Extracto
macrófagos inhibitoria de citoquinas-1 (MIC-1 /GDF15), un miembro divergente de la superfamilia de TGF-β, se sobre-expresa por muchos tipos comunes de cáncer, incluyendo los de la próstata (CaP) y su expresión está ligada a los resultados del cáncer. Hemos evaluado el efecto de la sobreexpresión de MIC-1 /GDF15 en el desarrollo del CaP y extenderse en el modelo transgénico TRAMP de cáncer de próstata espontánea. TRAMP ratones fueron cruzadas con MIC-1 /GDF15 sobreexpresión de los ratones (MIC-1
FMS) para producir TRAMP singénico
fmsmic-1 ratones. La tasa de supervivencia, el tamaño del tumor de próstata, los grados histopatológicos y el alcance de una metástasis a distancia fueron comparados. La metástasis del TC1-T5, una línea de células TRAMP independiente de andrógenos que carece de MIC-1 de expresión /GDF15, se comparó mediante la inyección intravenosa en MIC-1
FMS y ratones C57BL /6 singénicos. Mientras que TRAMP
fmsmic-1 sobrevivieron en promedio de 7,4 semanas más, tenían tumores significativamente menores genitourinario (GU) y menores grados histopatológicos CaP que los ratones TRAMP, más de estos ratones desarrollaron metástasis a distancia. Además, se observó un mayor número de colonias tumorales de pulmón TC1-T5 en el MIC-1
ratones que FMS /6 ratones WT C57BL singénicos. Nuestros estudios sugieren fuertemente que el MIC-1 /GDF15 tiene acciones complejas sobre el comportamiento del tumor: se limita el crecimiento local del tumor, pero puede con el avance de la enfermedad, promover la metástasis. Como MIC-1 /GDF15 es inducida por todos los tratamientos contra el cáncer y la metástasis es la causa principal del fracaso y muertes por cáncer de tratamiento del cáncer, estos resultados, si se aplica a los seres humanos, pueden tener un impacto directo en la atención al paciente.
Visto : Husaini Y, Qiu MR, Lockwood GP, Luo XW, Shang P, Kuffner T, et al. (2012) inhibidora de macrófagos de citoquinas-1 (MIC-1 /GDF15) ralentiza el desarrollo del cáncer, pero aumenta metástasis en ratones propensos TRAMP de cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (8): e43833. doi: 10.1371 /journal.pone.0043833
Editor: Ming Tat Ling, Universidad de Tecnología de Queensland, Australia |
Recibido: 28 de abril de 2012; Aceptado: July 30, 2012; Publicado: 27 Agosto 2012
Copyright: © Husaini et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación de cáncer de próstata de Australia (http://www.prostate.org.au), Consejo de cáncer de Nueva Gales del Sur (http://www.cancercouncil.com.au/) y el Nacional de Salud y Medicina Consejo de Investigación de Australia (http://www.nhmrc.gov.au/). DAB es un compañero Nacional de Desarrollo de la Carrera del Consejo de Investigación Médica de Salud y Biomédica. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. DAB y SNB se nombran inventores de patentes propiedad de el Hospital de San Vicente que se refieren a la uso clínico de MIC-1 /GDF15 para ensayo de diagnóstico y terapia moduladora. Estas patentes se han licenciado a Novo Nordisk y Roche Diagnostics. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en http://www.plosone.org/static/policies.action#sharing.
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más comúnmente diagnosticado en los hombres después del cáncer de piel y es la segunda causa principal de muertes por cáncer en varones. En 2011, sólo en los EE.UU., hubo 240,890 nuevos casos de CaP y aproximadamente 33.720 muertes [1]. CaP, al igual que muchos tipos de cáncer, se caracteriza por la expresión alterada de citoquinas y factores de crecimiento. Una de estas citoquinas es MIC-1 /GDF15, un miembro divergente de factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) superfamilia [2] que se sobreexpresa por muchos pacientes con cánceres comunes, incluyendo los de la próstata y se puede inducir más por terapias contra el cáncer, incluyendo la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia del cáncer de mama [3] de próstata, colon y -. [9] las líneas de células
MIC-1 /GDF15 expresión de la proteína está marcadamente mejorada en tejidos de cáncer, y el cáncer . En cánceres, como el de la próstata, la principal fuente de MIC-1 /GDF15 es la propia célula epitelial maligno [5], [10], aunque también puede haber una contribución de las células del estroma del tumor [11] y los fagocitos infiltrantes [12]. Esta expresión tumor de MIC-1 /GDF15 se refleja a menudo en sus niveles en la sangre, que aumentan con el desarrollo y progresión del cáncer [5], [10], [13] - [27], por lo general en proporción a la fase y la extensión de la enfermedad . Por ejemplo, los niveles séricos aumentan progresivamente en los pacientes de lo normal, para pólipos colónicos de bajo grado, los pólipos de colon de alto grado, el cáncer de colon y cáncer de colon localizado finalmente diseminada [13]. Los pacientes con cáncer de colon que tienen niveles elevados en suero de MIC-1 /GDF15 tienen un peor pronóstico en general y de la recaída de la enfermedad anteriormente [13], [25]. Se han observado resultados similares en muchos otros tumores como el melanoma [28], [29] y el cáncer de páncreas [12], [19], [30], la tiroides [31], [32], ovario [26] y el endometrio [27]. En pacientes con cáncer de próstata, MIC-1 concentraciones /GDF15 suero predicen de forma independiente la metástasis ósea y la supervivencia global [14], [21].
En los pacientes con cánceres avanzados, los niveles de MIC-1 /GDF15 suero se levantan de un promedio en pacientes que no tienen cáncer de alrededor de 450 pg /ml [13] a un máximo de 10.000-100.000 pg /ml [5]. Debido a sus efectos en los centros de alimentación dentro del cerebro, la elevación de los niveles séricos de MIC-1 /GDF15 es una causa importante de cáncer asociado a la anorexia /caquexia [33]. La cantidad de MIC-1 /GDF15 presente en el suero de pacientes de cáncer es, en parte, depende de la proporción de MIC-1 /GDF15 localiza en el tumor en comparación con que se difunde en la circulación [34]. El procesamiento variable de los resultados MIC-1 /GDF15 en la secreción en una forma tanto sin procesar (con propéptido) y un procesado (sin propéptido) [34]. Como su dominio de propéptido se une a la matriz extracelular, sin procesar MIC-1 /GDF15 permanece localizada al estroma tumoral, mientras que la forma procesada se difunde rápidamente en la circulación [12], [34]. En el CP, una mayor cantidad de MIC-1 /GDF15 localizada al tumor mejora la evolución de los pacientes, especialmente en aquellos con una puntuación de Gleason de 6 o menos [34].
Aunque hay varias líneas de evidencia que vincula MIC-1 /GDF15 con el cáncer en los datos generales y PCA específicamente, convincentes y consistentes en su papel biológico en la patogénesis y progresión del cáncer es limitado [4]. La evidencia, en gran parte de
in vitro y experimentos de xenoinjertos
proporcionan resultados aparentemente contradictorios. La mayoría de estudios han sugerido que la MIC-1 /GDF15 tiene actividad contra el cáncer e induce la apoptosis de las células tumorales [35] - [38]. Por ejemplo, MIC-1 /GDF15 transfectadas HCT-116, células de cáncer colorrectal humanos expuestos aumento de la apoptosis basal, aumento de la respuesta a los fármacos anti-inflamatorios no esteroides y la reducción de agar clonación suave eficiencia [35]. La línea celular DU145 CaP, uno de los pocos que no expresa MIC-1 /GDF15, se somete a la apoptosis cuando son tratados
in vitro
con el MIC-1 /GDF15 [36].
En contradicción con la por encima de los datos, también hay evidencia de
in vitro
experimentos que el MIC-1 /GDF15 puede facilitar la progresión del tumor [39] - [42]. Por ejemplo, forzada MIC-1 /sobreexpresión o tratamiento con GDF15 recombinante purificada MIC-1 /GDF15 aumentó significativamente el
in vitro
invasión de líneas celulares de cáncer gástrico. Este fue mediada por un aumento de la uroquinasa de tipo activador del plasminógeno (uPA) y la activación de participar señal extracelular regulada quinasa-media (ERK-1/2) [16]. La sobreexpresión y desmontables experimentos en línea humana LNCaP-C33 andrógeno-dependiente de células CaP y su variante altamente metastásico, independiente de los andrógenos LNCaP-LN3 han demostrado que el MIC-1 /GDF15 puede promover la proliferación de receptor de andrógenos (AR
+) - células LNCaP positivas a través de la estimulación de la señal de vía de ERK-1/2 [20]. Por el contrario, otros no han sido capaces de identificar cualquier acción de MIC-1 /GDF15 en el
in vitro
proliferación de células LNCaP [36].
El
in vivo
actividad relacionada con el cáncer de MIC-1 /GDF15, también ha sido examinado en un número limitado de estudios de xenoinjertos de tumores. Forzada MIC-1 /GDF15 sobreexpresión en HCT-116 células de cáncer de colon, xenoinjerto en ratones desnudos, resultó en una reducción en el tamaño del tumor [35]. Una línea celular de glioblastoma, sin respuesta antiproliferativa de MIC-1 /GDF15
in vitro
, no logró crecer como un xenoinjerto de tumor en ratones desnudos cuando se transfectaron con el MIC-1 /GDF15 [43]. Por el contrario, siRNA derribo de MIC-1 /GDF15 en una línea celular de melanoma redujo significativamente el crecimiento de tumores xenoinjertados [28].
Debido MIC-1 /GDF15 es tan sobreexpresa frecuentemente y de forma sustancial en los cánceres, y porque los tratamientos contra el cáncer inducen MIC-1 de expresión /GDF15 tanto en cancerosas y no cancerosas tejidos, cualquier efecto sobre el comportamiento del tumor pueden ser de gran importancia clínica. Con el fin de obtener los datos más fiables sobre el papel general de MIC-1 /GDF15 en la biología del CP, y por analogía el cáncer en general, hemos utilizado
T
ransgenic
Un
denocarcinoma de
H ouse
P
rostate ratones propensos (TRAMP) de cáncer de próstata. TRAMP ratones expresan genes tempranos de SV40 (T y T; Tag) en el epitelio prostático bajo el control de probasina de rata (RPB) promotor [44]. ratones machos TRAMP heterocigota desarrollar cáncer de próstata progresiva que presenta el espectro de la enfermedad ya que se produce en los hombres que es invasivo y capaz de diseminación metastásica a sitios distantes, principalmente los ganglios linfáticos de la pelvis, el hígado, el riñón y los pulmones [45]. Cruzamos los ratones TRAMP con el MIC-1 /GDF15 sobreexpresión de los ratones (MIC-1
FMS) para producir ratones TRAMP que sobreexpresan MIC-1 /GDF15 (TRAMP
fmsmic-1). En MIC-1
FMS ratones expresión de MIC-1 /GDF15 es a partir de células mieloides (macrófagos, células dendríticas y neutrófilos), y es suficiente para aumentar sus niveles séricos en aproximadamente 10-90 veces [33]. Hemos comparado la tasa de supervivencia, patrón de crecimiento CaP y se extendió en TRAMP y TRAMP
fmsmic 1-ratones. Estos estudios demuestran que mientras TRAMP tumores
fmsmic 1-ratones han crecen más lentamente, aproximadamente 1/3 sobrevivir más tiempo y tienen tumores de grado más bajo, que se desarrollan mucho más metástasis. Por lo tanto, al igual que el TGF-β, MIC-1 /GDF15 tiene un efecto complejo sobre el comportamiento del tumor, inhibir el crecimiento tumoral local, pero la mejora de la diseminación metastásica.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Todos los procedimientos de investigación y cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité de Ética del Instituto Garvan /San Vicente hospital de Experimentación Animal (Ética No: 07/05 y 10/05) y estaban de acuerdo con el Código australiano de Prácticas para el Cuidado y uso de los animales para fines científicos.
los ratones transgénicos
Varón TRAMP ratones heterocigotos para el transgén PB-Tag, fueron generados por el apareamiento TRAMP
+/- hembras (C57BL /6 antecedentes) con C57BL no transgénico /6 machos. En los ratones TRAMP, la secuencia reguladora mínima probasina de rata (RPB) se dirige a SV40 del gen temprano (T y T; Tag) la expresión específica de epitelio prostático [44]. ratones singénicos que sobreexpresan MIC-1 /GDF15 bajo control de la célula mieloide promotor específico de c-fms (MIC-1
fms) se utilizaron para criar ratones TRAMP que también sobreexpresan MIC-1 /GDF15 (TRAMP
fmsmic-1 ). -1 MIC expresión /GDF15 el MIC-1
FMS ratones es a partir de células mieloides, pero es suficiente para aumentar también sus niveles séricos en aproximadamente 10-90 veces [33].
El doble transgénico TRAMP
-1 fmsmic ratones fueron generados por el cruce TRAMP
+/- hembras homocigotos con MIC-1
fms varones. El transgén PB-T de SV40 se identificó utilizando ADN extraído de muestras de cola y cebadores de PCR dirigidos a la secuencia de PB-SV40 T antígeno: Pb-forward: 5'-CCGGTCGACCGGAAGCTTCCACAAGTGCATTTA-3 'y SV40Tag-inverso: 5'-CTCCTTTCAAGACCTAGAAGGTCCA-3' . PCR se realizó usando mezcla de reacción y las condiciones descritas anteriormente [46]. El transgén MIC-1 /GDF15 en TRAMP
1-fmsmic ratones fue identificado por PCR utilizando cebadores, Bandera-forward: 5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3 'y MS8-inversa: 5'-CGAAGCCTACCGCGTGCACCGAG-3' y las condiciones de reacción: desnaturalización a 95 ° C durante 10 s, hibridación a 60 ° C durante 20 s, y la extensión a 72 ° C durante 30 s.
Survival Study
a partir del análisis de potencia estadística para la muestra tamaño, fmsmic-1 ratones TRAMP 35 y 35 TRAMP
se asignaron a las 4-6 semanas de edad, para un estudio de supervivencia. A partir de ese momento, los ratones se pesaron una vez por semana y monitoreados dos veces a la semana para el tamaño del tumor y la extensión mediante la palpación del abdomen. Los ratones murieron o fueron sacrificados cuando alcanzaron los puntos finales éticos de tumor mayor de 11 mm × 11 mm × 11 mm, la pérdida de peso superior al 20% o el cumplimiento de cualquier otro criterio de punto final éticos para la eutanasia. La supervivencia global de los ratones individuales se calculó desde el nacimiento hasta punto final ética o la muerte por tumor. distribución de supervivencia se estimó mediante el método de Kaplan-Meier. En la necropsia del complejo genitourinario (GU) que consta de próstata (incluyendo dorsal, ventral, laterales y lóbulos anteriores), la uretra, la glándula ampular, fue sacado de vesículas seminales (SV) y la vejiga urinaria y se pesaron. Peso de la GU, próstata, y SV de cada ratón se normalizó por su peso corporal (órgano peso /peso corporal).
Tamaño
Tumor primario
En una cohorte independiente a la anterior, GU y el crecimiento del tumor de próstata se comparó en TRAMP y TRAMP
fmsmic 1-ratones. Al inicio del estudio 60 TRAMP y 60 TRAMP
fmsmic 1-ratones, 15 de cada para cada etapa, se pre-asignado para ser sacrificados a diferentes puntos de tiempo desde la primera a las etapas avanzadas del tumor (8, 17, 25 y 33 semanas de edad). Un 3 ratones adicionales fueron asignados al vagabundo, de 33 semanas como grupo 3 de los ratones originales de este grupo murieron o llegaron a puntos finales éticos entre 23 y 33 semanas de edad. Para cada uno de los 60 ratones necropsia, la GU se escindió. GU Total, de próstata y el peso de la vesícula seminal se midió y registró dimensiones prostáticas. Todas las mediciones se normalizaron para el peso total del ratón donante cuerpo. Después de esto, se utilizó el tejido de la clasificación del tumor de próstata.
próstata Tumor clasificación
tejidos de la próstata a partir de 8, 17, 25 y 33 semanas de edad y VAGABUNDO VAGABUNDO
fmsmic 1-ratones anteriores , se colocaron en un casete y se fijaron en 10% de formalina tamponada neutral. Se tuvo cuidado de colocar e incrustar próstatas de todos los ratones en este experimento en la misma orientación. Las secciones fueron tomadas en 200
-
micras intervalos hasta que se agotó el tejido en el bloque. Las preparaciones fueron teñidas con hematoxilina y eosina y todas las secciones de cada animal fueron examinados mediante microscopía de luz, por un anatomopatólogo con experiencia en patología prostática. El histopatólogo fue cegado como con el genotipo de los ratones a partir de donde se originó el tumor. Las secciones de tejidos fueron clasificadas usando los criterios de Gingrich et al [47]. En pocas palabras, (
a
) epitelio normal se le asignó una puntuación de 1; (
B Opiniones) bajo grado de neoplasia intraepitelial prostática (PIN) con formación de nudos del epitelio y el aumento de núcleo a citoplasma se calificaron como 2; (
c
) PIN de alto grado con las estructuras cribiforme tomó nota y un aumento de la mitosis y /o cifras de apoptosis se anotó como 3; (
d
) adenocarcinoma bien diferenciado con la pérdida de espacios interductal y la invasión de las membranas basales se anotó como 4; (
e
) adenocarcinoma moderadamente diferenciado, con una pérdida total de lúmenes ductales con evidencia de adenocarcinoma se calificó como 5; y (
f
) adenocarcinoma pobremente diferenciado con láminas de células anaplásicos se anotó como 6. Cada sección de cada ratón se calificó y se estimó la proporción de la próstata afectada por cada grado. Los datos de todas las secciones de un ratón dado se combinaron para proporcionar una proporción media de la próstata afectada por cada grado del cáncer de próstata.
Identificación de las metástasis tumorales
Se estimó la incidencia de metástasis en el momento de la muerte o sacrificio en TRAMP grupo supervivencia y TRAMP
fmsmic 1-ratones. En la necropsia, los ganglios linfáticos pélvicos, los riñones, el hígado y los tumores de recto (si está presente) se cosecharon y se fijaron en formalina al 10% tamponada neutra. Los pulmones se extirparon, se pesaron y se fijaron en fijador de Bouin (Sigma-Aldrich) para visualizar y contar las colonias de tumores pulmonares. Las lesiones metastásicas en todos los órganos fueron contados bajo un microscopio de disección. Algunas de las lesiones fueron confirmadas por H & amp; E tinción y aún más por la inmunotinción de secciones de tejido congelado con anticuerpo anti Tag (Santa Cruz) para confirmar el origen prostático del tumor
Para garantizar la exactitud de los datos de metástasis obtenido. de los ratones del grupo de supervivencia, se analizó una cohorte adicional de vagabundo (n = 59) y TRAMP
(n = 33) ratones-1 fmsmic. En este grupo, se determinó el porcentaje de ratones con metástasis que murió entre 18-40 semanas, un periodo en el TRAMP y TRAMP
fmsmic 1-ratones llegan a los puntos finales éticos a la misma velocidad.
Evaluación de
MIC-1 /GDF15
expresión de QRT-PCR
MIC-1 /GDF15
expresión en próstatas de 8, 17 y 25 semanas vagabundo (n = 5) y TRAMP
fmsmic-1 (n = 5) los ratones se determinó mediante qRT-PCR y se normalizó a la expresión
B-actina gratis (gen de mantenimiento). Las muestras se recogen y se colocan inmediatamente en 1 ml de RNAlater (Qiagen) para el almacenamiento a -20 ° C hasta la extracción. El ARN se extrajo utilizando Trizol (Invitrogen) y Ambion Purelink RNA Mini Kit (Invitrogen) con el paso de DNasa en columna realizada usando ARN libre de DNasa Set (Qiagen). AMV transcriptasa (Roche Applied Sciences) inversa se utiliza para realizar la transcripción inversa en 2 g de ARN de cada muestra. Los cebadores específicos para la PCR para ratón
MIC-1 /GDF15
fuera, adelante: 5'-AGGACTCGATCAGAACCAAG-3 'y revertir: 5'-CGGTTGACGCGGAGTAGCA-3' y para
B-actina
Adelante fueron: 5'-TGACAGGATGCAGAAGGAGATTACTG-3 'y Reverso: 5'-CCACCGATCCACACAGAGTACTTG-3'. muestras de cDNA diluido (1:10) se sometieron a amplificación por PCR con MgCl 25 mM
2 (Roche Applied Sciences), Taq polimerasa (Roche Applied Sciences) y SYBR Green I colorante (Invitrogen). QRT-PCR se realizó en el instrumento LightCycler LC480 (Roche Applied Sciences). La mezcla de reacción se desnaturalizó a 95 ° C durante 10 s, seguido de 60 a 67 ° C de recocido durante 15 s, y extensión a 72 ° C durante 20 s. La especificidad de los productos se verificó mediante curvas generadas por la versión del software LightCycler 1.5 480 y por el tamaño del producto de PCR en geles de electroforesis de fusión. el número de copias de genes tanto para
MIC-1 /GDF15
y
B-actina
se calcularon al hacer las curvas de calibración generadas mediante la amplificación de diluciones seriadas
MIC-1 /GDF15
y
productos de PCR
B-actina. Los valores de Cp de las muestras se determinaron utilizando segunda cálculos derivados realizadas por LightCycler 480 versión de software 1.5.
MIC-1 /GDF15
número de copias se normalizaron a
B-actina
número de copias.
relativa
MIC-1 /GDF15
expresión en TC1- línea de células T5 también se estimó mediante qRT-PCR y comparación con la de TRAMP avanzada y TRAMP
tumores de próstata fmsmic-1. células TC1-T5 se cultivaron en placas de seis pocillos como abajo. ARN de las células TC1-T5 (n = 3) fue extraído por medio de RNeasy Mini Kit (Qiagen). ARN a partir de TRAMP (n = 3) y TRAMP
fmsmic-1 (n = 3) se extrajo de tumores de próstata como se describe anteriormente. RNA 2 ug de cada muestra fue a transcripción inversa y se somete a QRT-PCR utilizando el mismo procedimiento y
MIC-1 /GDF15
conjunto de cebadores que anteriormente.
TBP
se amplificó como un gen de mantenimiento usando conjunto de cebadores hacia adelante: 5'-ACCCTTCACCAATGACTCCTATG-3 'y revertir: 5'-ATGATGACTGCAGCAAATCGC-3'. La especificidad de los productos se verificó mediante curvas generadas por el software LightCycler 480 versión 1.5 y por tamaño en geles de electroforesis de fusión. proporción relativa de
MIC-1 /GDF15
a
TBP
Después se calculó utilizando el software LightCycler 480 Versión 1.5.
Estimación de TC1-T5 TRAMP tumores de pulmón
TRAMP C1 (TC1) es una línea de células de CaP andrógeno-dependiente derivado de tumor de próstata TRAMP por Foster et al. [48]. TC1-T5 es una sublínea independiente de andrógenos de la línea celular TC1 [49]. células TC1-T5 no expresan MIC-1 /GDF15 en cultivo y por tanto son adecuados para evaluar los efectos de MIC-1 /GDF15. células TC1-T5 se cultivaron en medio DMEM (Invitrogen, Life Technologies) que contiene 5% de carbón dextrano despojado de suero fetal de ternera y 125U /L de insulina (Humulina-BD Biosciences). Directamente a prueba si las células TC1-T5 serían más metastatizar en el MIC-1
ratones fms, inyectamos 5 × 10
5 células en un volumen total de 100 l a través de la vena de la cola de 9 semanas de edad MIC 1
fms (n = 17) y ratones singénicos C57BL /6 (n = 14). Diez semanas después, los ratones fueron sacrificados; sus pulmones se extirparon y se fijaron en fijador de Bouin (Sigma-Aldrich). colonias pulmonares en la superficie de todos los lóbulos de ambos pulmones se contaron bajo un microscopio de disección.
Análisis estadístico
Las evaluaciones estadísticas de todos los experimentos se realizaron con la versión de software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software , San Diego, CA, EE.UU.). Todos los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM). Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante desapareado
t
pruebas o test de Chi-cuadrado según el caso y los valores de p de dos colas informó. Las curvas de supervivencia se analizaron mediante análisis de Kaplan-Meier y se informa de estadística de log-rank. Para examinar la relación de la metástasis al tiempo de supervivencia se utilizó el análisis multivariante. Todos los factores asociados significativamente con la metástasis mediante regresión univariante se incluyeron en un modelo de regresión multivariante con el tiempo de supervivencia. Un valor de p menor de 0,05 considerado estadísticamente significativo.
Resultados
La sobreexpresión de MIC-1 /GDF15 prolonga la supervivencia de CaP en ratones TRAMP
Con el fin de evaluar los efectos de MIC -1 /GDF15 en la supervivencia global de los ratones TRAMP, que supervisa una cohorte de TRAMP y TRAMP
fmsmic 1-ratones hasta la muerte o el punto final ética. De Kaplan-Meier análisis de supervivencia mostró que el doble transgénico TRAMP
fmsmic-1 sobrevivieron significativamente más tiempo que los ratones TRAMP (Fig. 1A, p
= 0,0002
, log-rank test).
En general supervivencia de los ratones individuales desde el nacimiento hasta la muerte se muestra (panel a). Los datos de supervivencia para TRAMP (-▴-) y fmsmic 1-(-Δ-) ratones TRAMP
se representaron usando el método de Kaplan-Meier. se muestra la estadística de log-rank para el tiempo medio de supervivencia. El genitourinario (GU), vesícula seminal (SV) y la próstata tamaños tumorales en TRAMP
ratones fmsmic-1 y TRAMP (n = 15 /grupo) se sacrificaron a las 8, 17, 25 y 33 semanas de edad se muestran en el panel B , C y D. La GU (panel B), SV (grupo C) y el peso de la próstata (Panel D) se presentan como media de peso mg /g de peso corporal ± SEM. los valores de p se muestran como * p
& lt;
0,05; ** P
& lt;
0,01; *** P
& lt; 0,001
Inicialmente, tanto TRAMP y TRAMP
fmsmic 1-ratones murieron a un ritmo similar.. Sin embargo, después de unos 38-40 semanas, los ratones TRAMP empezaron a sucumbir más rápido que el vagabundo
fmsmic-1 ratones. El 50% de supervivencia de 40 semanas en ratones TRAMP se extendió a 51 semanas en el vagabundo
fmsmic-1 grupo. Además, mientras que sólo el 9,4% de los ratones TRAMP sobrevivió en la semana 50, el 52% de TRAMP
fmsmic-1 ratones estaban todavía vivos (fig. 1A). Por encima de todo, el tiempo medio de supervivencia para TRAMP
fmsmic-1 ratones fue de 47,4 semanas y fue de 41 semanas para los ratones TRAMP. Por lo tanto, en promedio, TRAMP
fmsmic-1 ratones sobrevivieron aproximadamente 7,4 semanas (~ 2 meses) más largos que los ratones TRAMP. Estos datos indican que el aumento de expresión de MIC-1 /GDF15 es capaz de mejorar sustancialmente la supervivencia relacionada con CaP en ratones TRAMP.
La sobreexpresión de MIC-1 /GDF15 Detiene Crecimiento CaP
Para evaluar directamente la impacto de MIC-1 /GDF15 en el crecimiento del cáncer de próstata, que asigna 60 TRAMP y 60 TRAMP
fmsmic 1-ratones a las 4-6 semanas de edad y sacrificados ellos progresivamente durante 8-33 semanas de edad. Las comparaciones se hicieron usando el 15 ratones pre-asignado a cada grupo en los cuatro puntos diferentes de tiempo (8, 17, 25 y 33 semanas), lo que representa muy temprano a las etapas avanzadas del tumor. Los datos de los ratones sacrificados en cada punto de tiempo indicado que TRAMP
fmsmic-1 ratones tenían significativamente más pequeños complejos de GU que los ratones TRAMP (Fig 1B.) En todas las etapas (p = 0,0004, p = 0,0005, P & lt; 0,0001 y p = 0,02, respectivamente).
Cuando la próstata y los pesos SV se analizaron por separado a partir del complejo GU, tamaños tumorales SV se redujeron significativamente en TRAMP
fmsmic-1 ratones en todos los puntos (Fig. 1C). Se observó un efecto similar, pero más variada, de MIC-1 /GDF15 sobreexpresión en el crecimiento del tumor de próstata (Fig. 1D). Había 17,0% y 26% de reducción en el peso del tumor de próstata en las semanas 8 y 25, respectivamente, en TRAMP
fmsmic-1 en comparación con los ratones TRAMP (p
=
0,04 y 0,01, respectivamente). Aunque hubo una reducción de peso del tumor en TRAMP
fmsmic-1 ratones a las 17 semanas (& gt; 10%), la diferencia entre los dos grupos no fue significativa. A los 33 semanas, aunque hubo una reducción del 55% en el peso medio de próstata en TRAMP
ratones en comparación con la de los ratones TRAMP 1 fmsmic-, la diferencia entre los dos grupos no fue significativa debido a la gran variación en el tamaño del tumor de próstata en el grupo de TRAMP. ratones adicionales necesarios para ser asignados a este grupo ya que muchos de los ratones asignados originalmente murieron /punto final ética alcanzado entre 23 y 33 semanas, lo que podría sesgar los resultados vagabundo, por la selección de los ratones TRAMP con tumores más pequeños. Estos ratones con tumores más pequeños tenían más probabilidades de sobrevivir a las 33 semanas de edad y ser seleccionado. Sin embargo, los datos sugieren, en consonancia con los datos de supervivencia de cohortes, que la sobreexpresión de MIC-1 /GDF15 disminuye el crecimiento del tumor.
TRAMP
fmsmic-1 ratones tienen cánceres de grado más bajo
Además a seguir el crecimiento del tumor, determinamos si MIC-1 /GDF15 también podría afectar el grado CP, mediante la comparación de las puntuaciones histopatológicas en VAGABUNDO VAGABUNDO y dobles transgénicos
tumores de próstata fmsmic-1. En la semana 8, bajo (grado 2) y alto (grado 3) grado PIN fueron las patologías dominantes en TRAMP y TRAMP
ratones fmsmic-1. Mientras que la proporción media de la próstata afectada por PIN fue mayor en comparación con VAGABUNDO VAGABUNDO
fmsmic-1 ratones; Sin embargo, esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Fig. 2A).
próstatas de 15 VAGABUNDO VAGABUNDO y 15
fmsmic-1 ratones fueron extirpados en la semana 8 (grupo A), 17 (panel B), 25 (panel C), y 33 (panel D). Las secciones seriadas se calificaron y anota para cada grado se promediaron para todos los ratones en el grupo. El gráfico representa la proporción media de la próstata de todos los ratones en el grupo que tiene cada uno diferente grado patológico, anotó entre 1 y 6 ± SEM. Los números en las barras muestran el número de ratones en el grupo que tiene un grado en particular. los valores de p se muestran como * p
& lt;
0,05; ** P
& lt;
0,01; *** P
& lt;.
0,001
En la semana 17, grado 2 y grado 3 patologías eran todavía dominante en las dos líneas de ratones pero de grado 4, 5 y 6 tumores comenzaron a aparecer en la próstata TRAMP. En este momento los ratones punto TRAMP tenían significativamente más Grado 3 de la enfermedad (p & lt; 0,0001) y significativamente menos enfermedad de grado 2 (p & lt; 0,0001). Que TRAMP
fmsmic 1-ratones que indican más rápida progresión del tumor (Fig. 2B)
a las 25 semanas de edad, grado 4 tumores fueron más prominentes en ratones TRAMP pero las regiones de grado 2 y grado 3 tumor todavía estaban presentes en ambas líneas de ratones. Comparación entre los grados tumorales individuales en el vagabundo y TRAMP
fmsmic-1 de próstata mostró que un porcentaje más alto del vagabundo
fmsmic-1 de próstata tenía los grados inferiores 2 y 3 tumores (p
= 0.004
y 0,02, respectivamente), mientras que un porcentaje significativamente menor de TRAMP
fmsmic-1 de próstata tenían la calificación más agresivos 4 tumores (Fig. 2C, p
=
0,019).
Por 33 semanas de edad (Fig. 2D), la mayoría de los ratones, en ambos grupos, tenía enfermedad avanzada y la diferencia en la distribución de los grados del tumor entre el vagabundo y TRAMP
fmsmic-1 ratones no fue significativa. Una vez más estos datos pueden haber sido influenciados por el sesgo de selección en el grupo TRAMP 33 semanas, se discutió anteriormente. Los ratones en el grupo de TRAMP con tumores más agresivos murió antes de 33 semanas de edad, y sólo ratones con el tumores menos agresivos sobrevivió a esta edad. En general, estos datos sugieren que TRAMP
fmsmic 1-ratones tienen una mayor proporción de la próstata en un grado del tumor menor que los ratones TRAMP (Fig. 2A, B, C y D), lo que indica la sobreexpresión MIC-1 /GDF15 ralentiza la evolución del tumor local.
TRAMP próstata Lacks MIC-1 /expresión GDF15
con el fin de descartar la posibilidad de que la expresión de MIC-1 /GDF15 por cáncer en los ratones TRAMP podría impactar sobre el tumor crecimiento y modificar diferencias entre ellos y ratones modificados para sobreexpresar esta citocina, que cuantifican la expresión /GDF15-1 MIC en los tumores de próstata y la vesícula seminal de TRAMP y TRAMP
fmsmic-1 ratones. Debido a la falta de disponibilidad de un ratón establecido MIC-1 /GDF15 ELISA y un ratón anti específica MIC-1 /GDF15 anticuerpo monoclonal, se utilizó QRT-PCR para comparar la expresión MIC-1 /GDF15 en TRAMP y TRAMP
fmsmic-1 próstata y tumores primarios. No era insignificante expresión /GDF15 MIC-1 en ratones TRAMP, que son de tipo salvaje para MIC-1 /GDF15, a las 8, 17 y 25 semanas de edad (Fig. 3A) y con tumores avanzados (Fig. 3B). Por el contrario TRAMP
fmsmic-1 ratones expresó 44-166 veces más MIC-1 /GDF15 (Fig. 3A) en la próstata que es consistente con c-fms impulsados expresión transgénica MIC-1 /GDF15 de la infiltración de células mieloides.
(a)
MIC-1 /GDF15
expresión se cuantificó mediante qRT-PCR en la próstata de TRAMP y TRAMP
fmsmic-1 ratones a las 8, 17 y 25 semanas y se normalizó para
expresión B-actina como se describe en materiales y métodos. (B) relativa
MIC-1 /GDF15
expresión se cuantificó mediante qRT-PCR en la línea celular TC1-T5 (n = 3) y se comparó con TRAMP (n = 3) y TRAMP
fmsmic- 1 (n = 3) tumor de próstata después de la normalización con
TBP
expresión. Los valores se presentan como media
MIC-1 /GDF15
expresión normalizada ± SEM. valores de p para la de dos colas no apareada
t
prueba se muestran como *** p
& lt;.
0,001
Mientras TRAMP
fmsmic-1 los ratones vivir más tiempo tienen más metástasis
Dado que la metástasis es la principal causa de muerte por tumores sólidos en pacientes con CaP, se evaluó el efecto de la MIC-1 /GDF15 sobre la incidencia y extensión de la metástasis en ratones TRAMP. Aunque TRAMP
fmsmic 1-ratones viven más tiempo y tienen más lento el crecimiento del tumor primario (Fig. 1 A, B, C y D), una proporción significativamente mayor de estos ratones demostraron órganos con metástasis. 15 de 30 (50%) TRAMP
fmsmic-1 ratones habían distante metástasis de órganos en comparación con 6 de 30 (20%) de los ratones TRAMP (Fig. 4A). Una proporción significativamente mayor de TRAMP
fmsmic-1 ratones tenían lesiones metastásicas macroscópicamente detectables en el hígado, el riñón y el recto. Mientras que la proporción de TRAMP
fmsmic-1 ratones con tumores pulmonares superficiales también se incrementó, esto no alcanzaron significación estadística (Fig. 4A). Curiosamente metástasis rectales desarrollaron en 6 de 30 TRAMP
fmsmic-1 pero no en ninguno de los ratones TRAMP (Fig. 4A).