Extracto
A pesar de la terapia de radiación óptima (RT), la quimioterapia y /o cirugía, la mayoría de los pacientes con cáncer no microcítico de pulmón microcítico localmente avanzado (NSCLC) dejar el tratamiento. Para identificar nuevos genes objetivos para el control tumoral mejorada, se realizó RNAi pantallas de todo el genoma para identificar caídas que más reproducible aumentan la citotoxicidad NSCLC. Estas pantallas identificaron varias subunidades del proteasoma entre los grandes éxitos, entre ellos la exitosa superior
PSMA1
, un componente del núcleo 20 S del proteasoma. la inhibición del proteasoma radiación y mostró efectos sinérgicos. la inhibición del proteosoma dio lugar a una disminución del 80-90% en la recombinación homóloga (HR), una disminución del 50% en la expresión de los genes de recursos humanos NF-B-inducible
BRCA1
y
FANCD2
, y una reducción de BRCA1, FANCD2 y RAD51 ionizante focos inducidos por la radiación. I? B? RNAi desmontables rescató NSCLC radioresistance. La irradiación de ratones con xenoinjertos NCI-H460 después de
PSMA1 inducible shRNA desmontables
aumentó notablemente la supervivencia murino en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solo. la inhibición del proteasoma es una estrategia prometedora para el NSCLC radiosensibilización través de la inhibición de la expresión mediada por NF-B de la Anemia de Fanconi /Recursos Humanos genes de reparación del ADN
Visto:. Cron KR, Zhu K, Kushwaha DS, Hsieh G, Merzon D, Rameseder J, et al. (2013) inhibidores del proteasoma Bloque de reparación del ADN y radiosensibilizar de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (9): e73710. doi: 10.1371 /journal.pone.0073710
Editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute de la Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 30 de abril de 2013; Aceptado: July 19, 2013; Publicado: 5 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Cron et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación recibió el apoyo de la Sociedad Americana de Oncología Radioterápica (ASTRO) Premio Formación de Investigadores junior Facultad de carrera, un Centro Conjunto de Radioterapia Fundación Grant, Dana-Farber /Centro de cáncer Premio Proyecto Harvard SPORE del Desarrollo de Investigación en cáncer de Investigación de pulmón y el cáncer Nacional Instituto de los Institutos nacionales de Salud, bajo el premio número K08CA172354. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la radioterapia (RT) es una modalidad crítico en el tratamiento de cáncer de pulmón. Es muy eficaz cuando se localiza la enfermedad y la dosis curativas se puede administrar de forma segura. Por ejemplo, no pequeñas carcinomas de pulmón de células en estadio I (NSCLC) pueden ser tratados con dosis suficientemente altas de la radiación ionizante (IR) para producir tasas de control local 3 años alrededor de 90% [1]. Esto se debe en gran parte a las altas dosis biológicamente efectivas (BED) que se pueden administrar a los tumores de pulmón aislado utilizando radioterapia corporal estereotáctica. Por desgracia, sólo el 15% de los pacientes presentan este tipo de tumores [2]. tumores más avanzados, que son significativamente más comunes, no pueden ser tratados a una mayor CAMA, debido a la infiltración de, o cerca del mismo, estructuras radiosensibles, incluyendo los pulmones, la médula espinal, el esófago y el corazón [3]. Esto explica la limitación de las tasas de fallos locales más altos de alrededor del 30% [4]. Por lo tanto, los agentes sistémicos se administran para mejorar la respuesta a la radiación. Tales agentes incluyen agentes quimioterapéuticos citotóxicos, que tienen también las toxicidades limitantes de la dosis significativas y efectos limitados sobre el control del tumor. Sólo una minoría de los tumores presentan características genéticas, como la activación de mutaciones de EGFR [5] o translocaciones EML4-ALK [6], que permiten terapias dirigidas; Se necesitan opciones adicionales.
Varios estudios en todo el genoma se han completado en el CPNM, incluyendo la secuenciación del ADN [7], el análisis del número de copias [8] y el perfil de expresión génica [9]. Estos estudios proporcionan una identificación objetiva de las alteraciones genéticas y epigenéticas más frecuentes e importantes entre los 20-25.000 genes del genoma humano [10]. Revelaron asociaciones interesantes entre los genes y las covariables clínicos, pero fueron incapaces de demostrar directamente las relaciones de causa y efecto entre las alteraciones y los resultados terapéuticos. Por el contrario, la interferencia de ARN (RNAi) puede demostrar directamente los efectos de la expresión génica reducida en la fisiología celular y la supervivencia [11].
agrupado corto horquilla RNA (shRNA) pantallas, en el que las células cancerosas están expuestos a varios miles distintos shRNA secuencias, con un promedio de un gen desmontables por célula, tienen varias características atractivas. En primer lugar, el efecto de la caída estable shRNA durante varias duplicaciones celulares puede ser explorado, en comparación con la transfección transitoria de las secuencias de ARN de interferencia pequeño (siRNA) con efectos de corta duración. De acuerdo con ello, los tratamientos shRNA expresión imita la droga que normalmente se dan durante varias semanas en lugar de días. Además, las células que albergan diferentes secuencias shRNA compiten eficazmente entre sí dentro de la piscina, ya que proliferan, dando lugar a los golpes que producen efectos más pronunciados sobre la proliferación [12].
Debido a que la radioterapia es la base del tratamiento de NSCLC, gen silenciamientos que resultan en la citotoxicidad sinérgico cuando se combinan con radiación ionizante (IR) son deseables. Muchos tratamientos para el cáncer son aditivos en la naturaleza, y se combinan porque dan lugar a perfiles de efectos secundarios diferenciales [13]. tratamientos sinérgicos que resultan en mayores efectos cuando se administra al mismo tiempo, en comparación con los efectos aditivos de cada tratamiento que se da de forma individual, pueden servir particularmente bien como radiosensibilizadores, dado que la entrega de RT puede estar limitada a un volumen limitado, y los efectos secundarios pueden ser menos pronunciado fuera del irradiado volumen.
Demostrando el mecanismo de un shRNA radiosensibilizador también puede revelar biomarcadores para la selección de los pacientes y la evaluación del tratamiento. ADN de doble filamento se rompe (DSBs) se encuentran entre los efectos de IR que mejor se correlacionan con su citotoxicidad. Una sola sin reparar DSB es suficiente para dar lugar a la muerte celular reproductiva a través de la detención G2 o catástrofe mitótica [14]. DSB se reparan predominantemente a través de dos vías, la recombinación homóloga (HR) y extremos no homólogos a participar (NHEJ) [15]. silenciamientos de genes o inhibidores de molécula pequeña de cualquiera de las rutas puede promover la radiosensibilización.
A continuación examinamos la inhibición del proteasoma como una estrategia para el NSCLC radiosensibilización través de la inhibición de la reparación del ADN OSD. la inhibición del proteasoma se ha explorado en múltiples ensayos clínicos que involucran a pacientes con CPNM, con resultados variables. Por ejemplo, un estudio de fase II de 114 pacientes tratados con bortezomib y gemcitabina y carboplatino como tratamiento de primera línea del NSCLC avanzado, mostró una tasa de respuesta del 23% y una tasa de control de la enfermedad (respuestas + enfermedad estable) del 68%, lo cual justifica otros estudios [16]. Bortezomib no mostró actividad como monoterapia en un estudio de fase II de 14 pacientes, ninguno de los cuales mostraron una respuesta objetiva, y tres (21%) tenían enfermedad estable y duradera 3.4-11.5 meses [17]. En base a los datos, se propone que los inhibidores del proteasoma pueden ser útiles como sensibilizadores, teniendo en cuenta sus efectos represivos sobre la expresión mediada por NF-kB de genes necesarios para la vía de recursos humanos.
Resultados
proteasoma múltiple Los genes son Top hits en el conjunto de NSCLC Pantallas genoma de ARNi
Una pantalla entera shRNA genoma se realizó en dos líneas celulares de cáncer, A549 y NCI-H460. Estas líneas comparten rasgos genéticos comunes, incluyendo mutaciones en
KRAS
y
STK11 gratis (aka LKB1). Estas mutaciones se encuentran en los tumores que son particularmente agresivos y resistentes a la terapia, y para la que las terapias dirigidas no están disponibles [18], [19]. Las líneas celulares son de tipo salvaje en
TP53
y por lo tanto menos probable, en comparación con líneas mutados, para exhibir inestabilidad genómica en el transcurso de una pantalla que abarca múltiples semanas [20]. Además, su similitud genética, en términos de genes supresores de tumores oncogénicos y clave, aumenta la probabilidad de que la pantalla hits en una línea serán reproducidos en el otro (Tabla S1).
La biblioteca Hannon-Elledge contiene 74.705 distinta secuencias y metas shRNA cerca de 18.000 genes [21]. Después de la transducción con esta biblioteca y selección de puromicina para integrantes estables, se pasaron las células, y se determinó la representación relativa de cada secuencia dentro de una piscina antes y después de doce duplicaciones de la población. shRNA secuencias dirigidas contra genes esenciales para la proliferación celular se perdieron de forma selectiva. 1.667 genes fueron objeto de al menos una secuencia shRNA cuya abundancia disminuido por lo menos dos veces durante el paso en ambas líneas celulares (Tabla S2). subunidades del proteasoma múltiples numeradas entre los hits en ambas líneas celulares, incluyendo golpear la parte superior
PSMA1
, una subunidad del núcleo 20 S del proteasoma [22] (Fig. 1 y en la Tabla S3).
diagrama del 26 S del proteasoma que muestra la pantalla múltiple shRNA todo el genoma golpea con el siguiente código de colores: primero éxito (rojo), golpe fuerte (& gt; 1 shRNA secuencia por gen en ambas líneas celulares, naranja), golpe de menor importancia (1 shRNA secuencia por gen en ambas líneas celulares, de color naranja claro), sitio catalítico proteolítico similar a la quimotripsina (no un éxito, pero destacó con fines ilustrativos, verde). Cada golpe se etiqueta con los dos últimos caracteres alfanuméricos de nomenclatura HUGO del gen; por ejemplo, A1 = PSMA1, B5 = PSMB5, M1 = SHFM1.
inhibidores del proteasoma Sensibilizar CPNM células a la radiación
El shRNA desmontables doxiciclina-inducible de
PSMA1
en A549 y NCI-H460 resultado la pérdida de la expresión de proteínas tanto de PSMA1 y PSMB5, otra subunidad del núcleo 20 S proteasoma y el sitio catalítico de la actividad de tipo quimotripsina (CTL) de la proteasoma [22] (Fig. 2A). Este resultado confirma el papel esencial de
Hoteles en PSMA1 20 S ensamblaje del proteasoma. El tratamiento con el inhibidor de molécula pequeña bortezomib proteasoma o
PSMA1
shRNA desmontables causó una pérdida de actividad CTL (Fig. 2B).
(A) Transferencia Western que muestra los niveles de proteína de PSMA1 y PSMB5 en A549 y las células NCI-H460 NSCLC después de
PSMA1
shRNA desmontables en comparación con el control no silenciar shRNA. (B) de tipo quimotripsina ensayo de actividad (CTL) del proteasoma en el A549 (izquierda) y células NCI-H460 (derecha) NSCLC después del tratamiento con bortezomib, o
PSMA1
siRNA desmontables. Todos los resultados son la media ± SEM y normalizado con el control de vehículo DMSO. (C) ensayo de supervivencia clonogénico de A549 (izquierda) y NCI-H460 (derecha) después de la RI y bortezomib. barras marcadas muestran el porcentaje de muertes de muestras bortezomib-tratado en comparación con el control del vehículo DMSO a cada dosis IR. Todos los resultados son la media ± SEM y normalizado con el control de vehículo DMSO. ensayo de detección (D) Apoptosis de NCI-H460 después de 2 y 4 Gy IR y 50 bortezomib nM. Las barras muestran el porcentaje de células en apoptosis temprana (izquierda) o apoptosis tardía (derecha) a través de Anexina V y tinción con yoduro de propidum, respectivamente. Todos los resultados son la media ± SD de valores y P se calcularon utilizando
t
prueba de Student de dos colas.
El bortezomib es un agente activo
In vitro
en CPNM líneas, incluyendo A549 [23] y NCI-H460 [24], y se ha demostrado previamente radiosensibilizador propiedades en estudios preclínicos [25]. La capacidad de los inhibidores del proteasoma para aumentar los efectos de la radiación fraccionada, un método clínico de administración de radiación diaria en pequeñas dosis para minimizar la toxicidad a largo plazo [26], por lo tanto, se exploró. Bortezomib y radiación fraccionada produjo efectos sinérgicos (Fig. 2C). La sinergia también se observó con radiación de dosis única (Fig. S1), si bien el resultado con radiación fraccionada es más clínicamente relevante. Este efecto sinérgico sobre la muerte celular estaba mediada al menos en parte por la apoptosis; 2 Gy IR por sí solo no indujo la apoptosis, mientras que la combinación de IR y bortezomib indujo apoptosis aumentado significativamente en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solo (Fig. 2D).
inducida por la radiación deteriora la inhibición del proteasoma reparación de roturas de ADN de doble filamento al disminuir la recombinación homóloga
Dada la sinergia entre la inhibición del proteasoma y la radiación, el próximo determina si los inhibidores del proteasoma afectan ADN se rompe inducidos por la radiación de doble cadena (DSBs) [26] (Figura 3). En los ensayos de cometa neutros, células de NSCLC reparados la gran mayoría de ADN DSBs generado por irradiación de dosis alta en una hora. En contraste, el tratamiento bortezomib antes de la radiación retrasó significativamente la reparación del ADN DSBs al menos hasta 8 horas después de la irradiación (Fig. 3A-B). Esta persistencia de DSBs puede resultar en el aumento de la catástrofe mitótica [27], que se cree que es la causa predominante de muerte celular en tumores malignos sólidos irradiados.
(A) Visualización de un ensayo de cometa neutral que muestra inducida por IR DNA DSB en las células NCI-H460 1, 4 y 8 horas después de 40 Gy IR y pre-tratados con bortezomib 50 nM en comparación con el control del vehículo DMSO. (B) La cuantificación del ensayo cometa neutra a través de momentos de oliva (izquierda) y el% de ADN en la cola (derecha) en 1, 4 y 8 horas después de 40 Gy IR con y sin bortezomib 50 nM en células NCI-H460. Cada punto de datos representa 3 experimentos replicados independientes de al menos 50 células. Todos los resultados son la media ± SD de valores y P se calcularon utilizando
t
prueba de Student de dos colas. (B) ensayo indicador de GFP para la recombinación homóloga después de la inhibición del proteasoma durante 24 horas a través de bortezomib o
PSMA1
siRNA desmontables en A549 (izquierda) y NCI-H460 (derecha). Todos los resultados son la media ± SD y normalizado para el control del vehículo DMSO (Veh) o nonsilencing control de siRNA. Los valores de p se calcularon utilizando
t
prueba de Student de dos colas.
Para observar los efectos de bortezomib o desmontables de RNAi de
PSMA1
en la reparación del ADN, una reportero GFP construir para HR [28] se introdujo en células A549 y NCI-H460. En comparación con las células no tratadas, los tratados con cualquiera de bortezomib o
PSMA1
siRNA mostró una disminución estadísticamente significativa en la reparación de HR-mediada de I-
Sce
DSBs de ADN inducidas-I (Fig. 3C). Se observaron resultados similares para NHEJ (Fig. S2). Estos resultados demuestran un efecto directo de la inhibición del proteasoma sobre los mecanismos de reparación del ADN OSD, consistente con estudios anteriores [29] - [31].
Para entender el mecanismo de inhibición de recursos humanos, hemos explorado el efecto de bortezomib en la formación de focos nucleares de las proteínas clave en la ruta /HR la anemia de Fanconi (FA). IR inducida por la formación de focos RAD51 nuclear, que es un biomarcador de HR [32], se redujo sustancialmente por bortezomib o
PSMA1
RNAi (Fig. 4A, Fig. S3-S4). expresión de la proteína FANCD2 y la formación de FANCD2 enfoque IR inducida se redujeron de manera similar por el bortezomib o
PSMA1
RNAi (Fig. 4B, la Fig. S3-S4). Por último, la formación BRCA1 enfoque IR inducida se redujo significativamente por el bortezomib o
PSMA1
RNAi (Fig. 4C, Fig. S3-S4). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la inhibición del proteasoma puede afectar la reparación HR-mediada por DSB de ADN IR inducida por la reducción de la disponibilidad o el reclutamiento de proteínas clave /FA de recursos humanos para dañar sitios.
(A) Después de bortezomib × 24 horas o
PSMA1
caída × 72 horas, A549 o células NCI-H460 se irradiaron luego se fija después de 6 horas. focos RAD51 fueron detectados por inmunofluorescencia. Las células con ≥ 5 focos se calificaron como positivo (n & gt; 100). Todos los resultados son la media ± SEM. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de Student de dos colas. Las fotos muestran imágenes representativas de NCI-H460 tratados con bortezomib, bar = 10 micras. (B) Como en (A), pero para FANCD2, incluyendo transferencia de Western e inmunofluorescencia. (C) como en (a), pero para BRCA1.
La inhibición del proteasoma bloques de NF-kB inducida por la expresión de la Anemia de Fanconi /genes homólogos de recombinación
A continuación exploramos la relación entre el proteasoma la inhibición de la vía y /HR FA a través de señalización NF-kB. Dalton y colegas [33] demostraron previamente que el bortezomib disminuye la expresión de genes FA /BRCA en células de mieloma múltiple, y que NF-kB favorece la expresión transcripcional de la vía /BRCA FA. Por ejemplo, NF-kB se une directamente al promotor de
FANCD2
, basado en el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) (Fig. 5A). Un mecanismo por el que bortezomib regula a la baja la ruta de NF-KB es a través de la inhibición de la degradación mediada por proteasoma de I? B? [34]. I? B?, Que secuestra NF-kappa B en el citoplasma, y la fosforilación de I? B? Por el inhibidor de las quinasas NF-kB (IKK) libera NF-kappa B, lo que permite su entrada al núcleo [35]. Bortezomib también regula a la baja la ruta de NF-kB mediante la inducción de la translocación nuclear de I? B?, Lo que resulta en la supresión de NF-kB p65 transcripción /50 dependiente de [36].
(A) Diagrama de los promotores de NF-kB en
FANCD2 Opiniones y
BRCA1
genes. (B) Expresión de qPCR de
FANCD2
consecuencia de la inhibición del proteasoma ± 30 nm (A549) o 50 nM (NCI-H460) o bortezomib ± inducible
PSMA1
shRNA, y ± 10 Gy IR. Todos los valores están normalizados a ACTB y todos los resultados son la media ± SEM. (C) Al igual que en (B), pero con el BRCA1. (D) la supervivencia celular CPNM después de bortezomib e IR está parcialmente rescatado por
IkBα
siRNA desmontables cuando se realiza por adelantado. La viabilidad celular se ensayó usando un ensayo de ATP basados en la luminiscencia midiendo las unidades luminiscentes relativas (RLU). Todos los resultados son la media ± SEM.
Por lo tanto, tratamos de determinar si la transcripción inducida por IR de los genes /Recursos Humanos FA
FANCD2
y
BRCA1
se ve disminuida por la inhibición del proteosoma. La transcripción de
FANCD2
y
BRCA1
aumentó dentro de los 30 minutos de irradiación, y fue bloqueado sustancialmente por cualquiera de bortezomib o
PSMA1
RNAi (Fig. 5B-C). Esta escala de tiempo corto podría explicar el efecto a corto plazo en la reparación de DSB observado en el ensayo cometa. Para establecer la causalidad, se realizó un experimento de rescate en las células pretratadas con NSCLC I? B? SiRNA. Las células se sometieron a continuación a la inhibición del proteasoma y la irradiación. IkBa caída rescató radioresistance y célula de supervivencia de las células tratadas con bortezomib (Fig. 5D). Estos datos establecen un papel para los inhibidores del proteasoma como radiosensibilizadores, mediante el bloqueo de la expresión inducida por NF-kB de genes /Recursos Humanos FA (Fig. 6).
inhibición del proteosoma por el bortezomib o
PSMA1
resultados desmontables en un aumento de I? B, que a su vez disminuye NF-kB unión a los promotores de los genes /FA de recursos humanos, incluyendo
FANCD2
y
BRCA1
. Esto reduce la disponibilidad de estas proteínas de reparación del ADN para la contratación de los sitios de daño en el ADN, lo que resulta en una disminución de la formación de focos RAD51 y HR después de la inducción de ADN de doble filamento se rompe por la radiación ionizante.
La combinación de la inhibición del proteasoma y Radiación Mejora el control del tumor
a continuación trató de determinar si la inhibición del proteasoma puede ser una estrategia útil
in vivo
. La escasa presencia de bortezomib en los tumores puede limitar su eficacia en tumores sólidos [37]. Por lo tanto, si la prueba inducible
PSMA1
RNAi desmontables mejora el control de xenoinjertos tratados con radioterapia fraccionada (RT).
Para administrar fraccionado RT, se utilizó una plataforma de investigación pequeña de radiación animales (SARRP) que puede entregar guiada por TC RT conforme a los tumores en ratones [38], [39]. Esta plataforma garantiza un tratamiento completa del tumor y reducir al mínimo la irradiación de los tejidos no afectados. También facilitó evaluaciones volumétricas de crecimiento del tumor y parcialmente correlacionados (r = 0,61) con las mediciones de la pinza (Fig. 7A-B).
10
6 células NCI-H460 transfectadas con doxiciclina-inducible
PSMA1
shRNA fueron inyectados en los flancos de 6-8 semanas de edad ratones desnudos NCR. Una vez que los tumores alcanzaron un diámetro de 3 mm (día 0),
PSMA1
caída se inició con agua potable doxiciclina. Una semana más tarde, RT se inició para dar un total de cinco fracciones de 4 Gy cada dos días utilizando una plataforma de investigación pequeña de radiación animales (SARR). (A) imágenes ortogonales de una tomografía computarizada de haz cónico (TC), que se obtiene mediante el SARRP, de un ratón que lleva un xenotrasplante subcutáneo. (B) Correlación de las mediciones volumétricas tumorales utilizando el haz de cono de CT SARRP comparación con pinzas tradicionales. (C) del esquema de tratamiento. (D) Los ratones fueron seguidos posteriormente hasta que los tumores alcanzaron 2 cm de diámetro, se convirtieron en animales moribundos o durante 100 días. (E) de Kaplan-Meier se realizaron análisis con el log-rank pruebas por parejas para evaluar las diferencias en la supervivencia. Números supervivientes de cada 10 ratones por grupo en el día 100 se indican entre paréntesis. Por RT vs. RT +
PSMA1
desmontables, log rank
P = 0,0003
.
Los ratones fueron implantados con células NCI-H460 que alberga un inducible por doxiciclina
PSMA1
shRNA construir. Una semana después de la iniciación de
PSMA1
desmontables, los tumores se irradiaron a una dosis de 20 Gy en cinco fracciones. Después de los tratamientos RT,
PSMA1
caída se interrumpió, y los ratones fueron seguidos durante un máximo de 100 días después de la formación de tumores (Fig. 7C). ratones no tratados mostró rápido desarrollo de los tumores. Los ratones tratados con RT o la inducible
PSMA1
caída en las células tumorales también mostraron un crecimiento progresivo del tumor y la supervivencia de los pobres. Los ratones tratados simultáneamente con ambos tratamientos sin embargo mostraron un mínimo o ningún crecimiento de xenoinjerto y 100% de supervivencia (Fig. 7D-E). formación FANCD2 enfoque IR inducida también se redujo en las muestras de tumor mostrando inducible
PSMA1
desmontables (Fig. 8A). La reducción de estos focos pueden servir en el futuro como un biomarcador para la reducción de la activación inducida por IR de la vía /HR FA después de la inhibición del proteasoma. Aumento significativo de focos γ-H2AX IR inducida en muestras de tumores persistió a los 1, 6, y 24 horas con
PSMA1
knockdown comparación con el control, lo que indica retrasado la reparación de DSB de ADN. (Fig. 8B-C).
(A) FANCD2 inmunofluorescencia en 10 Gy irradiado vs. no irradiadas xenoinjertos NCI-H460 recuperados de ratones con o sin doxiciclina inducida
PSMA1
shRNA expresión en el tumor Células. Bar = 10 micras. (B) inmunohistoquímica γ-H2AX en los tumores de xenoinjertos NCI-H460 con o sin
PSMA1 doxiciclina inducida
shRNA desmontables, se recuperó de los ratones 1, 6, y 24 horas después de 10 Gy de irradiación. Bar = 10 micras. (C) Cuantificación de la inmunohistoquímica para γ-H2AX en (B). Las células con ≥ 5 focos se calificaron como positivo (n & gt; 400 células). Todos los resultados son la media ± SEM. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de Student de dos colas.
Los resultados dramáticos observados con
PSMA1
desmontables están en contraste con los observados previamente con bortezomib
in vivo
, incluyendo modelos de ratones genéticamente modificados (GEMM) de adenocarcinoma de pulmón [40]. Teniendo en cuenta los resultados con
PSMA1
caída, la capacidad de bortezomib para radiosensibilizar xenoinjertos NCI-H460 se examinó para determinar si puede haber un mayor efecto tumoricida con esta terapia de combinación. No hubo diferencia significativa en la supervivencia de ratones tratados con radioterapia con o sin bortezomib (Figura S5). Para determinar si esto era debido a la mala penetración del fármaco del tumor, la actividad del proteasoma de tipo quimotripsina se examinó en los tumores tratados con o sin bortezomib comparación con los tumores con o sin caída PSMA1. No había mucho más la inhibición del proteasoma tras caída PSMA1 en comparación con la siguiente bortezomib (Figura S6). Esto sugiere que la limitada eficacia observada con bortezomib
in vivo
puede estar relacionado a una mala penetración del fármaco del tumor, lo que explicaría las discrepancias en los resultados de
in vitro
y
in vivo
.
Discusión
El propósito de este estudio fue establecer un fundamento para la inhibición del proteasoma como una estrategia para el NSCLC radiosensibilización. Pensamos que ya que el ADN de doble filamento se rompe (DSBs) se correlacionan con la citotoxicidad de la radiación ionizante (IR) [26], los agentes que retrasan la reparación de estas roturas pueden actuar como radiosensibilizadores. En consecuencia, se observó una disminución en la recombinación homóloga (AR) tras la inhibición del proteosoma, importantes retrasos en la reparación de DSB de ADN tanto
in vitro
y
in vivo, España y niveles reducidos de expresión y daños inducidos-IR El sitio de localización de las proteínas de reparación del ADN. Los inhibidores del proteasoma de función, al menos en parte, mediante el bloqueo de la ruta de NF-kB al interferir con la degradación de I? B?, que inhibe la actividad aguas abajo de NF-kappa B [34], [35]. Bortezomib disminuyó la expresión inducida por IR consecuencia de la inhibición del proteasoma de la Anemia de Fanconi (FA) /genes BRCA, la mayoría de los cuales tienen putativo sitios de unión de NF-kappa B [33]. Es importante destacar que rescatamos radiosensibilidad bortezomib inducida por silenciar I? B, apoyando el mecanismo propuesto. Por lo tanto, los inhibidores del proteasoma parecen radiosensibilizar NSCLC al interferir con la reparación de DSB de ADN mediante la reducción de la expresión de genes de recursos humanos NF-kappa B-inducibles clave.
Una explicación alternativa para los efectos de la inhibición del proteasoma en la radiosensibilidad es a través de la inducción de la apoptosis . Múltiples estudios han demostrado un aumento de la apoptosis después de bortezomib tratamiento [41]. La apoptosis no se ha demostrado que la forma predominante de muerte celular en irradiado NSCLC. Por ejemplo, las dosis altas como 20 Gy de irradiación de A549 o células NCI-H460 dió tasas de apoptosis de solamente 5 a 35% [42]. células NCI-H460 tratados tanto con 2 Gy IR y bortezomib mostraron un aumento de la apoptosis en comparación con cualquiera de los tratamientos por sí solo. Es de destacar que la persistencia de RBC de ADN después de la irradiación de las células expuestas a inhibidores del proteasoma también puede a su vez contribuir a la apoptosis.
observó reducción crecimiento de xenoinjertos de NSCLC consecuencia de la inhibición del proteasoma combinada con RT. GEMM de cáncer de pulmón se pueden utilizar para confirmar el efecto en los tumores primarios de pulmón tratado
in situ
. Exploración de esto en múltiples GEMM puede tener la ventaja adicional de identificar genotipos que particularmente responden a la inhibición del proteasoma. Por ejemplo, los tumores derivados de los ratones que albergan inducible
KRAS
y
TP53 mutaciones
respondido al bortezomib, a diferencia de los tumores de los ratones mutantes con
KRAS
y de tipo salvaje
TP53
[40]. Se observaron diferencias en la supervivencia, con la eliminación del proteasoma inducible en xenoinjertos de NSCLC que expresan de tipo salvaje marcados
TP53
, que está en contraste con estos resultados. Proponemos que la combinación con la radiación puede liberar el potencial de inhibición del proteosoma a una gama más amplia de genotipos tumorales.
La adopción de los inhibidores del proteasoma en la clínica requerirá una mejora en la prestación del tumor. Bortezomib produjo relativamente poca inhibición del proteasoma en nuestros estudios de xenoinjertos en comparación con
PSMA1 doxiciclina inducida
shRNA desmontables. Estrategias que incluyen la encapsulación en liposomas, que se ha empleado con éxito para la doxorrubicina [43], o el uso de los inhibidores del proteasoma de segunda generación, como carfilzomib, marizomib o MLN9708 [44] pueden mejorar la penetración de tumores sólidos y la inhibición del proteasoma.
La resultados de la inhibición del proteasoma en pacientes con CPNM tratados sin radioterapia han sido mixtos [16], [17]. la inhibición del proteasoma se examinó con quimiorradioterapia concurrente en un ensayo de fase I de ensayos de doce pacientes [45]. En este estudio aumento de la dosis, los pacientes con enfermedad patológicamente documentado Etapa IIIA-B recibieron carboplatino y paclitaxel semanal, junto con bortezomib 0,3 a 0,7 mg /m
2 dos veces por semana, durante la radioterapia a una dosis de 61,2 Gy en 34 fracciones diarias, seguido de la resección quirúrgica. No hubo efectos tóxicos agudos imprevistos durante la quimiorradioterapia; Grado 2-3 mielosupresión era común, como era de esperar con carboplatino y paclitaxel. Sin embargo, lamentablemente, tres de nueve pacientes que fueron sometidos a resección quirúrgica murió después de la operación; dos murieron de dos a tres días después de la operación y tercera murieron 21 días después de la operación. Se concluyó que la toxicidad retardada fue grave e impredecible. Sin embargo, los tres pacientes se habían sometido a una neumonectomía derecha después de altas dosis de quimioterapia neoadyuvante. neumonectomía derecha después de la terapia neoadyuvante se ha asociado con un aumento significativo del riesgo de mortalidad, independientemente de la adición de nuevos agentes sistémicos. Por ejemplo, se ha producido una tasa de mortalidad relacionada con el tratamiento de 18% reportado después de neumonectomía derecha, en comparación con una tasa de 4% después de neumonectomía izquierda, después de la radioterapia neoadyuvante a una mediana dosis de 54 Gy con quimioterapia concurrente [46].
¿Cuál fue notable acerca de la Fase I del estudio [45] fue la alta tasa de respuesta patológica completa (pCR) observada en pacientes tratados con quimioterapia neoadyuvante incluyendo bortezomib. Las muestras de cinco de los nueve pacientes (56%) que se sometieron a resección quirúrgica mostraron una PCR y un dos adicionales mostraron 99% de necrosis. Esto se compara favorablemente con la tasa de pCR 17,7% observado en el INT-0139 después de la quimiorradioterapia neoadyuvante entre los 164 pacientes que fueron sometidos a resección [47]. Estos datos sugieren que, con cuidado, la inhibición del proteasoma puede ser útil profundizar más en combinación con quimioterapia radical, tal vez en los candidatos no quirúrgicos o para los tumores de izquierda o de otros lados que no requerirán neumonectomía derecha para la resección.
Finalmente, proteasoma inhibidores pueden beneficiarse de manera desproporcionada a los pacientes cuyos tumores se basan en la reparación HR-mediada de DSBs de ADN inducida por radiación. Por ejemplo, alto nivel de expresión de la proteína RAD51 se ha asociado con disminución de la supervivencia de los pacientes de NSCLC [48]. Asimismo, los tumores de NSCLC pobremente diferenciados tienen una mayor expresión de los genes de recursos humanos [49]. En un análisis de datos de microarrays publicados de 442 pacientes [9], los altos niveles de
RAD51
y
BRCA1
fueron cada uno asociado con una disminución de la supervivencia global (Figura S7). Estas características pueden servir como biomarcadores predictivos de respuesta a los inhibidores del proteasoma como radiosensibilizadores. Además, la reducción de DSB de ADN focos proteína de reparación inducida por la radiación, incluyendo FANCD2 y BRCA1, después del tratamiento con inhibidores del proteasoma, pueden servir como biomarcadores de respuesta en tumores tratados.
Materiales y Métodos
Reactivos
El bortezomib se adquirió de Selleck Químicos (Houston, TX). 800 poblaciones mM en DMSO se almacenaron a -20 ° C, y antes de su uso se diluyeron y se almacenaron a 4 ° C durante un máximo de una semana. Todos los tratamientos se encontraban en una concentración final de 30 nM para A549 o 50 nM para NCI-H460, a menos que se indique lo contrario. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados en las diluciones que figuran en inmunotransferencias Western: PSMA1 (ARP40417, Sistemas Aviva Biología, San Diego, CA, 1:2000), PSMB5 (BML-PW8895, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, 1:1000), FANCD2 (sc-20022, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, 1:200), vinculina (sc-25336, Santa Cruz Biotechnology, 1:1000), anti-ratón (NA931v, GE Healthcare UK Unidas, Little Chalfont, Buckinghamshire , Reino Unido, 1:3000) y anti-conejo (NA934v, GE Healthcare UK Unidas, 1:3000) peroxidasa de rábano vinculados anticuerpos secundarios. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados en las diluciones que figuran para inmunofluorescencia: BRCA1 (sc-6954, Santa Cruz Biotechnology, 1:50), RAD51 (PC-130, Merck Millipore, Billerica, MA, 1:1000), FANCD2 (sc-20022 https://array.nci.nih.gov/caarray/project/details.action?project.experiment.publicIdentifier=jacob-00182.