Extracto
Las antraciclinas (como doxorrubicina o daunorrubicina) se encuentran entre los medicamentos contra el cáncer más eficaces, pero su utilidad se ve obstaculizada por el riesgo de cardiotoxicidad irreversible. Dexrazoxano (ICRF-187) es el agente cardioprotector única clínicamente aprobados contra la cardiotoxicidad de la antraciclina. Su actividad tradicionalmente se ha atribuido a los efectos quelantes del hierro de su metabolito con posterior protección del estrés oxidativo. Sin embargo, el dexrazoxano es también un inhibidor catalítico de la topoisomerasa II (TOP2). Por lo tanto, se examinó si el dexrazoxano y otros dos inhibidores catalíticos, es decir, TOP2 sobuzoxano (MST-16) y merbarona, protegen a los cardiomiocitos de la toxicidad antraciclina y se evaluaron sus efectos sobre la eficacia antineoplásica antraciclina. Dexrazoxano y otros dos inhibidores de TOP2 protegidas aisladas cardiomiocitos de rata neonatal contra la toxicidad inducida tanto por doxorrubicina y daunorrubicina. Sin embargo, ninguno de los inhibidores de TOP2 protegida significativamente cardiomiocitos en un modelo de lesión oxidativa de hidrógeno peróxido inducida. En contraste, los inhibidores catalíticos no comprometan los efectos antiproliferativos de las antraciclinas en la línea de células leucémicas HL-60; En su lugar, se observaron en su mayoría interacciones sinérgicas. Además, la activación de caspasa inducida por antraciclina se diferencialmente modulada por los inhibidores de TOP2 en las células cardíacas y de cáncer. Mientras que el dexrazoxano fue tras la hidrólisis capaz de iones de hierro lábiles intracelulares significativamente quelatos, este efecto no se observó, ya sea para sobuzoxano o merbarona. En conclusión, nuestros datos indican que el dexrazoxano puede proteger los cardiomiocitos
a través de
su actividad inhibidora TOP2 catalítica en lugar de la actividad de quelación de hierro. La expresión diferencial y /o regulación de las isoformas TOP2 en las células cardiacas y cáncer de inhibidores catalíticos pueden ser responsables de la modulación selectiva de la acción observada antraciclina
Visto:. Vávrová A, Jansová H, Mackova E, M Machacek, Haskova P, Tichotova L, et al. (2013) inhibidores catalíticos de la topoisomerasa II A diferencia modular la toxicidad de antraciclinas en cardiacos y el cáncer de células. PLoS ONE 8 (10): e76676. doi: 10.1371 /journal.pone.0076676
Editor: Rajesh Mohanraj, UAE University, Facultad de Medicina & amp; Ciencias de la Salud, Emiratos Árabes Unidos
Recibido: 23 de mayo de 2013; Aceptado: August 25, 2013; Publicado: 7 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Vávrová et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Checa (proyecto 13-15008S; www.gacr.cz), la Universidad Carolina de Praga (SVV proyecto 267 004; www.cuni.cz) y cofinanciado por el Fondo Social Europeo y el presupuesto del estado de la República Checa (proyecto sin CZ.1.07 /2.3.00 /30.0022;. www.msmt.cz). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
antraciclina (ANT) antibióticos, tales como doxorrubicina (DOX, Figura 1), daunorubicina (DAU, Figura 1) o epirubicina, se encuentran entre los componentes indispensables más eficaces y se utilizan con frecuencia agentes antineoplásicos y permanecer de protocolos de quimioterapia modernos para numerosas neoplasias hematológicas, así como tumores sólidos. Sin embargo, el riesgo de toxicidad irreversible y potencialmente fatal para el tejido cardíaco es el principal inconveniente de uso ANT en la práctica clínica [1].
Las antraciclinas doxorubicina (DOX) y la daunorrubicina (DAU) y la topoisomerasa II catalítica inhibidores dexrazoxano ( DEX), sobuzoxano (SOB) y merbarona (MER) se utilizaron en este estudio.
se han propuesto numerosas hipótesis acerca de los mecanismos que subyacen tanto los efectos antineoplásicos y cardiotóxicos de hormigas [2]. En la actualidad, la topoisomerasa II (TOP2) es generalmente reconocida como la diana molecular principal para la acción antitumoral ANT. ANTs pertenecen al grupo de "venenos TOP2", que consisten en agentes citotóxicos que estabilizan el "complejo escindible" [3]. En términos de cardiotoxicidad, el hierro (Fe) -catalysed producción intramiocárdica de especies de oxígeno reactivas (ROS) tradicionalmente se ha implicado. El anillo C de aglicona ANT experimenta fácilmente redox de la bicicleta, y los iones Fe puede formar complejos con actividad redox con las hormigas, lo que resulta en la formación de superóxido, peróxido y eventualmente muy reactivos y tóxicos radicales hidroxilo [4], [5].
Esta hipótesis tradicional "ROS y Fe" de cardiotoxicidad inducida ANT ha sido reforzada por la eficacia protectora del dexrazoxano (DEX, ICRF-187, Figura 1), que es la única cardioprotector aprobado clínicamente. Los efectos cardioprotectores de DEX se han atribuido a su producto de hidrólisis ADR-925, muy similar a la conocida EDTA quelante de metal. Tras el metabolismo de DEX en ADR-925, este producto puede quelar libre y redox-activo intracelular Fe y /o reemplazar Fe en ANT-Fe complejos, evitando así hidroxilo formación y el daño oxidativo radical de sitio específico para el tejido cardíaco [6].
sin embargo, DEX también es un inhibidor catalítico establecida de TOP2 [7], y por lo tanto, no puede descartarse que DEX puede ejercer efectos protectores a través de la interferencia con el envenenamiento TOP2 ANT-inducida en el corazón [8], [9]. De hecho, un estudio reciente informó que la supresión de la isoforma beta TOP2 (
TOP2B
gen) cardiomiocitos protegidas de ADN de doble filamento se rompe y los cambios inducidos por el transcriptoma aguda en vivo del tratamiento DOX, con la posterior prevención de la biogénesis mitocondrial defectuoso y la formación de ROS. Además, la supresión de los cardiomiocitos-específica de la
protegida gen TOP2B
ratones del desarrollo de la insuficiencia cardíaca progresiva inducida por el tratamiento DOX repetido, lo que sugiere que la cardiotoxicidad inducida por DOX está mediada principalmente por los cardiomiocitos TOP2B [10].
Preguntas que surgen de estos estudios previos nos animaron a investigar la participación de TOP2 en la cardiotoxicidad ANT y para evaluar otros inhibidores catalíticos TOP2 como cardioprotectores potenciales. En este estudio, el uso de cultivos primarios de cardiomiocitos ventriculares neonatales de rata aislados (NVCMs), se examinaron los efectos protectores de la DEX y otros dos inhibidores catalíticos de TOP2, sobuzoxano (SOB, MST-16, Figura 1) y merbarona (MER, la Figura 1 ), contra la cardiotoxicidad inducida por DAU y DOX. Para comparación, también se investigaron los efectos de estos agentes en un modelo de H
2O
2 inducida por la lesión oxidativa de los cardiomiocitos. Además, se utilizó la línea celular leucémica HL-60 para evaluar si los inhibidores catalíticos TOP2 pueden afectar cardiotoxicidad ANT sin comprometer su eficacia antiproliferativa contra las células cancerosas leucémicas.
Materiales y Métodos
1. Materiales
medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), DMEM con la mezcla de nutrientes F-12 (DMEM /F12), suero de caballo (HS), suero bovino fetal (FBS), solución de penicilina /estreptomicina (5000 U /ml ; P /S) y una solución de piruvato de sodio (100 mM; PYR) fueron adquiridos de Lonza (Bélgica). Los sueros fueron inactivadas por calor antes de su uso. DEX se obtuvo de huaren Químicos (Chang-Zhou, China). medio RPMI-1640 con L-glutamina y NaHCO
3, el ácido láctico, la nicotinamida adenina dinucleótido (NAD
+), MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro, SOB, MER, dimetilsulfóxido y 4- (2-hidroxietil) -1- ácido piperazinaetanosulfónico (HEPES) fueron adquiridos de Sigma (República Checa) y otros productos químicos (por ejemplo, componentes de diversos tampones) de Penta (República Checa) y eran de la más alta disponible farmacéutica o grado analítico. el dimetilsulfóxido se utilizó para disolver DEX, SOB y MER. de plástico para el cultivo celular se obtuvo de TPP (Suiza).
2. aislamiento de los cardiomiocitos y las evaluaciones de toxicidad
Todos los procedimientos con animales y la preparación de NVCMs fueron aprobados y supervisados por el Comité de Cuidado de animales de la Universidad Carolina. se prepararon cultivos primarios de NVCMs de 2 días de edad ratas Wistar. los animales fueron anestesiados con CO
2, y decapitado. los cofres fueron abiertos y los corazones se recogieron en un Ca enfriado con hielo
2 + exento de tampón, que contenía NaCl 116 mM, KCl 5,3 mM, 1,2 mM MgSO
4, NaH 1,13 mM
2 PO
mM de glucosa 4, 5 y HEPES 20 mM (pH 7,40). Los ventrículos se picaron a fondo y en serie a digestión con una mezcla de colagenasa (0,25 mg /ml; Invitrogen, EE.UU.) y pancreatina (0,4 mg /ml; Sigma) solución a 37 ° C. La suspensión celular se colocó en una grande (15 cm) placa de Petri (aprox. 20 corazones por placa) y se dejó durante 2 horas a 37 ° C para separar los miocitos (que flotan en el medio) de los fibroblastos (unidas a la placa). Se recogió la suspensión de miocitos ricos y las células viables se contaron usando exclusión de azul de tripano. El procedimiento de aislamiento dio como resultado una monocapa celular confluente con ~ 90% de los cardiomiocitos batiendo sincrónicamente. Para evaluar la citotoxicidad, la morfología celular y la actividad de caspasa, las células se sembraron en placas de 12 pocillos pre-recubiertas con 1% de gelatina a una densidad de 0,8 millones de células por pocillo. Para medir el contenido de glutatión, las células se sembraron en placas de 60 mm placas de Petri a una densidad de 4,8 millones de células por placa. NVCMs se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO
2 en el DMEM /F12 suplementado con 10% hs, 5% de FBS, 4% PYR y 1% P /S. Recién aisladas NVCMs se dejaron durante 40 h, a continuación, el medio se cambió a DMEM /F12 suplementado con FBS al 5%, 4% PYR y 1% P /S. El medio se reemplazó una vez más después de otras 24 h. Todos los experimentos se iniciaron en el cuarto día después del aislamiento. El uso de suero y medio PYR-libre, NVCMs se incubaron a 37 ° C con los agentes probados, ya sea solos o en combinación. La actividad de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada de los cardiomiocitos se determinó en medio de cultivo celular como un marcador estándar de la citotoxicidad y la ruptura celular utilizando un método espectrofotométrico bien establecida; en nuestros estudios anteriores, este método correlaciona bien con liberación de troponinas-cardio específica T e I [11]. La actividad de LDH liberada de cardiomiocitos se expresó como el porcentaje de LDH celular total como se mide después de la lisis celular para 15 min (fosfato de potasio 0,1 M, 1% de Triton X-100, DTT 1 mM [(-) -1,4-ditio -L-treitol], EDTA 2 mM, pH 7,8) a temperatura ambiente. Todas las muestras se congelaron inmediatamente y se mantienen en -80 ° C antes de la medición. La actividad de LDH se ensayó en tampón Tris-HCl (100 mM, pH 8,9) que contiene 35 mM de ácido láctico y 5 mM de NAD
+. La tasa de NAD
+ reducción fue supervisado por espectrofotometría a 340 nm durante 2 minutos. La pendiente de la región lineal y coeficiente de absorción molar e = 6.22 * 10
3 M /cm se utilizó para el cálculo de la actividad LDH y los datos se expresan como el porcentaje de la cantidad total de LDH.
Los cambios en la morfología celular se documentaron utilizando un Eclipse TS100 microscopio invertido de epifluorescencia (Nikon, Japón), y el programa NIS-Elements AR 2,20 (Laboratorio de Imagen, República Checa). Para visualizar la mitocondria activa, las células se cargaron con 0,5 M de JC-1 (Molecular Probes /Invitrogen, EE.UU.) durante 30 min a 37 ° C. A bajas concentraciones, JC-1 existe dentro de las células en una forma monomérica fluorescente verde y se acumula en las mitocondrias que respiran activamente. Hay JC-1 monómeros agregados membrana impulsados por diferencia de potencial (ΔΨ
m) entre la membrana mitocondrial interna y externa existente. Este ΔΨ
formación m-dependiente de la "J-agregados" está representado por un golpe de cambio de verde a fluorescencia roja.
3. estudios de proliferación
La línea celular HL-60, derivada de un paciente con leucemia promielocítica aguda [12], se adquirió de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y 1% P /S en 75 cm-
2 matraces de cultivo de tejido) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. Para los ensayos de proliferación, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 10.000 células por pocillo. Los estudios de combinación fueron diseñados de acuerdo con el Chou - método de Talalay [13]. Brevemente, se determinaron primero las concentraciones de quelantes que inducen disminución del 50% de proliferación (IC
50) de todas las sustancias individuales. Entonces, tanto las sustancias individuales y las mezclas de combinación se ensayaron a concentraciones correspondientes a varias fracciones y múltiplos. (1/8; 1/4; 1/2; 1; 2; 4) de sus individuales IC
50 valores
la proliferación celular se evaluó mediante un ensayo de viabilidad basado en la capacidad de las mitocondrias activas para cambiar de color amarillo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenyltetrazolium bromuro de tetrazol (MTT; Sigma) a púrpura formazan según brevemente, /ml MTT solución en salina tamponada con fosfato se añadieron 25 l de 3 mg al medio de cultivo las instrucciones del fabricante (100 l) y después de 2 h de incubación en 37 ° C las células se lisaron con tampón de lisis (isopropanol , 0,1 M HCl, 10% de Triton X-100) durante 30 min a temperatura ambiente. Después de disolver, se midió la densidad óptica de MTT soluble usando un lector de placas Tecan M Infinito 200 en λ = 570 nm, restando el λ = 690 nm fondo. Las tasas de proliferación de los grupos experimentales se expresaron como porcentajes de los controles no tratados (100%).
4. Evaluación de la actividad de la caspasa
Las actividades de caspasas 3/7, 8 y 9 se determinaron utilizando un kit disponible comercialmente (caspasa Glo ensayos, Promega, USA), basado en la capacidad de las caspasas para escindir secuencias de aminoácidos específicos presentes en un sustrato para la luciferasa. caspasas actividades fueron determinados en relación con el contenido de proteínas, que se evaluó utilizando el método del ácido bicinconınico de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sigma). Los lisados se diluyeron a concentraciones iguales de proteína.
5. Determinación de total y glutatión oxidado
NVCMs se lavaron con PBS (2 x 2,5 ml, 4 ° C), se recogieron con un raspador de células, y se centrifugaron (10 min a 700 x g, 4 ° C), y el sedimento se resuspendió en 250 l de 4 ° C ácido sulfosalicílico frío (Sigma) y después se sometió a ultrasonidos en hielo durante 10 s (Bandelin Sonoplus, Bandelin Instruments, Alemania). Las muestras se centrifugaron a continuación durante 15 minutos a 18.000 x g, y los sobrenadantes se utilizaron para determinar la cantidad de glutatión reducido y oxidado (GSH /GSSG) de acuerdo con Tietze [14] utilizando el método de reciclaje enzimática con 5,5'-ditio bis (2-nitrobenzoico) (Sigma) y la reductasa de GSH (Sigma) en un formato de microplacas. La velocidad de formación de ácido 2-nitro-5-mercaptobenzoico se registró a 405 nm durante 2 min y la pendiente se comparó con la de la curva estándar de glutatión oxidado (GSSG). La concentración de glutatión total (GSH + GSSG) se calculó utilizando el método de regresión lineal, se corrigieron los resultados para el contenido de proteína y se expresaron como un porcentaje de la glutatión total en una muestra de control (100%). contenido de GSSG en la muestra se determinó después de la derivatización de GSH con 2-vinilpiridina (Sigma). Se corrigieron los resultados para el contenido de proteína determinada por espectrofotometría utilizando el método del ácido bicinconınico de acuerdo con el protocolo del fabricante (Sigma).
6. La citometría de flujo El análisis del ciclo celular
Después de la incubación, las células HL60 se centrifugaron a 300 x g, se lavaron en PBS con 5% FBS (PBS + FBS) y se suspendieron en una pequeña cantidad de PBS + FBS. Después, se añadió enfriado con hielo 70% de etanol, gota a gota, y se fijaron las células durante 3 horas a - 20 ° C. Después de la fijación, el etanol se eliminó por centrifugación; las células se lavaron en PBS + FBS y se suspendieron en citrato de sodio 4 mM en PBS + FBS. Finalmente, las células se incubaron con 200 mg /ml de ARNasa A (Sigma) y 30 mg /ml de yoduro de propidio (PI) durante 20 min a 37 ° C. Las células se analizaron usando un citómetro de flujo Accuri C6 (Accuri Citómetros Europe Ltd., Reino Unido) como se describe anteriormente [15]. PI se excitó a 488 nm, y la fluorescencia se analizó a 585 nm (FL-2). Por análisis, se recogieron 10.000 acontecimientos. El análisis del ciclo celular se evaluó mediante ciclos múltiples de software AV (Phoenix Flow Systems, EE.UU.). cifras del ciclo celular fueron creados con el software Cyflogic (CyFlo Ltd, Finlandia).
7. ensayo de calceína-AM para las determinaciones de intracelular Fe-quelante propiedades
Los experimentos que analizan las eficiencias intracelulares Fe-quelantes de los agentes examinados se realizaron según Glickstein et al. [16] con modificaciones menores. La línea celular H9c2 derivada de tejido de corazón de rata embrionario [17] se adquirió de la American Type Culture Collection (U.S.A.). Las células se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS, 1% P /S y HEPES 10 mM en 75 cm
2 frascos de cultivo de tejidos a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2. células subconfluentes se subcultivaron cada 3-4 días. H9c2 células se sembraron en placas de 96 pocillos (10.000 células por pocillo) y se dejaron durante 24 h a adjuntar. Después, el medio de cultivo fue reemplazado con DMEM sin suero y libre de piruvato. Después de 24 h de privación de suero, las células fueron esencialmente no proliferación, y se utilizaron para los experimentos. Las células se cargaron con 100 mM de citrato férrico de amonio (FAC) en medio libre de suero 24 h antes del experimento. Después, las células se lavaron, y para evitar interferencias potenciales (especialmente con respecto a diversos elementos traza) el medio se reemplazó con un tampón preparado a partir de agua filtrada-Millipore (desmineralizada), que contiene NaCl 116 mM, KCl 5,3 mM, CaCl 1
2, MgSO 1,2 mM
4, NaH 1,13 mM
2 PO
4, glucosa 5 mM y HEPES 20 mM (pH 7,4). Las células se cargaron luego durante 30 min a 37 ° C con éster de acetoximetilo de células permeable 1 M de verde de calceína (Molecular Probes /KRD, República Checa), y se lavan. esterasas celulares escinden los grupos acetoximetilo para hacer que la celda de membrana impermeable verde calceína, que la fluorescencia se inactivó mediante FAC. fluorescencia intracelular (λ
ex = 488 nm; λ
em = 530 nm) fue seguido por 24 horas a 37 ° C usando un lector de placa de Infinito 200 M (Tecan, Austria). DEX, SOB y MER se compararon con la fuerte SIH lipófilo quelante Fe que se utilizó como agente de referencia.
8. Análisis de los datos
Todos los datos se presentan como las medias ± SD. Los datos fueron sometidos a una vía o de dos vías ANOVA con post-test de Dunnett utilizando GraphPad Prism 5.00 (GraphPad Software, California, EE.UU.) con P £ 0,05 como nivel de significación. Todas las mediciones se llevaron a cabo en más de cuatro experimentos independientes. IC
50 valores (concentración de agentes que inducen una disminución de la proliferación del 50% en comparación con los controles no tratados), así como valores de índice de combinación (
IC
-a medida cuantitativa del grado de interacción fármaco) se calcularon utilizando Calcusyn 2.0 del software (Biosoft, Cambridge, Reino Unido)
el IC
50 valores (concentración de agentes inductores 50% de disminución en la proliferación en comparación con los controles no tratados o la dosis del efecto mediano) se calcularon de la siguiente manera:.
Donde
F
a
es la fracción afectada (inhibió la proliferación) por un tratamiento farmacológico;
F
u
es la fracción desinhibida;
D
x
es la dosis de un fármaco;
D
m
es la mediana de la dosis del efecto (IC
50) y m es la pendiente de la curva. Este último software también se utilizó para obtener el índice de combinación (
IC
): una rigurosa medida cuantitativa del grado de interacción de fármacos:
Donde
D
a
y
D
b ¿Cuáles son las dosis de los fármacos utilizados en combinación, mientras que
D
xa
y
D
xb ¿Cuáles son las dosis isoeffective. Chou y Talalay describen las interacciones entre medicamentos en términos de efecto casi aditivo (
IC
0,9 - 1,1), leve sinergismo (
IC
0.85 - 0,90), la sinergia moderada (
CI
0,7 - 0,85), sinergismo (
IC
0,3 - 0,7), fuerte sinergismo (
IC
0,1 - 0,3), muy fuerte sinergismo (
IC Hotel & lt; 0,1) , ligero antagonismo (
IC
1.1 a 1.2), el antagonismo moderado (
IC
1.20 - 1.45), el antagonismo (
IC
1.45 - 3.3), un fuerte antagonismo (
IC
3.3 - 10) o muy fuerte antagonismo (
IC Hotel & gt; 10). Además, para evaluar los cambios en las interacciones fármaco-fármaco como una función de la concentración o actividad, afecto fraccional (
F
a
) - índice de combinación (
CI)
parcelas se calcularon utilizando las simulaciones por ordenador. Calcusyn
1. En estudios in vitro cardiotoxicidad
En primer lugar, los efectos cardiotóxicos de las hormigas y las intervenciones de protección potenciales se evaluaron utilizando un protocolo previamente publicado [18] que consiste en una exposición de 3 h de NVCMs a DAU o DOX, seguido de lavados para eliminar Las hormigas y la incubación de los miocitos en medio libre de ANT; Se determinó la lesión celular usando un ensayo de liberación de LDH. Como se observa en la Figura 2A-B, la exposición de los cardiomiocitos aislados a DAU o DOX durante 3 h, seguido de un período de lavado de 48-h condujo a una pérdida estadísticamente significativa de la viabilidad (determinada como el porcentaje de liberación total LDH) que van desde ~ 20 % a 0,6 M durante dos hormigas para ~55% a 2,0 mM. Pre-incubación de las células con 10, 100 y 1000 DEX mu M durante 3 h inducidas protección significativa de la toxicidad de ambas ANTs en concentraciones de hasta 1,2 M (DAU) y 1,4 M (DOX). Este efecto no parece ser dependiente de la dosis, como en la mayoría de los experimentos de los 10 mM y 100 mM concentraciones de DEX ofrecen mejor protección que 1,000 M (Figura 2A-B). En cardiomiocitos expuestos al agente de inducción de estrés oxidativo H
2O
2, la toxicidad que van desde ~36% a 200 M a ~ 50% en 500 mM H
2O se detectó
2. Sin embargo, ninguna protección significativa contra H
2O la toxicidad inducida por 2
se encontró con cualquier concentración ensayada de DEX (Figura 2C). Para más exámenes, 1,2 M DAU o DOX se eligieron, como en esta concentración ambas ANTs causaron toxicidad significativa prevenible mediante la preincubación de DEX. En consecuencia, 300 M H
2O
2 fue elegido para la comparación, ya que esta concentración provocó toxicidad comparable a 1,2 M de DAU o DOX. De los tres inhibidores catalíticos TOP2 utilizados en este estudio, DEX (10 a 1.000 M) y SOB (en concentraciones de hasta su límite de solubilidad de 300 mu M) no causó ninguna pérdida significativa de viabilidad NVCM. Por el contrario, MER exhibió una toxicidad significativa a concentraciones ≥ 60 mM (Figura 3D). DEX, SOB y MER se compararon por su potencial cardioprotector a una concentración de 30 m, es decir, la concentración más alta a la que ninguno de los fármacos indujo su propia toxicidad. Todos los tres inhibidores catalíticos TOP2 fueron capaces de proteger parcialmente pero significativamente NVCMs contra DAU 1,2 M o DOX con ~ 10 - reducción de la toxicidad 15% en comparación con DAU o DOX toxicidad solo, pero los inhibidores de TOP2 no tuvo ningún efecto significativo sobre la toxicidad causada por 300 M h
2O
2 (Figura 3A-C).
Las células se pre-incubaron con tres concentraciones de dexrazoxano para 3 h y luego se co-incubaron con concentraciones crecientes de las antraciclinas daunorrubicina (DAU, a) o doxorrubicina (DOX, B) durante 3 horas después de un período libre de antraciclina de 48 h o durante 48 horas con h
2O
2 (C). La toxicidad se evaluó como el% de lactato deshidrogenasa total (LDH) liberada de los cardiomiocitos en el medio de cultivo celular. Los datos obtenidos de ≥ 4 experimentos independientes se expresan como la media ± desviación estándar, la significación estadística: c - en comparación con el control sin drogas (DMSO); d - en comparación con DAU o DOX; p -. en comparación con H
2O
2 (ANOVA de una vía con el post-test de Dunnett, P £ 0,05) guía empresas
cardiomiocitos de ratas neonatales fueron pre-incubadas con dexrazoxano (DEX) , sobuzoxano (SOB) o merbarona (MER) para 3 h y después se incubaron con antraciclinas daunorrubicina (DAU, a) o doxorrubicina (DOX, B) de 3 h después de un período libre de antraciclina 48-h o de 48 h con peróxido de hidrógeno (H
2O
2, C). DEX, SOB y MER toxicidad individual después de 48 h de incubación se muestra en el panel D. Efectos de DEX tratamiento previo durante 3 h con una incubación de 3 h DAU y el posterior período libre de DAU 48 h en celular oxidado y reducido contenido de glutatión se indica en el grupo E. los datos obtenidos a partir de ≥ 4 experimentos independientes se expresan como la media ± desviación estándar, la significación estadística: c - en comparación con el control; d - en comparación con DAU o DOX (ANOVA de una vía con el post-test de Dunnett, P £ 0,05) guía empresas
Como se observa en la Figura 3E, la incubación de NVCMs con DAU 1,2 M durante 3 h seguido. a las 48 h en medio DAU-libre no dio lugar a un aumento estadísticamente significativo en ninguno de GSH o GSSG, a pesar de la significativa toxicidad causada por este programa de la concentración y la incubación. La pre-incubación de los cardiomiocitos con 30 DEX mu M durante 3 h seguido de co-incubación con DAU mostró un incremento de tendencia insignificante en GSH, pero esto ocurrió en la ausencia de cambios en GSSG. El control de incubación con DEX solo no induce ninguna diferencia significativa entre los valores de control, ya sea para GSH o GSSG (Figura 3E).
Una exposición de tres horas de NVCMs a DAU 1,2 M o DOX causó un marcado cambio en la morfología de los cardiomiocitos , incluyendo vacuolización citoplásmica y granulación, que procedió a la interrupción de la monocapa celular y la contracción celular y nuclear. Los cardiomiocitos se tiñeron con la sonda JC-1, y su señal se visualizó por microscopía de fluorescencia. Tras la exposición a DAU o DOX, hubo una transición visible de las mitocondrias teñidas de rojo normales con membranas internas polarizadas para fluorescencia verde difusa que indica las células que mueren con mitocondrias despolarizadas. Pre-incubación con DEX 30 M, SOB y, en menor medida, MER, parcialmente impedirá que los dos cambios ANT-inducida en la morfología celular, así como la disipación de la membrana mitocondrial interna potencial (Figura S1).
2. estudios de proliferación
Después de la incubación durante 72 h, todas las sustancias examinadas tenían efectos antiproliferativos significativos y dependiente de la dosis en las células HL-60. Las hormigas (DAU y DOX) fueron eficaces en concentraciones que eran tres órdenes de magnitud menor que los inhibidores catalíticos; la IC valores
50 para todos los fármacos fueron los siguientes: 19 nM para DAU, 38 nM para DOX, 25 M de DEX, 48 mM de SOB y 38 mM para MER. agentes individuales y combinaciones de las hormigas y los inhibidores catalíticos TOP2 A continuación se incubaron durante 72 horas a concentraciones correspondientes a sus IC
50 valores, y sus interacciones se analizaron de acuerdo con el método de Chou-Talalay. Además, como las interacciones fármaco-fármaco pueden cambiar en función de la concentración o actividad, que también examinó combinaciones de quelantes y medicamentos contra el cáncer en fracciones y múltiplos (1/8; 1/4; 1/2; 1; 2; 4) de su CI
50 valores, y la fracción afectada (
Fa
) - índice de combinación (
CI)
parcelas se calcularon utilizando simulaciones por ordenador (Figura 4). datos de proliferación se muestran en los paneles A y B en las figuras S2-S4, y el índice de combinación (
CI)
valores calculados se resumen en las Tablas S1-S3. Estos análisis revelaron que la DEX, SOB y MER potenciaron los efectos antiproliferativos de tanto DAU y DOX cuando estas sustancias se co-incubaron simultáneamente, como el correspondiente
valores de CI
varió de moderado a fuerte sinergismo.
Las células se incubaron de forma continua con dexrazoxano (DEX, a), sobuzoxano (SOB, B) o merbarona (MER, C) y la daunorrubicina (DAU) o doxorrubicina (DOX) durante 72 h o pre-incubaron con DEX (a), SOB (B) o MER (C) durante 3 h o 6 h y después se incubaron durante 72 h con todos los fármacos en concentraciones correspondientes a sus IC
50 valores y IC
50 fracciones y múltiplos (1/8; 1 /4; 1/2; 1; 2; 4). Alternativamente, las células fueron o bien co-incubaron durante 72 h o pre-incubadas con DEX durante 3 h y luego se co-incubaron con DAU para 72 h en una proporción de 01:20 DAU: DEX (A). Las simulaciones por ordenador de índice de combinación (
IC
) - proliferación celular (fracción afectada -
Fa
). dependencias se obtuvieron usando el software Calcusyn 2.0
En otra serie de experimentos, DEX, SOB y MER se pre-incubaron durante 3 o 6 h antes de la adición de DAU con un 72-h co-tratamiento subsiguiente (paneles C y D en las figuras S2-S4, Tablas S1-S3). Como se observa en estas figuras y tablas, estas combinaciones de fármacos se mantuvieron sinérgica con la excepción de las combinaciones de DAU con DEX en su concentración más alta; en este caso, los
CI
valores fueron aditivos o en un caso raro moderadamente antagónica. Además, aparte de el diseño del estudio combinación estándar Chou-Talalay (donde se aplican los agentes a dosis equipotentes), DAU y DEX fueron también examinadas usando la relación de concentración 1:20 fijo utilizado en la práctica clínica [19]. Si bien se detectó sinergismo bastante menos pronunciado para concentraciones más bajas, aquí, no se produjo ningún antagonismo, incluso después de la preincubación con DEX durante 3 h, y en esta configuración, todas las concentraciones de DEX potenció la actividad antiproliferativa de DAU hacia las células HL-60 (Figura S2E- F, el cuadro S1).
3. Los ensayos de actividad caspasa
Las combinaciones de las hormigas y los inhibidores catalíticos TOP2 También se examinaron para determinar su capacidad para activar las caspasas, que son los principales mediadores de la apoptosis. La incubación de NVCMs con 1,2 DAU mu M durante 3 horas, seguido de 48 h de período DAU-libres causados activación significativa de las caspasas 8 y 9, que son la extrínseca clave (mediada por el receptor) y intrínseca (mitocondrial) iniciadores vía apoptótica, respectivamente, como se así como la ejecución caspasas 3/7 a ~ 200% de los valores de control. La incubación con 30 mM concentraciones de los tres inhibidores catalíticos TOP2 no causó ningún incremento significativo en la actividad de cualquiera de caspasa, pero DEX y SOB cardiomiocitos protegidas significativamente contra la activación de la caspasa por DAU. Aunque MER pre-tratamiento también mostró una tendencia a la disminución de la activación de todas las caspasas, esto no alcanzó significación estadística en comparación con el grupo DAU. Consistente con los resultados del ensayo de fuga de LDH, la activación de caspasas después de la incubación con DOX era generalmente menos pronunciada que después de la incubación DAU. La activación tanto de las caspasas de iniciación fue insignificante en comparación con el control (Figura 5E-F), aunque no había un ligero aumento. En general, la preincubación de las células con DEX, SOB o MER no cambió significativamente la activación de caspasas de iniciación, a pesar de la tendencia hacia la menor actividad. Sin embargo, la actividad de la caspasa 3/7 ejecutivo fue significativamente mayor después del tratamiento DOX, mientras que los inhibidores catalíticos TOP2 prevenirse eficazmente este cambio (Figura 5D)
cardiomiocitos de rata neonatal (A - F). Se pre-incubó con 30 M dexrazoxano (DEX), sobuzoxano (SOB) y merbarona (MER) para 3 h y luego se co-incubaron con 1,2 M de daunorrubicina (DAU; a - C) o doxorrubicina (DOX; D - F) durante 3 h, seguido de un período de 48 h sin antraciclina.