Extracto
El cáncer de hígado se ubica en la prevalencia y la mortalidad entre los cinco tipos de cáncer en todo el mundo. La acumulación de intereses se han centrado en el desarrollo de nuevas estrategias para el tratamiento de cáncer de hígado. Hemos demostrado anteriormente que la dihidroartemisinina (DHA) presentó una actividad antitumoral hacia el cáncer de hígado. En este estudio, hemos demostrado que los inhibidores de la histona deacetilasa (HDACI) aumentaron significativamente el efecto antineoplásico de DHA a través de aumento de la apoptosis
in vitro
y
in vivo
. La inhibición de la fosforilación de ERK contribuyó a la apoptosis inducida por DHA, debido al hecho de que inhibidor de la fosforilación de ERK (PD98059) aumento de la apoptosis inducida por DHA. En comparación con solo DHA, el tratamiento combinado con DHA y HDACi reduce el potencial de membrana mitocondrial, citocromo liberado
c
en el citoplasma, el aumento de p53 y Bak, disminución de MCL-1 y p-ERK, caspasa 3 y PARP activada y apoptosis inducida. Además, se demostró que el tratamiento previo HDACi facilitó la apoptosis inducida por el DHA. En Hep G2-xenoinjerto llevar a ratones desnudos, la inyección intraperitoneal de DHA y SAHA resultó en una inhibición significativa de tumores de xenoinjertos. Los resultados de TUNEL y H & amp; E tinción mostraron más la apoptosis inducida por el tratamiento combinado. datos inmunohistoquímica reveló la activación de PARP, y la disminución de Ki-67, p-ERK y MCL-1. En conjunto, nuestros datos sugieren que la combinación de HDACi y DHA ofrece un efecto antitumoral en cáncer de hígado, y este tratamiento de combinación debe considerarse como una estrategia prometedora para la quimioterapia
Visto:. Zhang CZ, Pan Y, Cao Y, Lai PBS, Liu L, Chen GG, et al. (2012) Los inhibidores de histona deacetilasa Facilitar dihidroartemisinina-apoptosis inducida por el cáncer de hígado en
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 7 (6): e39870. doi: 10.1371 /journal.pone.0039870
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 10, 2012; Aceptado: 28-may de 2012; Publicado: 28 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81172345 y Nº 30973506). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de hígado es el quinto cáncer más común en todo el mundo y la tercera causa más común de muerte por cáncer [1]. Más del 75% de los nuevos casos se diagnostican en los países en desarrollo; Sin embargo, la incidencia está aumentando en las regiones económicamente desarrollados, como Japón, Europa Occidental y los Estados Unidos [2], [3]. Aunque la resección quirúrgica y el trasplante de hígado son los dos principales opciones terapéuticas con potencial curativo, la cirugía sólo es factible para el 20% de los casos de cáncer de hígado ya que los pacientes se diagnostica con mayor frecuencia en una etapa avanzada [4], [5]. Hasta la fecha, la quimioterapia para el cáncer de hígado no es satisfactoria y la supervivencia a largo plazo de pacientes con cáncer de hígado sigue siendo pobre [4], [6]. Por lo tanto, el desarrollo de estrategias novedosas y terapéuticos eficaces para el cáncer de hígado es de gran necesidad e importancia.
Los inhibidores de la histona deacetilasa (HDACI) son actualmente un importante foco de interés como agentes antineoplásicos [7], [8]. HDACi es una clase de agentes que funcionan a través de bloqueo de la desacetilación de histonas, modificando de este modo la cromatina estructura y transcripción de genes [9]. En particular, HDACi inhibir la acetilación de residuos de lisina en la cola N-terminal de la histona que se traduce en el aflojamiento de la asociación de las histonas con el ADN, permitiendo de ese modo la expresión de genes relacionados con la supresión de tumores [10]. La comprensión de la relación entre las actividades de HDAC y varios tipos de cáncer llevado a muchos investigadores a considerar inhibidores de HDAC como agentes potentes que pueden interferir con la proliferación de células de cáncer y /o la supervivencia a través de la modulación de la progresión del ciclo celular, la diferenciación, o mediante la promoción de la muerte celular. Por ejemplo, Kim et al. informó de que la exposición CG0006 en células de cáncer de mama resultó en la muerte celular a través de la regulación por disminución HDAC6 [11]. Bommi et al. demostrado que la apoptosis inducida por butirato de sodio en las células cancerosas mediante la regulación a la baja de la transcripción de IMC1 [12].
A pesar de que solo HDACi puede ser clínicamente útil, lo más probable es que sea de valor en combinación con otros agentes antitumorales. SAHA ha sido aprobado por la Food and Drug Administration de Estados Unidos (FDA) para el tratamiento del linfoma cutáneo de células T y otros HDACi ahora están experimentando II de los ensayos de fase I /clínicos como agente único o en combinación con otros agentes [13], [14 ]. La acumulación de informes se han indicado el efecto sinérgico sobre la letalidad de la combinación de HDACi y otros agentes quimioterapéuticos. Kretzner et al. mostraron que la combinación de HDACi y Aki mejorado la muerte de células de linfoma a través de la represión de c-Myc, hTERT, y los niveles de microARN [15]. Nguyen et al. informó de que la administración conjunta de HDACi aumentó sinérgicamente letalidad KW-2449 resultante de la inactivación de Bcr /Abl [16]. Últimamente, un estudio de fase II reveló que el tratamiento de vorinostat combinado con tamoxifeno prolongó significativamente la supervivencia de pacientes con cáncer de mama [17]. Sin embargo, un efecto sinérgico tales raramente se ha demostrado en el cáncer de hígado.
Recientemente, hemos informado de que dihidroartemisinina (DHA), el principal metabolito activo de derivados de la artemisinina, exhibe actividad contra el cáncer hacia el cáncer de hígado [18]. En el presente estudio, hemos demostrado que (a) DHA indujo apoptosis a través de la regulación negativa de la fosforilación de ERK, que fue confirmado por los datos que el inhibidor de ERK fosforilación (PD98059) aumento de la apoptosis inducida por el DHA, (b) HDACi
in vitro
notablemente mejorada la muerte celular inducida por DHA, que acompaña a la reducción del potencial de membrana mitocondrial, la liberación de citocromo
c
en el citoplasma, el aumento de p53 y Bak, y disminuciones de MCL-1 y p-ERK, ( c) la combinación de HDACi y DHA
in vivo
detuvo significativamente el crecimiento de xenoinjerto de tumor de cáncer de hígado. Nuestros datos pueden sugerir la combinación de HDACi y DHA como una estrategia prometedora para la quimioterapia del cáncer de hígado.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer de hígado humano (Hep G2 y PLC /PRF /5) se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, MD) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS), 100 mg /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 y 95% de aire a 37 ° C.
Los anticuerpos y reactivos
anticuerpos para Mcl- 1, PARP, Bak, y la actina fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos para la caspasa 3, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, y p-JNK fueron proporcionados por Cell Signaling (Danvers, MA). Dihidroartemisinina (DHA, disuelto en DMSO), butirato de sodio (NaB, se disolvió en H
2O), ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA, disuelto en DMSO) y el inhibidor de p-ERK (PD98059, disuelto en DMSO) fueron adquiridos de Sigma ( St. Louis, MO).
MTT
La viabilidad celular se evaluó mediante la 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-diphenyltetrazo-Lium (MTT) ensayo. Brevemente, 8 × 10
3 de las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos durante 24 h, seguido de incubación con diversas dosis de DHA para el tiempo indicado. Después de añadir 100 l /pocillo de solución de MTT, las células se incubaron durante otras 2 h. Los sobrenadantes se retiraron entonces y los cristales de formazán se disolvieron en 100 l /pocillo de DMSO. La absorbancia a 570/630 nm de cada muestra se midió usando un lector de placas multietiqueta (PerkinElmer). Se realizaron tres experimentos independientes.
Formación de Colonias
Un centenar de células fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 7 días. Y a continuación, el medio fue reemplazado por uno nuevo que contenía DHA. Después de incubarse durante otros 7 d, colonia formada por las células de cáncer de hígado se tiñó con violeta cristal al 0,05% (Sigma, St. Louis, MO) durante 8 min. a continuación, se cuantificó el número de colonias.
Western blot
Los lisados celulares se hirvieron con 6x dodecilsulfato de sodio (SDS) al tampón de carga y luego se fraccionaron por SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF, que después se incubó con un anticuerpo específico primario en 5% de leche no grasa, seguido de una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada anti-ratón o segundos anticuerpos anti-conejo. reactivo de detección ECL (Amersham Life Science, Piscataway, NJ) se utilizó para demostrar los resultados.
ensayo
Anexina V /PI
La apoptosis se evaluó mediante Anexina V-PI doble tinción. Después de los tratamientos, se tripsinizaron las células, y se tiñeron con 0,5 mg /ml anexina V en tampón (HEPES mM de ácido libre 10, 0,14 M NaCl, y CaCl 2,5 mM
2) de unión para 30 min. Después, se añadió PI (5 mg /ml de concentración final) y se incubó durante otros 15 min. Las células fueron aplicados a un citómetro de flujo para la recolección de datos.
ensayo de TUNEL ensayo
La apoptosis se realizó utilizando el kit de ensayo de TUNEL Apo-Directo (Millipore). Las células se recogieron y se fijaron en PFA al 4% durante 60 min a 4 ° C, seguido de una segunda fijación en 70% (v /v) de etanol durante la noche a -20 ° C. Las células se trataron luego con diversos reactivos durante un periodo diseñado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Finalmente, las células se analizaron por citometría de flujo usando la máquina de FACS Vantage (Becton Dickinson). El software Cell Quest (Verity Software House) se utilizó para analizar los datos.
In situ
detección de muerte celular
El etiquetado de ADN fragmentado para evaluar la apoptosis se realizó con TUNEL tinción (fluorescencia verde), utilizando
In Situ
kit de detección de muerte celular (Roche, LA), tal como se describe en nuestro estudio anterior [19].
Medición de la actividad de caspasa 3
la actividad de la caspasa 3 inducida por el tratamiento DHA se determinó por el caspasa-3 Ensayo de actividad de Kit (Merck, Darmstadt).
Medición de potencial de membrana mitocondrial (Δψ
m) por citometría de flujo
Cuarenta nM de DiOC6 (Sigma-Aldrich, MO) se incubaron con las células tratadas en los puntos de tiempo indicados durante 15 min a 37 ° C. Las células recogidas se lavaron con PBS enfriado con hielo y se analizaron por citometría de flujo utilizando la máquina Becton Dickinson FACS Vantage (Becton Dickinson, NJ). Las células con baja Δψ
m se presentaron como un porcentaje de la población celular total. El software CellQuest (Verity Software House) se utilizó para analizar los datos.
Los estudios en animales
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales pertinentes y han sido aprobados por el Instituto de Investigación Médica Comité de ética de Sun Yat-Sen Centro de cáncer de la Universidad. 1 × 10
7 de células Hep G2 se suspendieron en PBS estéril y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones. Los ratones fueron controlados diariamente para el desarrollo de xenoinjerto /tumor. Los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en tres grupos de 6 ratones /grupo. DHA (5 mg /kg de ratón peso corporal) se le dio al grupo "DHA", SAHA (1,5 mg /kg de peso corporal del ratón) se le dio al grupo 'SAHA', se le dio combinación de SAHA y DHA a 'DHA + SAHA «grupo, una vez al día durante cinco días consecutivos por semana durante 24 d. El grupo DMSO recibió un volumen igual de control de disolvente. Después del tratamiento a diversos intervalos de tiempo, se midieron el peso corporal del ratón y el tamaño del tumor. Por último, los tumores se extirparon, se pesaron y se fijaron en 4% de PFA. tejidos incluidos en parafina se seccionaron a continuación, 4 nm y listo para H & amp;. E tinción y el ensayo de TUNEL
La inmunohistoquímica
Fijado en formol secciones de cáncer de hígado incluidas en parafina con un espesor de 4 micras y fueron desparafinados en xileno y alcoholes graduados, hidratado, y se lavaron en solución salina con fosfato (PBS). Después de tratamiento previo en un horno de microondas, la peroxidasa endógena fue inhibida por peróxido de hidrógeno al 3% en metanol durante 20 min, seguido de bloqueo de avidina-biotina usando un kit de biotina-bloqueo (DAKO, Alemania). Los portaobjetos se incubaron después con anticuerpos para 4 h en una cámara húmeda a temperatura ambiente, se lavaron en PBS, y se incubaron con anticuerpos de cabra biotinilado anti-conejo /ratón. Las láminas fueron desarrollados con el líquido Dako 3 ', 3-diaminobenzidina tetrahidrocloruro (DAB) + Sistema de cromógeno sustrato y de contraste con hematoxilina.
El análisis estadístico
Se determinó la diferencia entre los grupos de significación estadística utilizando una -way ANOVA o estudiante de
t-test
. Todos los
P
-valores son de doble cara y
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los cálculos estadísticos se realizaron con el software SPSS (SPSS, Inc., Chicago, IL). Los datos se presentan como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes.
Resultados
Activaciones de MAP quinasas fueron implicados en la apoptosis inducida por el DHA
DHA se ha demostrado que inducir la muerte celular en los cánceres humanos [20], [21]. Se evaluó la apoptosis inducida por primera DHA en líneas celulares de cáncer de hígado, usando el ensayo de anexina V. Los resultados indicaron que el porcentaje de células de Anexina V-positivos se aumentó drásticamente tras el tratamiento DHA (Fig. 1A), lo que sugiere DHA ser un inductor de la apoptosis potente en células de cáncer de hígado. En comparación con el control, tras una exposición de 10 M DHA durante 24 h, el porcentaje de células apoptóticas se incrementó notablemente de 5,3% y 4,9% a 16,6% y 13,5%, respectivamente, en Hep G2 y PLC /PRF /5 células (Fig. 1B).
A. apoptosis inducida DHA en células de cáncer de hígado. Las células tratadas con DMSO o 10 M DHA durante 24 y 48 h se tiñeron con tanto Anexina V y yoduro de propidio (PI) para 45 min. La apoptosis inducida por la DHA a continuación, se evaluó mediante análisis de citometría de flujo. B. El porcentaje de células apoptóticas se muestra, después de un análisis cuantitativo de ensayo de PI /anexina V. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, frente al grupo de DMSO. C. MAP quinasas fueron activados por el DHA. Las células fueron tratadas con 10 mM DHA durante el tiempo indicado. Se determinó la fosforilación de p38, ERK y JNK. D. Datos cuantitativos de tres experimentos independientes se muestran para indicar la expresión relativa de p-p38, p-JNK, y p-ERK.
La apoptosis de inducción generalmente se asocia con la activación de MAP quinasas. Un análisis del curso del tiempo se llevó a cabo en los niveles de fosforilación de tres miembros de MAP quinasa, incluyendo la quinasa extracelular regulada por señal (ERK), c-Jun NH2-terminal quinasa (JNK) y p38 (Fig. 1C). Los niveles de proteína de los 3 MAP quinasas se mantuvo sin cambios. Sin embargo, la fosforilación de p38 se aumentó después del tratamiento DHA en ambas células de la prueba. El nivel de fosforilación de JNK se mantuvo igual que el control en las células Hep G2, pero se incrementó notablemente en PLC /PRF /5 células (Fig. 1D). Los niveles de p-ERK aparecieron disminución tanto en las células de cáncer de hígado tratados con DHA. Estos datos pueden sugerir que la inactivación de ERK contribuye a la apoptosis inducida por el DHA.
La inhibición de la fosforilación de ERK se atribuyó a la apoptosis inducida por el DHA en las células de cáncer de hígado
Para probar nuestra hipótesis de que la inactivación de ERK estuvo involucrado en la apoptosis inducida por DHA, pretratados con células PD98059, un inhibidor de la fosforilación de ERK. En primer lugar, se ensayó la citotoxicidad de PD98059. Los resultados indicaron que PD98059 solo no causó apoptosis significativa tanto en las células (datos no presentados). Se determinó el efecto de la siguiente PD98059 sobre la atenuación del crecimiento celular inducida por el DHA. Como se indica por resultado MTT, PD98059 redujo significativamente viabilidades celulares de cáncer de hígado, en comparación con los grupos de DHA (Fig. 2A).
PD98059, un inhibidor de la fosforilación de ERK, una mayor disminución inducida por DHA de la viabilidad celular. Las células se trataron previamente con 10 PD98059 mu M durante 2 h, y después se incubaron con 10 M DHA para otro 24 h. La viabilidad celular residual se determinó mediante el ensayo de MTT. Los datos son la media ± SD de tres experimentos independientes, *
P Hotel & lt; 0,05. B. El tratamiento con PD98059 aumentó la producción de cuerpos apoptóticos. Las células pretratadas con 10 PD98059 mu M durante 2 h, y después se incubaron con 10 M DHA durante otras 24 h se tiñeron con Hoechst 33342 tinte. la fragmentación del ADN (indicado por asteriscos) y la condensación nuclear (indicado por flechas) se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. tratamiento C. PD98059 aumento de la apoptosis inducida por DHA. ensayo TUNEL se realizó para determinar la apoptosis. Se determinó el número de células apoptóticas y el porcentaje se indica por histograma. *
P Hotel & lt; 0,05. D. PD98059 más el tratamiento con DHA llevaron a divisiones de PARP y caspasa 3. Las proteínas recogidas de las células tratadas con PD98059 y DHA por 24 h se sometieron a transferencia de Western para detectar las divisiones de PARP y caspasa 3. actina se utilizó como control de carga.
A continuación, se examinó si el tratamiento con PD98059 mejorado la inhibición del crecimiento celular inducida por el DHA a través de la inducción de la apoptosis. Se evaluó la apoptosis inducida por DHA en las células de cáncer de hígado pretratados con PD98059 10 M durante 2 h por Hoechst 33342 tinción. Los resultados revelaron más células con rasgos característicos que incluyen condensación de la cromatina y el cuerpo de apoptosis se presenta en las células pretratadas con PD98059 (Fig. 2B). Esto se confirmó adicionalmente mediante ensayos de TUNEL que muestran que los porcentajes de células TUNEL positivas se incrementaron en las células de cáncer de hígado tratados tanto con PD98059 y DHA (Fig. 2C). Por otra parte, los niveles de PARP escindida y caspasa 3 escindida se incrementaron notablemente por el inhibidor de ERK en las líneas celulares de cáncer de hígado 2 (Fig. 2D). Estos hallazgos sugieren que la apoptosis inducida por DHA puede estar relacionada con la fosforilación de ERK.
HDACi facilitó DHA inducida por apoptosis en células de cáncer de hígado
A la vista de que HDACi es capaz de potenciar el efecto letal de agentes quimioterapéuticos [22], [23], que pretende examinar si el DHA combinado con HDACi resultó en más muerte celular en el cáncer de hígado. NaB y SAHA se utilizaron en el análisis MTT. Según los resultados, la combinación de DHA y HDACi redujo significativamente viabilidades de células en células de cáncer de hígado, en comparación con el tratamiento con agente único (Fig. 3A). El aumento de la citotoxicidad de la combinación de DHA y HDACi también se determinó mediante el ensayo de formación de colonias. Las células en grupos de DMSO formaron un número de colonias visibles en el 15 d. El número de colonias formadas por células cultivadas con DHA y HDACi fue significativamente menor que con DHA solo (Fig. 3B).
El tratamiento de combinación con HDACi y DHA aumentó la muerte celular. Las células se trataron con NaB 4 mM, 1,25 M SAHA, 10 M DHA o combinación de NaB /SAHA y DHA para 24 h. viabilidades de células se midieron mediante el ensayo de MTT. B. El efecto inhibidor de HDACi y DHA en combinación sobre el crecimiento de células de cáncer de hígado se confirmó adicionalmente mediante el ensayo de formación de colonias. Cien de las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos durante 7 d, y después se cultivaron con cualquiera HDACi o DHA para otro 7 d. Las colonias se tiñeron con 0,05% de cristal violeta. El número de colonias en cada pocillo se contó y se realizó el análisis estadístico. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. C. El efecto de HDACi sobre la apoptosis inducida por el DHA se midió mediante el ensayo de TUNEL, utilizando
In situ
kit de detección de muerte celular. las células Hep G2 tratadas como se describe en A se sometieron a ensayo de TUNEL. se observaron células apoptóticas bajo el microscopio fluorescente. D. El efecto de HDACi y DHA en combinación se confirmó adicionalmente mediante el ensayo TUNEL, el uso de citometría de flujo. Se calculó el porcentaje de células apoptóticas. E. caspasa 3 activación estuvo implicado en la apoptosis mediada por HDACi en células tratadas con DHA. Se determinó la actividad de la caspasa 3 en células tratadas como se describe en A y se demostró que el cambio relevante. Para A, B, D y E, *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01, en comparación con el grupo de DHA
A continuación se determinado la actividad pro-apoptótica de tratamiento combinado con DHA y HDACi. tratamiento DHA inducida potentemente la apoptosis en células de cáncer de hígado, pero más apoptosis fue inducida por el tratamiento combinado con ambos agentes, como se muestra por ensayos de TUNEL que indican un aumento notable de células TUNEL positivas (Fig. 3C). Estadísticamente, el DHA en combinación con NAB o SAHA células apoptóticas aumentó un 1,9 o 2,8 veces, respectivamente, en células Hep G2, y un 3,0 o 3,5 veces, respectivamente, en el PLC /PRF /5 células (Fig. 3D). En línea con el aumento de la apoptosis, la actividad de caspasa 3 fue mayor en las células tratadas con DHA y HDACi (Fig. 3E).
La liberación de citocromo
c
en el citoplasma y la regulación a la baja de MCL-1 y p-ERK contribuyó a la apoptosis causada por el tratamiento combinado con HDACi y DHA
Hemos demostrado anteriormente que la apoptosis inducida por el DHA asociado con MCL-1 y la degradación de activación Bak [18]. A continuación examinó si MCL-1 y Bak estaban involucrados en el enriquecimiento mediada por HDACi de la apoptosis en las células tratadas con DHA. Como se indica en los resultados de western blot, MCL-1 se redujo drásticamente, mientras que Bak se incrementó notablemente en células Hep G2 tratadas con DHA y NAB /SAHA. Las alteraciones de MCL-1 y Bak en PLC /PRF /5 células comparten una tendencia similar con los de las células Hep G2 (Fig. 4A). Además, p53 de tipo salvaje en células Hep G2 se upregulated, mientras que 5 células /p53 mutante en PLC /PRF fueron apenas se ven afectados, después del tratamiento (Fig. 4A).
El tratamiento de combinación con HDACi y DHA resultó en la regulación a la baja de MCL-1 y la regulación al alza de Bak. células de cáncer de hígado se expusieron a NaB 4 mM, 1,25 M SAHA, 10 M DHA o combinación de NaB /SAHA y DHA para 24 h. Expresión de MCL-1, Bak y PARP escindida se examinó por transferencia de Western. Panel superior: un resultado representativo se muestra. Panel inferior: la expresión relativa de MCL-1 y Bak normalizado a actina se indica mediante histograma. B. La expresión de p-ERK se redujo en las células tratadas con HDACi y DHA. Las proteínas recogidas de las células de cáncer de hígado tratados con SAHA, DHA o los fármacos combinados se sometieron a western blot para examinar la expresión de p-ERK. Panel superior: un resultado representativo se presentó. Panel inferior: la expresión relativa de p-ERK /ERK se muestra. C. Reducción del potencial de membrana mitocondrial (MMP) se indujo en las células tratadas con DHA /HDACi. Hep G2 y PLC /PRF /5 células se trataron como se describe en A. El colapso MMP (Δψ
ml) se midió por citometría de flujo después de teñir las células con DiOC6 y análisis cuantitativo de Δψ
se demostró m. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes. D. citocromo
c
fue lanzado al citosol de las células tratadas. Las células se trataron como se describe en A. Las fracciones de citosol fueron aislados para examinar la distribución de citocromo
c
. ß-actina se utilizó como marcador para el citosol. E. HDACi pretratamiento células sensibilizadas a la apoptosis inducida por DHA. células de cáncer de hígado pretratados con NaB mM 4 o 1,25 M SAHA durante 2 h se expusieron además a 10 M DHA para otro 24 h. Se llevaron a cabo ensayos de TUNEL para determinar la apoptosis. Se muestra el porcentaje de células TUNEL-positivas. Para B, C y E, *
P
. & Lt; 0,05, en comparación con el grupo de DHA
A la luz de los datos emergentes que ERK fosforilación se inhibió de DHA-tratada y HDACi- células tratadas. A continuación examinó el nivel de ERK fosforilada. Los resultados mostraron una disminución rápida de p-ERK en las células de cáncer de hígado tratados con DHA y SAHA, especialmente en PLC /PRF /5 células (Fig. 4B).
Desde la apoptosis inducida por DHA se atribuyó a la despolarización de la membrana externa de la mitocondria [18], el próximo examinado la reducción del potencial de membrana mitocondrial (MMP). Los resultados mostraron que el tratamiento combinado redujo notablemente el potencial transmembrana mitocondrial (Fig. 4C), seguido por una liberación evidente de citocromo
c de la mitocondria
a citoplasma (Fig. 4D).
Como se muestra en nuestro estudio anterior, antes del tratamiento sensibiliza a las células de cáncer de hígado HDACI al etopósido [22]. Pretratados con células NAB o SAHA, y luego se evaluó la apoptosis resultante por TUNEL ensayos. En comparación con los de las células unpretreated, porcentajes de células TUNEL positivas en células pretratadas-HDACi aumentaron significativamente (Fig. 4E).
SAHA mejorado efecto antitumoral de DHA en Hep G2 tumor de xenoinjerto en ratones
Después de haber demostrado la capacidad de SAHA para mejorar la muerte celular mediada por el DHA
in vitro
, se determinó aún más el efecto sinérgico de SAHA y DHA
in vivo
. células Hep G2 se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos para establecer xenoinjerto de tumor. ratones desnudos portadores de xenoinjertos de tumores fueron dosificados con DHA (5 mg /kg /Bid) y /o SAHA (1,5 mg /kg /Bid) al día durante 24 días. El tratamiento no parecen tener un efecto notable sobre el peso corporal en ratones. En promedio, la terapia de combinación inhibe el crecimiento de tumores de cáncer de hígado en más de un 44,7%, mientras que el tratamiento de agente único, ya sea con DHA o SAHA solamente inhibió el crecimiento del tumor por 17,6% y 4,6%, respectivamente (Fig. 5A). En el Día 24, los ratones se sacrificaron y se midieron los pesos de los tumores. Como se esperaba, la combinación de HDACi y DHA redujo significativamente los pesos de tumor de xenoinjerto, en comparación con DHA de sólo los grupos (Fig. 5B). Estos datos indicaron que el tratamiento de combinación genera un efecto mayor y la citotoxicidad anti-proliferativa que cualquier agente solo solo en xenoinjertos de cáncer de hígado
in vivo
.
Combinación de SAHA y DHA notablemente detuvo el crecimiento de Hep G2 tumor de xenoinjerto. Los ratones desnudos fueron inoculados con 1 x 10
7 de las células Hep G2. Después de que el tumor formado era palpable, los ratones se dividieron al azar en cuatro grupos. DHA (5 mg /kg de ratón peso corporal) se le dio al grupo "DHA", SAHA (1 mg /kg de ratón peso corporal) se le dio al grupo 'SAHA', se le dio combinación de SAHA y DHA a 'DHA + SAHA «grupo, una vez al día durante cinco días consecutivos por semana durante 24 d. Los volúmenes tumorales se calcularon cada dos días. Seis xenoinjertos se realizaron en cada grupo. Los datos son la media ± SD, *
P Hotel & lt; 0,05, frente al grupo de DMSO. B. Combinación de tratamientos de SAHA y DHA dio como resultado una disminución dramática de peso del tumor. En el día 24, los ratones se sacrificaron, y se midieron los pesos de los tumores. C. La apoptosis se indujo
in vivo
. Los tumores se seccionaron y la apoptosis se determinó utilizando
In situ
kit de detección de muerte celular. se observaron células apoptóticas bajo el microscopio fluorescente. D. SAHA aumentó significativamente la apoptosis en los ratones tratados con DHA. Los porcentajes de células apoptóticas se midieron mediante el recuento del número de células verdes en cinco campos aleatorios.
Con el fin de probar si HDACi aumentó el efecto letal de DHA a través de aumento de la apoptosis, se seccionaron los tejidos tumorales y se sometieron a
In situ
detección de muerte celular (Fig. 5C). Los resultados mostraron que la proporción de células apoptóticas se incrementó significativamente desde 8,6 ± 2,4% en el grupo DHA a 17.7 ± 3.3% en el grupo de tratamiento combinado (Fig. 5D). Además, se analizó la histología de los tumores después del tratamiento con H & amp; E tinción. Los tumores de grupo de control mostraron aspecto histológico típico de cáncer de hígado (Fig. 6). Las secciones de los tumores tratados con DHA mostraron que las células cancerosas se disminuyó notablemente, con signos de apoptosis, la infiltración de células inflamatorias y fibrosis. En el grupo tratado combinado, las regiones apoptóticas y necrosis extensa con infiltración de células fagocíticas pueden ser observados con bastante frecuencia.
SAHA ampliada la región de apoptosis causada por el tratamiento DHA en Hep G2 tumor de xenoinjerto. Los tumores se extirparon y se sometieron a H & amp; E tinción para la determinación de la evaluación patológica. Por otra parte, los tejidos de xenoinjertos se sometieron a inmunoquímica para detectar la expresión de Ki-67, p53, MCL-1, p-ERK, y PARP activo. aumento original × 400.
Además, se realizó inmunohistoquímica para detectar las proteínas implicadas en la apoptosis inducida por el DHA HDACi /(Fig. 6). disminución de expresión de Ki-67 indica la reducción de la proliferación celular y la muerte celular probable mejorada. No se observó diferencia detectable en la expresión de p53. Pulso de aumento de PARP activo, así como una disminución predominante de MCL-1 y p-ERK, estaba presente en xenoinjertos tratados con DHA HDACi /. En conjunto, estos datos indicaron que HDACi fueron capaces de aumentar significativamente los efectos antitumorales mediados por DHA.
Discusión
Estudios recientes sugieren que HDACi incluyendo NaB y SAHA interactúan sinérgicamente con agentes citotóxicos, tales como fludarabina y etopósido, para aumentar drásticamente la lesión mitocondrial y apoptosis en células de cáncer leucémicas y epiteliales [24], [25]. Las propiedades, antitumoral de HDACi son especialmente notables probablemente debido al hecho de que sus efectos citotóxicos son generalmente específicos de las células cancerosas, pero no para las células normales. Sin embargo, cuando se utiliza como agente único, HDACi podría exhibir actividad letal limitada hacia el cáncer de hígado, que es evidente en el presente estudio muestran que tanto la NAB y SAHA a dosis bajas no son capaces de inducir la inhibición significativa del crecimiento
in vitro
y
in vivo
. Sin embargo, cuando HDACi se utilizan en combinación con DHA, un derivado de la artemisinina que se usa clínicamente en el tratamiento de la malaria con buen perfil de toxicidad [26], que pueden inducir la apoptosis mucho más, dando como resultado notable alto de xenoinjerto de tumor en ratones desnudos. Hay muy poca información sobre HDACi en combinación con otros agentes antitumorales contra el cáncer de hígado. Nuestros datos, por primera vez han demostrado un efecto sinérgico de DHA y HDACi en la inhibición de cáncer de hígado.
Muchos informes han demostrado que el umbral de la apoptosis en células de cáncer puede ser controlado por las actividades de las vías de transducción de señales múltiples , uno de los cuales es Raf-MEK1 /2-ERK1 /2 vía [27], [28]. Esta vía es frecuentemente dysregulated en la transformación neoplásica, junto con la quinasa c-Jun NH2-terminal (JNK1 /2) y las vías de p38 MAPK [29]. También se ha implicado que la activación de la vía ERK1 /2 se asocia generalmente con la supervivencia, pero vía MAPK JNK1 /2 y p38 con la apoptosis [30]. En nuestro estudio, ERK1 /2 fosforilación fue ligeramente inhibido por el tratamiento con DHA, pero fuertemente inhibida por el tratamiento combinado con DHA y HDACi. Además, utilizando el inhibidor PD98059-ERK específico, hemos demostrado que la activación de la ERK es antiapoptótico ya que el inhibidor de ERK aumento de la apoptosis inducida por el DHA en las células de cáncer de hígado.
Se han identificado una serie de proteínas efectoras antiapoptóticas aguas abajo de la señalización de ERK1 /2, incluyendo Bcl-xL y MCL-1 [31], [32]. Las alteraciones de ambos ERK fosforilada y MCL-1 con frecuencia se produce en la misma dirección. Yuen et al. informó que el silenciamiento Ran puede conducir a la desactivación de ERK y la regulación a la baja de MCL-1 en las células del cáncer [33]. Reeves et al. mostraron que la activación de ERK y la inducción de MCL-1 se observaron en las células mieloides infectadas por citomegalovirus humanos [34]. Calviño et al. para tratamiento reportado con más lonidamina trióxido de arsénico dio lugar a reducciones de MCL-1 y P-ERK [35]. Sun et al.