activado invasión inducida por macrófagos de las células GC
a fin de confirmar nuestros hallazgos clínicos
in vitro
, primero macrófagos co-cultivadas con diferentes líneas de células GC (AGS, N87, MKN-45 y TSGH). Todas las líneas celulares GC probados sería reclutar macrófagos para migrar y la capacidad de los macrófagos-reclutamiento era dependiente del grado de malignidad de las células cancerosas como se determina por su capacidad invasiva (Fig 4A). [11] Para evaluar si la invasividad o la proliferación de células de GC puede ser regulada por los macrófagos, AGS, N87, MKN45 y TSGH fueron co-cultivadas con y sin macrófagos o CM de macrófagos durante 24 h y sus capacidades de invasión y proliferación probadas. Todos los tipos de células co-cultivadas con macrófagos o CM de macrófagos mostraron un aumento de casi 2 veces en el número de células invasoras (en comparación con controles negativos, p & lt; 0,05), que no está asociado con su capacidad de proliferación (Fig 4B-4D ).
(A) la actividad de migración de THP-1 monocitos co-cultivadas con diferentes líneas celulares de cáncer gástrico (AGS, N87, MKN-45 y TSGH). THP-1 de monocitos será reclutado por diferentes líneas celulares de cáncer gástrico y la capacidad de reclutamiento es dependiente del grado de malignidad. (B) Invasion capacidad de las células de GC tratados por CM macrófagos. Cuatro tipos diferentes de células GC (AGS, MKN45, N87 y TSGH) se sembraron en una cámara de Boyden y co-cultivadas con o sin células de macrófagos o CM de macrófagos durante 24 horas. habilidades de invasión de cada línea celular se midieron
in vitro
durante 24 horas. Todos los datos representan la media aritmética ± SEM. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0.01. (C) Efecto de los macrófagos CM co-cultivadas con células. N87 y células AGS fueron co-cultivadas con CM macrófagos, respectivamente, durante 24 horas y la viabilidad celular se determinó mediante el ensayo de MTT.
nuclear translocación de β-catenina en las células de GC por macrófagos activados
se realizó un experimento in vitro para entender si la señalización de β-catenina participó en la invasión de células GC macrófagos activados. Como se muestra en la figura 5A, la inmunorreactividad de β-catenina se encontró en la fracción nuclear de células N87 tan pronto como 15 minutos después del tratamiento de los macrófagos CM, y la cantidad de proteína β-catenina nuclear aumentado de una manera dependiente del tiempo. En línea con estos descubrimientos, la inmunofluorescencia mostró acumulación y la localización nuclear de β-catenina en células GC co-cultivadas con CM macrófagos en comparación con los controles cocultured en N87 (Fig 5B). Estos resultados sugieren fuertemente que los factores solubles derivados de macrófagos ayudar a mediar en la acumulación y la translocación nuclear de β-catenina en células de GC. Transitoriamente derribado β-catenina por shRNA y encontramos disminución de la expresión de proteína β-catenina dentro de las 24 h. La ablación genética de β-catenina en las células N87 no aumenta su capacidad invasiva después del tratamiento de los macrófagos CM. Por el contrario, no transfectadas y control shRNA tenido ningún cambio en la capacidad invasiva de las células N87 en tratamiento de macrófagos CM (Fig 5C). La cantidad de proteína β-catenina nuclear también se incrementó en el AGS y MKN45 células después del tratamiento de los macrófagos CM (S1 figura).
(A) β-catenina se acumula en el núcleo después del tratamiento con CM macrófagos durante 30 minutos en células N87. No se observaron (B) Immunofiuorescent imágenes con un microscopio confocal. células positivas β-catenina se analizaron mediante el uso de un anticuerpo anti-β-catenina, que es reconocido por el anticuerpo secundario de conejo conjugado con FITC, representado por la fluorescencia verde; tinción nuclear fue detectado por contratinción células con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), representada como fluorescencia azul. Co-cultivo con macrófagos CM, tinción immunofiuorescence mostró complejos de β-catenina-FITC trasladadas en el núcleo. (C) La invasión capacidad de las células tratadas por CM GC macrófagos.
Efectos de los macrófagos en la expresión de β-catenina y los genes abajo en células N87
Se evaluó la tradicional Wnt /β-catenina genes aguas abajo MMP7, CD44, c-myc y ciclina D1 para determinar si se activan por los macrófagos. Los niveles de mRNA y proteína de MMP7, CD44 y los genes c-myc se aumentaron todos significativamente en las células incubadas con CM N87 macrófagos y los niveles de ciclina D1 aumentó ligeramente (Fig 6A). Después de que provocó disminución de la actividad de la invasión derribando β-catenina, MMP7, CD44 y ciclina D1, pero no c-myc mostró baja regulación de proteínas (figura 6B). Para confirmar la relación entre la capacidad de invasión y MMP7 y CD44, hemos probado la capacidad de un anticuerpo neutralizante para bloquear la actividad MMP7 y CD44. capacidad invasión fue significativamente comprometida por el tratamiento previo con 2,5 g /ml anti-MMP7 y con 10 mg /ml anti-CD44 (figura 6C), respectivamente, lo que sugiere la participación de ambos genes en la invasión de células GC macrófagos activados. Nos pareció que los niveles de proteína de CD44 y ciclina D1 genes se incrementaron en las otras líneas celulares GC (AGS) y MKN45 incubadas con CM macrófagos pero MMP7 y c-myc se cambiaron no significativa (Fig S2).
( a) Efecto de la CM macrófagos en ARNm y proteínas de expresión de β-catenina genes corriente abajo. células N87 fueron cultivadas en la presencia o ausencia de CM macrófagos. Para ARN y proteínas, las células se recogieron después de 6 horas y 24 horas de tratamiento, respectivamente. las células (B) N87 con o sin abajo ronda de β-catenina utilizando shRNA-2 fueron co-tratadas en presencia o ausencia de CM macrófagos. Se recogieron las células después del tratamiento N87 24 horas y se analizaron con transferencia de western. (C) Efecto de MMP7 neutralizó anticuerpo en las células GC invasión. células N87 en presencia de CM de macrófagos durante 24 horas fueron pre-tratados con varias dosis MMP7 anticuerpo neutralizado (0, 0,625, 1,25 y 2.5μg /ml) durante 1 hora isotipo IgG fue utilizado como un control de bloqueo. (D) Efecto de CD44 neutralizó anticuerpo sobre la invasión de células GC. células N87 en presencia de CM de macrófagos durante 24 horas fueron pre-tratados con varias dosis de anticuerpo CD44 neutralizado (0, 1,25, 2,5, 5 y 10 mg /ml) durante 1 hora. Isotipo IgG fue utilizado como un control de bloqueo. Todos los datos representan la media aritmética ± SEM. *
p Hotel & lt; 0.05.
Otros han informado de una posible intersección de la vía MAPK con la vía de señalización de Wnt /β-catenina. [12, 13] En consecuencia, realizó un tiempo de estudio y encontró que sólo fosfo-AKT y la expresión de fosfo-ERK se upregulated cuando son tratados con CM macrófagos (Fig S3 a). Para confirmar la interacción entre la vía de AKT /ERK y β-catenina, pretratados células con el inhibidor de ERK (U0126) o el inhibidor de AKT (LY294002). Disminución de la translocación β-catenina en el núcleo sólo se encontró en las células tratadas con el inhibidor de AKT pero no inhibidor de ERK, lo que indica la vía de señalización /β-catenina Wnt macrófagos avtivated pueden ser regulados por AKT (Fig S3B). En las células de GC, el efecto AKT parece ser dominante en el macrófago activado vía de señalización /β-catenina Wnt. Estudios anteriores también sugieren que el TNF-α producido por macrófagos es un mediador clave de la inflamación y podría promover la actividad β-catenina en las células tumorales. Hemos encontrado que la utilización de anticuerpos neutralizantes contra el TNF-α en la N87 de activación de supresión de β-catenina en virtud de la exposición a CM macrófagos (figura S4).
Discusión
El microambiente de un tumor es de importancia crítica en determinar la función de leucocitos y fenotipo. Los conflictos de datos ha mostrado funciones, antitumoral o protumorigénicas en los macrófagos en particular, sin embargo nuestros datos indican macrófagos juegan un papel protumorigénicos en pacientes con cáncer gástrico. En la mayoría de los tumores, los TAM producen una gran cantidad de factores que promueven el crecimiento del tumor y la angiogénesis. [14, 15] El grado de infiltración de macrófagos en el nido de células cancerosas es también un factor importante para predecir la supervivencia en pacientes con cáncer gástrico. [16-18] resultados de IHC en este estudio demuestran claramente que la densidad de macrófagos en el tejido GC se correlaciona con el grado de estadio clínico (especialmente en el tumor [T] etapa) y la supervivencia en los pacientes. Los estudios actuales también implican que los macrófagos pueden desempeñar funciones dañinas en CG avanzado. Este hallazgo está en armonía con los estudios que sugieren que el microambiente inmunológico puede ser protumoral más que antitumoral, a pesar de algunos datos contradictorios. [19, 20]
Nuclear acumulación de β-catenina se ha informado en aproximadamente un tercio de los adenocarcinomas gástricos, ambos tipos intestinales y difusas. [18] β-catenina es una proteína kDa 92 que funciona directamente en la adhesión célula a célula. [21] Las mutaciones de β-catenina y la expresión aberrante de su proteína han sido implicados en la invasión tumoral y la metástasis. [22, 23] en nuestros resultados de IHC, β-catenina se localizó en el núcleo en la parte delantera invasivo de las células tumorales, pero no en la zona más central de los tumores primarios, en los que se localiza en la membrana plasmática . Estas observaciones también se pueden encontrar en muestras de tumores colorrectales. [24] Wnt activación /β-catenina en las células cancerosas de la parte frontal invasiva se ha postulado como un paso importante en el crecimiento del tumor y la progresión. [25]
Curiosamente, también encontramos β-catenina se encuentra en el núcleo de las células tumorales con los macrófagos ubicados de forma adyacente, lo que sugiere una posible relación entre los macrófagos y la translocación nuclear de β-catenina en las células tumorales. β-catenina en el frente invasivo de GC se explica en parte por las interacciones dentro del microambiente tumoral. Se confirmó
in vitro
que los macrófagos aumentan la capacidad de invasión de las células GC. Utilizando inmunofluorescencia microscopía confocal, se determinó la localización y acumulación de β-catenina en el núcleo en los macrófagos tratados. Por lo tanto, sospechamos que las citoquinas secretadas por macrófagos inducen β-catenina translocación nuclear en las células de GC, aumentando así su capacidad de invasión. El frente invasivo de tumores epiteliales representa un microambiente en el que los macrófagos interactúan con las células parenquimatosas mediante la producción de matriz extracelular y mediante la secreción de citocinas y factores de crecimiento que promueven localmente la proliferación celular y la invasión. [26, 27] Sin embargo, en nuestro estudio, el aumento de β-catenina expresión
in vitro
no alteró la proliferación, lo que indica que por sí mismo, no es suficiente para aumentar la malignidad del tumor. Este hallazgo también se demuestra anteriormente que β-catenina sólo promueve sitios de adhesión para formar focalmente y estimula la migración direccional y la invasión de células de cáncer de colon, pero no implicados en la proliferación de células de cáncer gástrico y de próstata. [28-30] Sin embargo, la célula estromal modulación paracrina de señalización Wnt en las células epiteliales es probable que coordinado por una red más compleja de la promoción y la inhibición de la secreción de factores. Los efectos aguas abajo de los diferentes niveles de señalización /β-catenina vía (y, en particular, que afecta a los proliferación celular, la EMT y la invasión local) son hasta el momento poco conocidos. β-catenina se transloca al núcleo donde se une a factores de transcripción del factor de factor de células T /linfocitos potenciador (TCF /LEF) la familia e inicia la transcripción de genes diana tales como
ciclina D1
,
c- myc
y
MMP-7
[31, 32] que participan en la proliferación, la invasión tumoral y la metástasis. [33, 34] Nuestros hallazgos sugieren que las vías de señalización a través del cual los macrófagos inducir la β-catenina también inducen la expresión de genes diana. De acuerdo con nuestro trabajo previo, [5] MMP-7 y CD44 fueron identificados dos matrices de PCR después de co-cultivo con macrófagos como los genes expresados diferencialmente asociados a la metástasis de las células de GC. La degradación de la matriz extracelular mediada por metaloproteinasas de la matriz (MMPs) es un mecanismo crucial durante la invasión tumoral y la metástasis. Tal degradación es necesario crear un microambiente que soporta el crecimiento de tumores primarios y metástasis. El complejo de β-catenina /TCF posteriormente activa un gran número de oncogenes, incluyendo VEGF, c-myc, c-jun, fra-1 y la gastrina, que también pueden estar involucrados en macrófagos activados β-catenina eventos aguas abajo. [35]
Una variedad de rutas probable que modulan la /β-catenina vía Wnt y la regulación de la señalización de β-catenina se pueden complicar de manera similar. Estudios recientes han encontrado que CM macrófago desencadena la vía de ERK y Wnt activa ERK en las células endoteliales. [36, 37] Aquí, encontramos que los macrófagos inducen la fosforilación de ERK y AKT tanto en las células de GC. Hemos demostrado que el tratamiento con un inhibidor de AKT pero no inhibidor de ERK translocación reduce β-catenina. Estos resultados indican que Akt juega un papel en la señalización de macrófago activado β-catenina en tipos de células gástricas.
Conclusiones
En conjunto, los datos clínicos sugieren que la infiltración de macrófagos se correlaciona con el aumento de grado y peor pronóstico para GC pacientes que fueron sometidos a resección radical. Los macrófagos pueden inducir la invasividad GC mediante la activación de la vía de β-catenina. En consecuencia, la supresión de la infiltración de macrófagos y supresión de la activación de la vía de β-catenina representan posibles estrategias para el tratamiento de GC.
información de apoyo
S1 Fig. . Efecto de la CM macrófagos sobre la vía β-catenina
β-catenina se acumula en el núcleo después del tratamiento con CM macrófagos durante 30 minutos en AGS y células MKN45
doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s001
(TIFF)
S2 Fig. Efecto de la CM de macrófagos en la expresión de la proteína de β-catenina genes corriente abajo de las células AGS y MKN45
doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s002 gratis (TIFF)
S3 Fig. (A) de macrófagos inducida CM AKT y la activación de ERK en las células N87. las células (B) N87 fueron pre-tratados con 10 M de los inhibidores de la β-catenina:. LY294002 o U0126 por 1 hora y luego cultivadas en presencia de CM macrófagos durante 1 hora adicional
AKT, ERK y β-catenina expresión de proteínas fueron determinados por Western blot
doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s003 gratis (TIFF)
S4 Fig. . La neutralización de anticuerpo contra TNF-α
células N87 en presencia de CM de macrófagos durante 24 horas se trataron previamente con o sin inhibidor de TNF-α por 1 hora
doi:. 10.1371 /journal.pone.0134122.s004 gratis (TIFF)