Extracto
La experiencia clínica de los inhibidores de la histona deacetilasa (HDACIs) en pacientes con tumores sólidos ha sido decepcionante; sin embargo, el mecanismo molecular de fracaso del tratamiento no se conoce. Por lo tanto, hemos tratado de investigar el mecanismo molecular de fracaso del tratamiento de HDACIs en el presente estudio. Se encontró que HDACIs tricostatina A (TSA) y ácido hidroxámico suberoilanílido (SAHA) podría inducir a la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT) fenotipo en el cáncer de próstata (CaP) las células, que se asocia con cambios en la morfología celular en consonancia con el aumento de expresión de la transcripción factores ZEB1, ZEB2 y Slug, y los marcadores mesenquimales como la vimentina, N-cadherina y fibronectina. chip de ensayo mostró la acetilación de la histona de 3 en proximal promotores de genes seleccionados, lo cual fue en parte responsable del aumento de la expresión de marcadores de EMT. Además, el tratamiento TSA dio lugar a un mayor aumento en la expresión de Sox2 y Nanog en células de CaP con fenotipo EMT, que se asoció con características celulares de cáncer de tallo como (CSLC) coherentes con el aumento de la motilidad celular. Nuestros resultados sugieren que HDACIs sólo conduciría a la agresividad del tumor, y por lo tanto las estrategias para revertir EMT-fenotipo mesenquimal a epitelial transición fenotipo (MET) o la reversión de las características CSLC anteriores a la utilización de HDACIs sería beneficioso para darse cuenta del valor de HDACIs para el tratamiento de tumores sólidos, especialmente CaP
Visto:. Kong D, Ahmad a, B Bao, Li Y, S Banerjee, Sarkar FH (2012) los inhibidores de histona deacetilasa Inducir la transición epitelio-mesenquimal transición en Las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (9): e45045. doi: 10.1371 /journal.pone.0045045
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Julio, 2012; Aceptado: August 11, 2012; Publicado: 14 Septiembre 2012
Copyright: © Kong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por una subvención del Instituto Nacional del cáncer, de los Institutos nacionales de Salud (5R01CA108535-06 y 5R01CA083695-09) adjudicado a FHS (http://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm?&new=1&icde=4342569&loc=2&CFID=28929570&CFTOKEN=80568291). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Una amplia variedad de alteraciones genéticas y genómicas tales como amplificaciones, translocaciones, deleciones y mutaciones puntuales se ha creído que se asocia con el desarrollo del cáncer. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que los cambios epigenéticos también están involucrados en el desarrollo del cáncer [1]. Las principales modificaciones en los seres humanos son la metilación del ADN y las histonas modificaciones postraduccionales incluyendo acetilación, metilación, fosforilación, etc, que están implicadas en la expresión desregulada de genes mediada por la regulación transcripcional [1], [2]. La acetilación y desacetilación de histonas juega un papel importante en la regulación transcripcional de genes en las células eucarióticas. El estado de acetilación de histonas es dependiente del equilibrio de las actividades de histona acetiltransferasa (HAT) y la histona desacetilasa (HDAC). HDACs eliminan los grupos acetilo de la lisina en la cola de la histona, que promueve más la estructura de cromatina condensada, lo que resulta en la represión de la transcripción génica mediante la limitación de la accesibilidad de los factores de transcripción [3]. El aumento de expresión y la actividad de HDAC en tejidos de cáncer condujo al diseño racional de inhibidores de la histona deacetilasa (HDACIs) como potenciales agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer. Varios HDACIs se han utilizado en la fase I y II de ensayos clínicos para el tratamiento de una serie de neoplasias hematológicas y también tumores sólidos [4]. La mayoría de las respuestas positivas a HDACIs resultaron ser en pacientes con neoplasias hematológicas como el linfoma cutáneo de células T y el linfoma de células T periféricas. Sin embargo, los resultados en los tumores sólidos, hasta el momento, han sido decepcionantes. Hasta la fecha, varios mecanismos por los cuales la resistencia se inducen durante el tratamiento de tumores sólidos con HDACIs se han dilucidado, incluyendo aumento de la expresión del gen de resistencia a múltiples fármacos, MDR1 (ABCB1), el aumento de las proteínas anti-apoptóticas y la activación de vía de supervivencia celular [3] y estos hallazgos aún no se han traducido en la medicina clínica. Por lo tanto, una mejor comprensión de los determinantes moleculares de la resistencia a HDACIs podría servir de base para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas que podrían mejorar el resultado del tratamiento de los pacientes diagnosticados con tumores sólidos.
epitelio-mesenquimal transición (EMT ) se cree que está asociada con la resistencia a las drogas [5], [6]. La biología de EMT es un proceso de trans-diferenciación fundamental, que se produce durante la embriogénesis y en los tejidos adultos después de la reparación de la herida y la remodelación de órganos en respuesta a una lesión, y también se produce durante la progresión del cáncer [7], [8]. Durante este proceso, las células epiteliales adquieran la morfología celular mesenquimal a través de la regulación por disminución de los marcadores epiteliales y sobre regulación de marcadores mesenquimales, con lo que conduce a una mayor capacidad migratoria, invasividad y aumento de la resistencia a la quimioterapia, y todos los cuales están involucrados en la progresión del cáncer [ ,,,0],7] - [15]. Por otra parte, las células con fenotipo comparten características EMT con cáncer de células de tallo como (CSLC), que confiere resistencia a los fármacos a estas células y contribuye a la recurrencia del cáncer y la metástasis [10], [11], [16], [17]. Kong et al., Encontraron que la sobre expresión de PDGF-D dio lugar a la inducción de EMT fenotipo en el cáncer de próstata PC3 (CaP) las células, que se asocia con la pérdida de marcadores epiteliales y la ganancia de la expresión de marcadores mesenquimales tales como N-cadherina , vimentina, así como la regulación de factores de transcripción incluyendo ZEB1, ZEB2 y Slug, lo que resulta en la migración celular mejorada, la invasión i
n vitro
y el crecimiento tumoral
in vivo
[9 ]
, [18],
[19]
. Además, PDGF-D sobre-expresión de las células PC3 (células PC3 PDGF-D) con EMT fenotipo mostradas Firmas CSLC, que era consistente con el aumento de expresión de Oct4. Nanog, Sox2 y Lin28B, lo que resulta en la capacidad clonogénico mejorada y la capacidad de auto-renovación [10].
Klarmann et al. demostraron que las células invasoras, mediante Matrigel fueron sometidos a la conversión fenotípica EMT y muestran una mayor expresión de CD44 y CD24 disminución de la expresión de, y el aumento de la señalización Hedgehog. Además, las células invasoras de células DU145 y células de CaP primario humano son más tumorigénico en ratones NOD /SCID en comparación con las células no invasivas [20]. Mecánicamente, la cooperación entre la activación de RAS y la pérdida de PTEN condujo a la adquisición de vástago /subpoblación progenitor con características mesenquimales, y estas células eran altamente metastásico en el trasplante ortotópico [21]. Bajo la expresión del factor ETS transcripción ESE3 /EHF se demostró que se asocia con una mayor recurrencia bioquímica y la reducción de la supervivencia global de los pacientes con CaP después de la prostatectomía radical, que fue encontrado para ser coherente con la inducción de la EMT y la adquisición de firmas CSLC que llevó a un tumor iniciadoras y las propiedades metastásicas de células de CaP [22]. la terapia de privación de andrógenos (ADT) se utiliza comúnmente para el tratamiento de CaP metastásico, y Jennbacken et al. ADT demostró que podía aumentar la expresión de N-cadherina, un sello distintivo de la EMT, que se asoció con un aumento de la metástasis [23]. El aumento de expresión de N-cadherina en no metastásico, dependiente de andrógenos CaP en modelo animal conducido a la resistencia a la castración, aumento de la invasión y la metástasis, que era coherente con los resultados que muestran una expresión elevada de N-cadherina en los tumores primarios y metastásicos de los pacientes con resistente castración CaP (CRPC) [24]. Además, un estudio reciente ha demostrado que ADT podría inducir EMT y conduce a la adquisición de firmas CSLC tanto en tejido normal de próstata del ratón y explantes tumorales LuCaP35 de próstata humanos. Cambios similares en características mesenquimales también se observaron en los tumores de próstata de los pacientes tratados con ADT [25]. Estos resultados sugieren que la inducción de la EMT y firmas CSLC conduce a la resistencia terapéutica y conduce a la progresión del cáncer de próstata.
En el presente estudio, encontramos que el tratamiento de células de CaP con TSA o SAHA inducida fenotipo EMT mediada a través de hasta -Regulación de factores de transcripción y marcadores mesenquimales a través de la promoción de la acetilación de la histona 3 en promotores proximales de genes específicos. Además, el tratamiento TSA también condujo a aumentar aún más en la expresión de marcadores de células madre en células EMT fenotípica CaP. Estos resultados fueron consistentes con el aumento de la motilidad celular de TSA o SAHA tratados células de CaP. nuestros resultados proporcionan una base mecanicista para el resultado decepcionante de HDACIs en el tratamiento de tumores sólidos, y además sugieren que la reversión del fenotipo EMT o características CSLC por enfoque novedoso antes de HDACIs podría convertirse en una estrategia racional para el tratamiento de tumores sólidos, especialmente con CaP.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivo Condición
LNCaP y PC3 células fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 10 mmol /L de Hepes, 50 unidades /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina. Las líneas celulares estables que sobre-expresan PDGF-D (denominado PC3 PDGF-D) se generaron como se describe anteriormente [19] y se cultivaron en RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal 5% (FBS), 2 mmol /L de glutamina, 10 mmol /L de Hepes, 50 unidades /ml de penicilina, y 50 mg /ml de estreptomicina. Se mantuvieron todas las células en un 5% de CO
2-atmósfera humidificada a 37 ° C y genotípicamente caracterizado para apoyar la autenticidad de estas células, lo cual era consistente con su origen.
Los reactivos de investigación y anticuerpos
tricostatina A (TSA) se obtuvo de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) y el ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA) se adquirió de Aton Pharma, Inc, (Lawrenceville, NJ). Los anticuerpos contra acety-histona H3 (Lys9), HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6, Slug, Sox2 y Nanog fueron adquiridos de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA). Los anticuerpos contra el N-cadherina y vimentina se compraron de BD Biosciences (Bedford, MA) y Abcam (Cambridge MA), respectivamente. Los anticuerpos contra ZEB1, fibronectina y E-cadherina se obtuvieron de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). IgG de cabra anti-conejo (H + L) conjugado HRP de cabra anti-IgG de ratón conjugado HRP (H + L) se adquirieron de Bio-Rad (Reinach, BL). El anticuerpo para deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH) se obtuvo de Affinity Bioreagents (Golden, CO). Alex Fluro 594 IgG de cabra anti-conejo o Alex Fluro células PC3 594 de cabra anti-IgG de ratón y Alexa Fluor 594 faloidina para la tinción de F-actina se compraron de Invitrogen (Carlsbad, CA).
(A y B) tratados con TSA y SAHA durante 24 h en dosis indicadas. Las fotomicrografías de células PC3 tratadas con TSA y SAHA exhibieron un fenotipo de tipo fibroblástico, mientras que las células tratadas con el control DMAO muestran morfología redondeada de células epiteliales (aumento original, × 100). células PC3 (C) se sembraron en la cámara. Después de 24 h de incubación, las células fueron tratadas con 400 nM TSA o SAHA 5 M durante otras 24 h. Los resultados de la tinción de inmunofluorescencia para vimentina y ZEB1 (rojo) indicaron que el tratamiento de células PC3 con TSA y SAHA aumentó la expresión de vimentina y ZEB1 (panel central y derecha) en comparación con las células control (panel izquierdo). Phalloidin tinción mostró F-actina (rojo) la reorganización de TSA y SAHA tratada células PC3. El ADN nuclear fue teñido con DAPI (azul, aumento original, × 200).
El ARN total fue aislado de las células PC3 tratadas con 200 nM y 400 nM TSA (A) o 2,5 M y 5 M SAHA (B) durante 24 h. Los resultados de tiempo real RT-PCR mostraron que la expresión de mRNA relativa de ZEB1, ZEB2, Slug, Twist, N-cadherina, vimentina y MMP2 se aumentó después del tratamiento en comparación con el control de DMSO (el valor de control fue diseñado como 1, * p & lt ; 0,05, ** p & lt;. 0,01) guía empresas
ensayo de migración celular
ensayo de migración celular se realizó utilizando 24 pocillos Transwell Permeable Compatible con 8 micras poros (Corning, Lowell, MA) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Brevemente, se recogieron células PC3 tratadas con TSA, SAHA o control de DMSO durante 6 horas y se suspendieron en medio RPMI 1640 libre de suero y 1 × 10
5 células de cada pocillo fueron sembradas en los insertos Transwell. pocillos de fondo se llenó con 0,5 ml de medio que contiene 10% de FBS. Después de 24 h de incubación, se determinaron las células migradas como se describe anteriormente [9].
Western Blot Analysis
lisados de células totales se prepararon por lisis de las células en tampón RIPA. Las concentraciones de proteína se midieron usando reactivos de ensayo de proteínas (Pierce, Rockford, IL). Las proteínas con la misma cantidad se sometieron a SDS-PAGE para separar y se transfirió electroforéticamente a membranas de nitrocelulosa. Después de bloquear con 3% de leche, la proteína se detectó mediante la incubación con anticuerpos primarios respectivos seguido de incubación con anticuerpos secundarios respectivos como se describe anteriormente [26].
Real-time RT-PCR
La ARN total fue aislado utilizando RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA). El ADN residual se eliminó utilizando un kit NDase libre de RNasa (Qiagen). (Applied Biosystems, Fostor, CA) de ARN a ADNc kit de alta capacidad se utilizó para transcripción inversa un microgramo de ARN en ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real se realizó utilizando cebadores específicos para cuantificar la expresión génica mediante el uso de SYBR verde Reactivos RT-PCR (Applied Biosystems). La cantidad relativa de mRNA se normalizó a la expresión de GAPDH. Primer secuencias se muestran en la tabla 1.
CHIP Ensayo
Kit SimpleChIP® enzimática cromatina IP (perlas magnéticas) y 6-Gradilla separación magnética se adquirieron en la señalización celular y se utilizan para la realización de CHIP ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células PC3 tratadas con 400 TSA nM y 5 M SAHA o control de DMSO durante 16 horas y 37% de formaldehído fue añadido (concentración de formaldehído final fue de 1%) para reticular las proteínas de ADN y se mezcló, y después se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente . La glicina se añadió en placas y se incubaron las células durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS enfriado en hielo, los extractos nucleares de las células wee preparados. Para la preparación de la cromatina reticulada, se añadió la suspensión nuclear a microcócica de nucleasa para digerir el ADN a la longitud de aproximadamente 150 a 900 pb y microcócica nucleasa se inactivó por EDTA, y luego se sometió a ultrasonidos con varios pulsos para romper la membrana nuclear. Después de la purificación, el tamaño del fragmento de ADN se determinó por electroforesis en un gel de agarosa al 1% y los resultados mostraron que los rangos de tamaño de ADN fue de aproximadamente 150 a 900 pb de longitud. Para la inmunoprecipitación de la cromatina, 15 g de ADN de la cromatina en tampón CHIP (para cada inmunoprecipitación) se incubó con el anticuerpo inmunoprecipitación: Ac-H3, HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6, y el control negativo (IgG de conejo normal) a 4 ° C con rotación. Después de la incubación durante la noche, se añadieron 30 l de proteína ChIP Grado perlas magnéticas G y se incubó durante 2 horas a 4 ° C con rotación de la cromatina se eluyó de los granos de G /proteína de anticuerpo y los enlaces cruzados se invirtió mediante incubación con proteinasa K 2 horas a 65 DO. ADN fue purificado utilizando columnas rotatorias. La cuantificación de ADN se realizó por PCR usando cebadores específicos para el promotor del gen de la vimentina, ZEB2, Slug y MMP2. Las secuencias de cebador para estos promotores de genes se muestran en la tabla 1. La cantidad relativa de ADN promotor se normalizó a la entrada. IgG se utilizó como control de referencia y se calcula como valor unitario de 1,0.
(A) ARN total fue aislado de las células LNCaP tratadas con 200 nM y 400 nM TSA para 8, 16 y 24 h. La expresión de mRNA relativa de ZEB1, Slug, vimentina y N-cadherina se aumentó después del tratamiento TSA en comparación con el control de DMSO (el valor de control fue diseñado como 1, *, p & lt; 0,05; **, p & lt; 0,01). (B) las células LNCaP se trataron con 400 nM TSA durante 8 h a 72 h. El análisis de transferencia Western que muestra que el tratamiento con TSA promueve la acetilación de histone3 (Ac-H3) en 8 h y 16 h de tratamiento. La expresión de marcadores mesenquimales tales como fibronectina (Fibron) y vimentina se elevó después de 24 h de tratamiento con TSA. células PC3 (C) se trataron con 400 nM TSA durante 4 h a 32 h. Hiper-acetilación de la histona 3 se observó a las 4 h a 32 h de tratamiento con el aumento de la expresión concomitante de ZEB1 en cada punto de tiempo de tratamiento. Se observó mayor expresión de vimentina después de 16 h de tratamiento con TSA.
(A) ARN total fue aislado de las células LNCaP tratadas con 2,5 M y 5 M de SAHA para 8, 16 y 24 h. Los resultados de tiempo real RT-PCR mostraron que la expresión de mRNA relativa de los factores de transcripción como ZEB1 y Slug estaba regulado hasta tan temprano como 8 h de tratamiento con SAHA, mientras que la vimentina y N-cadherina se incrementó después de 16 h de tratamiento compararon al control de DMSO (el valor de control fue diseñado como 1, *, p & lt; 0,05; **, p & lt; 0,01). (B) las células LNCaP se trataron con 5 mM SAHA durante 8 h a 72 h. El análisis de Western blot que muestra que el tratamiento con SAHA promueve la acetilación de histone3 (Ac-H3) a las 8 h a 72 h de tratamiento. Fibronectina (Fibron) aumentó significativamente después de 24 h de tratamiento y vimentina se elevó drásticamente después de 16 h de tratamiento con SAHA. células PC3 (C) se trataron con 5 mM SAHA durante 4 h a 32 h. y aumento de la expresión de ZEB1 se observó a las 4 h a 32 h de tratamiento, que se asoció con Hyper-acetilación de la histona 3. Aumento de expresión de vimentina se observó a 32 h de tratamiento con SAHA.
Inmuno -fluorescencia Microscopía
tinción de inmunofluorescencia se realizó como se ha descrito previamente por nuestro laboratorio [18]. Brevemente, las células fueron fijadas con 4% de paraformaldehído durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT). Después de lavar 3 veces con PBS, las células se permeabilizaron en 0,5% de Triton X-100 en PBS durante 10 minutos, y luego se bloquearon con suero de cabra al 10%. Las células se incubaron durante 40 minutos con anticuerpos contra vimentina (pre-diluido) y ZEB1 suero de cabra (1:50) en 5%, se lavaron y después se incubaron durante otros 40 minutos con Alex Fluro 594 anticuerpo secundario conjugado (1:250) a temperatura ambiente. Para la tinción de F-actina, las células se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 minutos y se permeabilizaron en 0,5% de Triton X-100 en PBS durante 10 minutos, y después se incubaron con 0,33 M de Alexa Fluor 594 faloidina durante 40 minutos a 4 ° C . Después del lavado, los portaobjetos se montaron con medio de montaje que contiene el reactivo anti-fade y DAPI. Las células se observaron bajo microscopio de fluorescencia. Las imágenes fueron capturados y analizados mediante el uso de software de avanzada Deporte (instrumentos de diagnóstico, Sterling Heights, MI).
Cell Desprendimiento Ensayo
Para el ensayo de desprendimiento de las células, las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos a 5 x 10
4 células por pocillo. Después de 8 h de incubación, las células fueron tratadas con 400 nM TSA y SAHA 5 M o control de DMSO durante 20 horas. Para separar las células de las placas de cultivo, el medio se retiró y las células se lavaron con PBS y se incubó con 0,125% de EDTA tripsina a TA durante 3 minutos. Después de inactivar la tripsina mediante la adición de medio que contiene 5% de FBS en los pocillos, se recogieron las células desprendidas en tubos. Las células restantes se incubaron con 0,25% de EDTA de tripsina durante 5 minutos a 37 ° C para separar todas las células de las placas de cultivo y las suspensiones de células se recogieron en tubos nuevos. Las células se contaron y los datos se presentaron como un porcentaje de las células separadas (incubación con 0,125% de tripsina EDTA) a las células totales.
Análisis de Datos
Los experimentos se realizaron en tres o más diferentes repeticiones. Los datos se presentan como los valores medios ± SE. Se utilizó
t
Un test de Student de dos colas para las comparaciones entre los dos grupos. ANOVA se utilizó para la comparación de más de dos grupos. Los valores de p & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativa
Resultados
HDACIs inducida EMT fenotipo en células de cáncer de próstata
Para investigar los efectos de HDACIs en la morfología celular, nosotros también. tratados con células PC3 con TSA o SAHA, y hemos encontrado que las células PC3 tratadas con TSA o SAHA muestran la morfología alargada fibroblastoid /irregulares. En contraste, las células PC3 tratadas con DMSO mostraron una apariencia de adoquines, la morfología típica de las células epiteliales (Fig. 1A y B). células DU145 y ARCaPE tratados con TSA o SAHA también muestran la morfología fibroblastoide alargado /irregular (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que el tratamiento de células de cáncer de próstata con HDACIs conduce a la inducción de EMT fenotipo. Para confirmar aún más si HDACIs realmente podría inducir la EMT en las células PC3, se determinó la expresión de vimentina y ZEB1 mediante la tinción de inmunofluorescencia. TSA y SAHA inducida fenotipo EMT fue consistente con el aumento de la expresión de vimentina y ZEB1 (Fig. 1C, superior y panel central). Además, la reorganización de la actina F y un patrón difuso también se observaron en las células PC3 tratadas con TSA y SAHA (Fig. 1C, panel inferior), que se correlaciona con EMT fenotipo.
(A) PC3 y LNCaP las células se trataron con TSA o SAHA en diferentes dosis para 48 h. El análisis de transferencia Western que muestra la expresión de marcadores epiteliales y meshenchymal así como la acetilación de estado. (B) de tratamiento TSA durante 48 h aumentó la expresión de Sox2 y Nanog de una manera dependiente de la dosis en las células PC3 PDGF-D. Sobre regulación de vimentina fue visto incluso después de 50 nM TSA del tratamiento. (C) Ensayo de desprendimiento de las células se realizó después de 400 nM TSA o SAHA 5 tratamiento mu M durante 20 h. TSA y SAHA promueven significativamente el desprendimiento de células PC3 de las superficies de cultivo (**, p & lt; 0,01). (D) muestran un aumento de las tendencias de la migración celular de las células PC3 tratadas con TSA y SAHA.
Ensayo CHIP
(A) se llevó a cabo para determinar la unión de las HDAC y el estado de acetilación de la histona 3 en los promotores de EMT factores relacionados incluyendo vimentina, ZEB1, Slug y MMP2 en las células PC3 tratadas con TSA y SAHA durante 16 h mediante el uso de HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6 y el anticuerpo Ac-H3 (*, p & lt; 0,05; **, p & lt ; 0,01). (B) y las células PC3 (C) se trataron con TSA y SAHA, y análisis de transferencia Western posterior mostró que la expresión de HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4 y HDAC6 no se cambió a 16 h de tratamiento con TSA o SAHA. (C: control de DMSO; T: TSA; S: SAHA).
HDACIs aumento de la expresión de factores de transcripción y mesenquimales marcadores
Relacionado con EMT factores de transcripción juegan un papel crítico en la regulación de la expresión de marcadores epiteliales y mesenquimales. células PC3 tratadas con TSA significativamente hasta reguladas expresión de ARNm de ZEB1, ZEB2, Slug, Twist and snail1 después de 24 h de tratamiento (Fig. 2A), que se asocia con una mayor expresión de N-cadherina y vimentina. Se sabe que las células con fenotipo EMT adquieren aumento de la motilidad celular, y encontramos que el tratamiento TSA dio lugar a una mayor expresión de la MMP-2 (Fig. 2A), que se asoció con un aumento de la migración celular y la invasión. Para confirmar si la función HDACIs como inductores de la EMT, elegimos otra HDACI, SAHA, que ha sido aprobado por la FDA para su utilidad clínica. Curiosamente, el tratamiento SAHA también condujo a la adquisición de EMT fenotipo consistente con el aumento de la expresión de marcadores de EMT (Fig. 2B). células PC3 son andrógenos negativo línea celular del receptor de CaP (AR). Con el fin de evaluar si HDACIs también podría inducir la EMT en células de CaP positivos AR (tales como las células LNCaP), se trataron las células LNCaP con SAHA y se halló una mayor expresión de ZEB1 y ARNm Slug tan pronto como 8 h de tratamiento y fue aún más aumento después de 16 h de tratamiento. La expresión se redujo ligeramente, pero aún era significativamente mayor en el grupo tratado 400 nM TSA comparación con el control (Fig. 3A, panel superior). La expresión de mRNA vimentina también se incrementó después de 16 h de tratamiento y sostenida de alto nivel a las 24 h, lo que era coherente con el aumento de nivel de proteína después de 24 h de tratamiento con TSA (Fig. 3B). Sin embargo, los niveles de N-cadherina de ARNm se aumentaron tan pronto como tratamiento 8 h. Para determinar si la expresión de ARNm alterado está asociado con el estado de acetilación de la cromatina, probamos los niveles de acetilada-histona 3 (Ac-H3) en células tratadas con TSA 400 nM. células LNCaP tratadas con TSA mostraron significativamente aumentaron Ac-H3 dentro de 8 h de tratamiento, pero disminuyeron ligeramente después de 16 h (Fig. 3B), que es coherente con la expresión de ZEB1 y Slug, mientras que se observó un aumento de expresión de la proteína de vimetina y fibronectina después de 24 h de tratamiento (Fig. 3B). Estos resultados sugieren que ZEB1 y Slug están involucrados en la regulación de vimetina y fibronectina. En contraste, las células PC3 tratadas con TSA muestran altos niveles de Ac-H3 de 4 h a 32 h concomitante tratamiento con una mayor expresión de ZEB1, mientras que se observó una mayor expresión de la proteína vimentina después de 16 h de tratamiento con TSA (Fig. 3C). Resultados similares se observaron también en SAHA tratados LNCaP y PC3 células (Fig. 4A, B y C). Estos resultados sugieren fuertemente que HDACIs son potentes inductores de la EMT debido a la acetilación estado alterado, en consonancia con el aumento de la expresión de marcadores de EMT.
El reclutamiento de HDAC por diferentes factores da lugar a la desacetilación de histonas, lo que lleva a gen silencio incluyendo el silenciamiento de los genes relacionados con la EMT. La administración de HDACIs inducir la acetilación de la histona de, lo que podría activar la expresión de genes relacionados con el tipo mesenquimal, lo que resulta en la adquisición de la EMT.
HDACIs indujo la expresión de marcadores de células madre y el aumento de la motilidad celular
los resultados de análisis de transferencia Western mostraron que las dosis más altas de TSA (400 nM) y SAHA (5 M) podrían promover la acetilación de histonas y de ese modo regula la expresión de factores relacionados EMT (Fig 3B y C:. la Fig. 4B y C). Un estudio cinético dosis mostró que tan poco como 0,1 mM TSA o SAHA podrían causar la acetilación de la histona 3 (aumento de Ac-H3) de una manera dependiente de la dosis en células PC3, que era consistente con una mayor expresión de vimentina y N-cadherina (Fig . 5A). Sin embargo, la expresión de E-cadherina no mostró cambios significativos. Las células con fenotipo EMT se han demostrado para ser el origen de cáncer de células madre como CSLCs) [10], [11], [16]. Para abordar esta cuestión, las células PC3 PDGF-D con características EMT fueron tratados con TSA en dosis más baja del rango de 50 nM a 200 nM. Los resultados de análisis de transferencia Western mostraron que el tratamiento de células con TSA dio lugar a una mayor expresión de marcadores de células madre tales como Sox2 y Nanog de una manera dependiente de la dosis (Fig. 5B). Aunque las células PC3 PDGF-D muestran altos niveles de vimentina, la expresión de vimentina se incrementó aún más en las células tratadas TSA (Fig. 5B). Las células con EMT y /o firmas CSLC mostraron un aumento de la motilidad celular. el desprendimiento de células desde el sitio primario es un requisito previo para la migración celular, y de manera interesante, TSA o tratamiento SAHA promueve significativamente el desprendimiento de las células PC3 de superficie de la placa de cultivo (Fig. 5C), que era consistente con el aumento de las tendencias de la migración de células (Fig. 5D) .
Hyper-acetilación de Promotores de HDACIs era responsable de la regulación de la EMT factores relacionados con
los niveles de acetilación de histonas juegan un papel crucial en la remodelación de la cromatina que conduce a la regulación de la transcripción de genes. La acetilación de la lisina en las colas de la histona está asociada con la activación de la transcripción génica debido a un estado más relajado de la cromatina, que promueve la accesibilidad de los complejos de transcripción al sitio de inicio de la transcripción. Con el fin de evaluar si TSA y SAHA tratamiento podrían afectar el estado de acetilación de la histona en 3 en los promotores de los factores relacionados EMT, se realizó el ensayo CHIP. Como se muestra en la Fig. 6A, la cantidad de Ac-H3 asociado con promotores proximales de vimentina, ZEB2, Slug y MMP2 fue significativamente mayor en las células PC3 tratadas con TSA y SAHA en comparación con DMSO células tratadas de control. Estos resultados sugieren que HDACIs inducida hiper-acetilación de la histona en 3 en promotores de vimentina, ZEB2, Slug y MMP2 es mecánicamente responsable de una mayor expresión de estos factores. estado de acetilación se depende de la actividad de HDAC y sus niveles de expresión. Por lo tanto, los niveles de HDACs se examinaron en las células tratadas con TSA o SAHA por análisis de transferencia Western, y como se muestra en la Fig. 6B y C, ni TSA ni SAHA tratamiento durante 16 h mostró ningún cambio en la expresión de las HDAC. Sin embargo, encontramos que la cantidad de HDAC1 asociado con el promotor de la vimentina y Slug fue mayor en las células tratadas TSA comparación con las células de control. Por otra parte, la cantidad de HDAC2 asociado con el promotor de la vimentina, y ZEB1 Slug fue mayor en ambos de TSA y SAHA células tratadas en comparación con las células control (Fig. 6A). Estos resultados sugieren que los inhibidores de la HDAC conducen a la hiper-acetilación en la histona 3 en los promotores de genes mediante la represión de la actividad, pero no la reducción de cantidad de HDACs en el promotor de los genes diana, tales como la vimentina, ZEB1, Slug y MMP2, resultando en firmas de EMT en células de cáncer de próstata líneas (Fig. 7). Por lo tanto, la hiper-acetilación de los promotores por HDACIs podría ser responsable de la regulación de los factores relacionados con la EMT.
Discusión
Los inhibidores de la histona deacetilasa (HDACIs) han demostrado ser prometedores reactivos para el tratamiento de una serie de neoplasias hematológicas como el linfoma cutáneo de células T [27] - [29] y el linfoma periférico de células T en los ensayos clínicos [30]. Sin embargo, los ensayos clínicos con los HDACIs en tumores sólidos han sido decepcionantes, que es, en parte, podría ser debido a la adquisición de resistencia a HDACIs [3]. Por otra parte, los mecanismos de resistencia no han sido completamente aclarada. En el presente estudio, se encontró que HDACIs como TSA y SAHA podrían inducir la transición epitelio-mesenquimal transición (EMT), fenotipo y características de células madre-como el cáncer adquirida (CSLC), que han sido conocidos por contribuir a resistente a los medicamentos, el cáncer recurrencia y metástasis [16], [17]. Nuestros resultados son consistentes con los hallazgos que muestran que el tratamiento con TSA dio lugar a una mayor expresión de vementin, que fue mediada a través de la promoción de la acetilación de proximal región promotora del gen vimentina mediante el alivio de la represión complejo incluyendo ZBP-89 y HDAC1 [31]. La inhibición de la expresión de vimentina se ha demostrado que cambiar la morfología celular de cáncer de próstata que conduce a una reducción del crecimiento del tumor
in vivo
[32], y se espera que de este modo una mayor expresión de vimentina tener comportamiento de las células del tumor agresivo como el apoyo de nuestros resultados presentados