Extracto
Antecedentes
Cáncer /antígenos de testículo (CTA) fueron descubiertos por primera vez como dianas inmunogénicas normalmente expresados en células de la línea germinal, pero diferencialmente expresado en una variedad de cánceres humanos. En este estudio, hemos utilizado un enfoque de detección epigenética integrador para identificar los genes expresados de forma coordinada en el cáncer no microcítico de pulmón de células humanas (CPNM) cuya transcripción es impulsada por el promotor desmetilación.
Metodología /Principales conclusiones
Nuestro enfoque de detección encontraron 290 genes significativos de los más de 47.000 transcripciones incorporados en el Affymetrix Human Genome U133 Plus 2,0 array expresión. De los 55 primeros candidatos, 10 mostraron tanto la sobreexpresión diferencial y región promotora hipometilación en el CPNM. Sorprendentemente, 6 de los 10 genes descubiertos por este enfoque eran CTA. El uso de una cohorte separada del tumor primario y el tejido normal, se validó promotor NSCLC hipometilación y el aumento de expresión por RT-PCR cuantitativa para todos los 10 genes. Notamos significativa expresión conjunta, coordinada de múltiples genes diana, así como coordinado desmetilación del promotor, en un gran conjunto de tumores individuales que se asocian con el subtipo SCC del NSCLC. Además, se identificaron 2 nuevos genes diana que exhiben efectos de promoción del crecimiento en varias líneas celulares.
Conclusiones /Importancia
Coordinado desmetilación del promotor en el CPNM se asocia con la expresión aberrante de las CTA y potencial, nuevos protooncogenes candidatos que pueden ser identificados utilizando técnicas de descubrimiento de integración. Estos resultados tienen implicaciones importantes para el descubrimiento de nuevas llamadas a la acción y la inmunoterapia dirigida al antígeno CT
Visto:. Glazer CA, Smith IM, MF Ochs, Begum S, W Westra, Chang SS, et al. (2009) integrativa Descubrimiento de epigenetically derepressed cáncer Testículos Los antígenos en el CPNM. PLoS ONE 4 (12): e8189. doi: 10.1371 /journal.pone.0008189
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 18 Septiembre, 2009; Aceptado: 16 de noviembre de 2009; Publicado: 4 de diciembre 2009
Derechos de Autor © 2009 Glazer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Dra. Califano es apoyado por un Premio clínica innovador del asistente de vuelo Instituto de Investigación médica, y el Instituto Nacional del cáncer de esporas (5P50CA096784-05) y EDRN U01CA084986. El Dr. Glazer está financiado en parte por un NIH T32 Investigación Formación Grant. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
es bien sabido que los CTA se sobreexpresa en varios tipos de tumores, con poca o ninguna expresión en el tejido humano normal; sin embargo, el mecanismo de esta expresión diferencial no se entiende bien [1]. Los cambios epigenéticos incluyendo alteraciones en la metilación del promotor se han asociado con el cáncer específico diferencias de expresión en tumores malignos humanos, incluyendo el carcinoma de pulmón no microcítico (CPNM) [2], [3], [4], [5], [6], [7]. la hipermetilación del promotor principalmente se ha considerado como un mecanismo de tumor inactivación de genes supresores; sin embargo, la hipometilación genómica global ha sido reportado en casi todos los tumores [2], [4], [8], [9]. También se sabe que las CTA, especialmente las codificadas por el cromosoma X (antígenos CT-X), se expresa en asociación con el promotor desmetilación o toda la hipometilación genómica [10], [11], [12].
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, con más de 213.000 nuevos casos y 160.000 muertes en 2007; CPNM representa aproximadamente el 75% de estos casos [13]. La alta tasa de mortalidad en el CPNM es atribuible al diagnóstico en una etapa avanzada, una alta tasa de recurrencia a pesar del tratamiento locorregional definitiva, y el hecho de que no hay terapias para el cáncer de pulmón recurrente se han asociado con una mejor supervivencia a largo plazo [6].
un enfoque para mejorar la mortalidad NSCLC ha sido el desarrollo de vacunas contra el cáncer que tienen por objeto inducir una respuesta inmune del huésped contra las células tumorales. CTA son objetivos atractivos para la inmunoterapia tumoral debido a sus patrones de expresión restringida en tejidos humanos normales. Por ejemplo, NY-ESO-1 y MAGEA3 están actualmente en ensayos clínicos en varios tumores malignos humanos, incluyendo NSCLC. Los investigadores han sugerido que el uso combinado de forma coordinada expresó CTAs y otros antígenos asociados podrían ayudar en el diseño de protocolos inmunoterapéuticos más eficaces, polivalentes en NSCLC y otros tipos de tumores; Sin embargo, existe actualmente muy poco conocidos acerca de los patrones de co-expresión de estos genes [14], [15], [16].
Hasta la fecha, un enfoque integral de todo el genoma para identificar expresaron de forma coordinada CTA y otra no se ha llevado a cabo los genes expresados diferencialmente activados por el promotor desmetilación en el CPNM. En este estudio, hemos utilizado una novela, integrador enfoque de detección epigenética combinando 5-aza-desoxicitidina y tricostatina A (/TSA 5-aza) el tratamiento de las células pulmonares normales y análisis de microarrays de expresión de ARNm de tejido primario para identificar los genes que están ambos activados por hipometilación del ADN y diferencialmente regulada positivamente de manera coordinada en el CPNM. Hemos sido capaces de definir un conjunto de llamadas a la acción y novedoso expresados coordinadamente, genes que promueven el crecimiento que se activan en asociación con el promotor desmetilación coordinada. Estos datos tienen implicaciones para el mecanismo de activación de las CTA, el diseño de estrategias de inmunoterapia, así como la identificación de protooncogenes y potenciales nuevas dianas biológicas para las terapias dirigidas genes para el NSCLC.
Materiales y Métodos
histopatología
Todas las muestras fueron analizadas por el Departamento de Anatomía Patológica del hospital Johns Hopkins. Los tejidos fueron obtenidos a través de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad Johns Hopkins aprobado NA_00001911 protocolo. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada sujeto antes de la utilización de sus tejidos para investigación científica. Tumor y los tejidos pulmonares normales de especímenes quirúrgicos se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la resección quirúrgica y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. muestras normales se microdissected y ADN preparados a partir de parénquima de pulmón normal. Las muestras tumorales fueron confirmados a ser NSCLC y posteriormente microdissected para producir al menos 80% de células tumorales. ADN de tejidos y se extrajo el ARN como se describe a continuación.
TSA tratamiento de células
Se han tratado las líneas de células pulmonares humanas normales (NHBE y SAEC, Lonza, Walkersville, MD) por triplicado 5Aza-dC y con 5-aza-desoxicitidina (un análogo de la citosina que no puede ser metilado) y tricostatina a (un inhibidor de la histona desacetilasa) como se describe anteriormente [17]. Brevemente, las células se dividieron a la baja densidad (2,5 × 10
5 mm y las células placa de 6 × 10
5/100 para SAEC y NHBE respectivamente) 24 horas antes del tratamiento. Las soluciones madre de 5Aza-dC (Sigma, St. Louis, MO) y TSA (Sigma) se disolvieron en ácido acético al 50% y 100% de etanol, respectivamente. Las células fueron tratadas con 5 uM 5Aza-desoxicitidina durante 72 horas y 300 nmol /L TSA para las últimas 24 horas. expresión de línea de base fue establecido por modelo de células tratadas con el mismo volumen de ácido acético o etanol, por triplicado.
Extracción de ARN y oligonucleótidos Microarray Analysis
El ARN celular total fue aislado utilizando Trizol (Life Technologies, Gaithersburg, MD) y el kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Se realizó un análisis de microarrays de oligonucleótidos utilizando el GeneChip U133 Plus 2.0 de Affymetrix microarrays de expresión (Affymetrix, Santa Clara, CA). Las muestras se convirtieron a la etiqueta, fragmentada, cRNA por el protocolo de Affymetrix para su uso en el microarray de expresión. intensidad de la señal y la significación estadística se estableció para cada transcripción utilizando dChip versión de 2005 para analizar inicialmente y normalizar los datos de la matriz y luego análisis de la importancia microarrays (SAM) [18]. salida de SAM se calculó un valor D de 1.126 arrojó una tasa de descubrimiento y d-score falsa de corte de 5,065% y 1,885. Esto identificó un total de 12.132 genes candidatos upregulated después del tratamiento 5Aza-dC /TSA. Todos los datos de microarrays es compatible con MIAME, y los datos en bruto ha sido depositado en una base de datos compatible con MIAME, GEO, como se detalla por la Sociedad MGED.
Conjuntos de datos Públicas
Las bases de datos públicas utilizadas en este estudio fueron la secuencia de referencia (UCSC) Genoma humano de la Universidad de California en Santa Cruz y la base de datos de la anotación de la congelación de marzo de 2006 (hg18). Se obtuvieron 40 pulmonar normal y 111 NSCLC microarrays de expresión de los conjuntos de datos Expo (todos ellos realizados en la plataforma de expresión del ARNm de 2,0 Affymetrix U133 Plus) disponible en línea como parte de la Expresión Génica Omnibus (GEO /NCBI). números de acceso a estas matrices son GSE1643 y GSE3141 respectivamente. Los microarrays de tejido normal y tumoral fueron los primeros normalizado para el análisis de la COPA utilizando dChip versión 2005.
Cáncer de valores atípicos Perfil Análisis (COPA)
COPA aplica a nuestra cohorte de 151 tejidos (111 tumores, 40 normales), con cada conjunto de datos de expresión de genes que contiene 54,613 sonda fija de la plataforma de expresión del ARNm de 2,0 Affymetrix U133 Plus. En pocas palabras, los valores de expresión de genes se centran mediana, valor teórico mediana de expresión de cada gen a cero. La desviación media absoluta (MAD) y se calculó a escala en 1 dividiendo cada valor de la expresión génica por su MAD. Es de destacar que la mediana y la MAD se utilizaron para la transformación en comparación con la media y la desviación estándar de manera que los valores de expresión de valores atípicos no influyan indebidamente en las estimaciones de la distribución, y de este modo se conservan después de la normalización. Por último, los percentiles 75, 90 y 95 de los valores de expresión transformados se calculan para cada gen y luego genes se ordenaron por sus percentiles, que proporciona una lista priorizada de perfiles atípicos. A los efectos de nuestro rango-lista, el percentil 90 para los tumores se eligió basándose en el análisis de tamaño de muestra (111 tumores, 40 normals). El tejido normal que tenía un percentil 95 & gt; 2 fue eliminado de nuestra lista de rango. Un total de 35,764 transcripciones se reunió los criterios anteriores y se clasificaron. Para los detalles del método de referencia para Tomlins et. al [19].
Integrativa epigenética
Hemos clasificado los genes diana de la plataforma de expresión del ARNm de 2,0 Affymetrix U133 Plus mediante la regulación positiva de la COPA en la 90
percentil (de 111 tumores y 40 normales tejidos). La plataforma U133 Plus 2.0 mRNA expresión (Affymetrix, Santa Clara, California) cuenta con aproximadamente 55.000 conjuntos de sondas. Una segunda lista espesa fue producido por la clasificación de los genes en el orden de su puntuación de d-descendente, calculado por SAM siguientes 5-aza tratamiento /TSA de líneas de células pulmonares normales (NHBE y SAEC). Una tercera lista ranking se calcula utilizando 111 NSCLC y un conjunto de datos adicional Expo 79 tejidos tumorales adicionales primario NSCLC también se ejecutan en la plataforma de expresión del ARNm de 2,0 Affymetrix Human Genome U133 Plus. En estas 190 muestras de NSCLC primarios, hemos correlacionado BORIS patrones de expresión dentro de cada tumor con expresión de todas las transcripciones incorporados en el U133 Plus 2,0 array mediante el cálculo de un coeficiente de correlación utilizando Excel. Todos los genes fueron luego clasificados basan en la fuerza de la correlación entre su expresión y la de expresión BORIS en todas las 190 muestras. Estas tres fuentes de información (conjunto de genes que demuestra la regulación positiva con 5-aza, la puntuación de la COPA, y la correlación BORIS) se combinaron mediante el uso de un producto rango (x * y * z). Estas tres clasificaciones se combinaron para clasificar todos los objetivos y se utilizó permutación de los datos para establecer la significación con un umbral de α = 0,005, produciendo 290 genes importantes. Se obtuvieron secuencias genómicas de 122 de estos genes utilizando el genoma navegador UCSC, y la presencia de las islas CpG en los promotores o primer intrón de estos genes se determinó mediante MethPrimer que se basa en el contenido de GC de & gt; 50%, & gt; 100 pb, & gt; 0,6 observó a esperado CG de [20]
DNA Extraction
las muestras se centrifugaron y se digirieron en una solución de detergente (dodecilsulfato de sodio) y proteinasa K, para la eliminación de proteínas unido al. DNA. ADN se purificó por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. El DNA se resuspendió a continuación en 500 l de Lote (EDTA 2,5 mmol /L y Tris-HCl 10 mmol /L) y se almacenó a -80 ° C hasta su uso.
Purificación y secuenciación de bisulfito
2 ug de ADN de 28 y 11 NSCLCs tejidos pulmonares normales se sometieron a tratamiento con bisulfito usando el Kit bisulfito EpiTect® (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. se almacenó Este ADN modificado con bisulfito a -80 ° C. Posteriormente, el ADN tratado con bisulfito se amplificó usando cebadores diseñados por MethPrimer para abarcar áreas de islas CpG en el promotor o primera intrón [20]. Las secuencias de cebadores fueron diseñados para no contienen dinucleótidos CG. Primer secuencias están disponibles en la Tabla S1. Toque abajo PCR se llevó a cabo y los productos se purificaron en gel usando el kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen, Valencia, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada muestra de ADN amplificado se aplica con cebadores anidados a los Applied Biosystems 3700 analizador de ADN utilizando un tinte terminador BD (Applied Biosystems, Foster City, CA).
RT-PCR cuantitativa
El ARN total extraído como descrito anteriormente y se midió la concentración de cada muestra. a continuación, se utilizó 1 ug de ARN para la síntesis de cDNA a cabo utilizando oligo-dT con el kit Superscript de primero Strand Synthesis (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los productos de ADNc finales se utilizan como plantillas para la posterior RT-PCR con cebadores diseñados específicamente para cada gen candidato. 18s rRNA fue examinado para asegurar la cuantificación relativa precisa en RT-PCR cuantitativa. Cada experimento se realizó por triplicado usando el 7900 (ABI) en tiempo real de la máquina PCR TaqMan y el Kit de QuantiFast SYBR Green PCR (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Primer secuencias están disponibles en la Tabla S1.
cuantitativa de no metilación específica de PCR (QUMSP)
Para amplificar selectivamente regiones promotoras desmetilado en los genes de interés, cebadores fueron diseñados utilizando los datos de secuenciación de bisulfito de tumores primarios que son gratuito sólo a las secuencias de bisulfito-convertido conocidos para ser desmetilado en los tumores. combinaciones de cebadores se validaron utilizando
in vitro
metilado y demethylated controles. Estos experimentos se realizaron por triplicado usando el 7900 (ABI) en tiempo real de la máquina PCR Taqman con las curvas de calibración y normalización a cebadores de beta-actina que no contienen de CpG en la secuencia para la cuantificación. Primer secuencias están disponibles en la Tabla S1.
La transfección de vectores de expresión humanos y ensayo de crecimiento AD
A-ORF de longitud completa de cDNA de SBSN y NY-ESO-1 se obtuvieron para las transfecciones transitorias de Origene en un vector pCMV6-Entrada (Rockville, Maryland). Las líneas celulares se cultivaron en placas a 5 x 10
5 células /pocillo usando placas de 6 pocillos y se transfectaron con cualquiera de vector vacío o vector que contiene el gen de interés utilizando la 6 reactivo de transfección FuGene (Roche, Basilea, Suiza) de acuerdo con el fabricante de protocolo. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo; Rockville, Maryland) se midió la absorbancia por el Spectramax M2e 96 pocillos lector de placas de fluorescencia Molecular Devices (Sunnyvale, California). Todos los experimentos de crecimiento de AD se realizaron por triplicado para todas las líneas y vectores celulares.
independiente de anclaje Ensayo de Crecimiento
ensayos de agar blando se llevaron a cabo después de la transfección de células con vectores de expresión de mamífero pCMV6 de entrada que contiene una casete de resistencia a G418 (Origene). Las células se contaron y aproximadamente el 5000 se añadieron a cada placa de 6 pocillos. La capa inferior se compone de% de agar 0,5, RPMI + 10% de FBS, mientras que las células se suspendieron en una capa superior de 0,35% de agar, RPMI + 10% de FBS y G418 (300 ug /ml). ensayos de agar blando se incubaron a 37 grados durante 12 días. Todos los experimentos se realizaron por triplicado para todas las líneas celulares y vectores.
Análisis estadístico
Se buscaron similitudes en los patrones de metilación entre los genes mediante la realización de un análisis de las correlaciones entre las lecturas QUMSP de los genes a través de todas las muestras. pruebas de correlación de Spearman permutación se utilizó con 1000 permutaciones de las muestras para establecer significación, con α = 0,05. Para los datos de expresión, que log-transformados los datos normalizados y se realizó un análisis de correlación en todas las muestras entre cada uno de los genes en el estudio. La significación se determina suponiendo una distribución normal de los niveles de expresión de transformación logarítmica y la aplicación de la distribución t de Student con un alfa de 0,05. Todos los análisis se realizaron utilizando Matlab.
Resultados
Un nuevo enfoque epigenético Integral para la detección de las CTA y los genes relacionados con epigenetically Regulados
Hemos desarrollado un integrador, enfoque de alto rendimiento para pantalla para CTAs y otros genes expresados coordinadamente basa en tres principales factores publicados previamente: (1) CTAs se expresan en células de la línea germinal y muchos tumores, pero no en tejido somático normal [1], [21], (2) CTAs tienen promotor CpG islas que están metilados y silenciado en tejido somático normal, pero, de forma experimental, se pueden expresar por el promotor desmetilación [1], [10], [11], [12] y (3) el factor de transcripción BORIS se ha demostrado que induce de -repression de varias llamadas a la acción en NSCLC y otro tumor /tipos de tejidos (Figura 1) [22], [23], [24], [25].
(A) Representación esquemática de la estrategia de cribado epigenética integradora utilizado en este estudio que combinaba la desmetilación farmacológico de líneas celulares normales, anaylsis COPA comparativa en tejido primario y la correlación de la expresión génica con el regulador epigenético BORIS en el tejido primario. (B) COPA gráfico Representante de
MAGEA12
demostrar el enfoque estadístico utilizado para encontrar candidato sobreexpresa CTA y los genes relacionados. Diferencia en tumor frente expresión normal fue significativa, valor de p & lt; 0,00001 medido por la prueba de Mann-Whitney. (C) la regulación de la expresión de ARNm Upfold en líneas de células pulmonares normales tratados, NHBE y SAEC, según lo medido por Affymetrix Human Genome U133 Plus plataforma de expresión de ARNm de 2,0.
El primer brazo de nuestro enfoque implicó la proyección desmetilación farmacológico de 2 líneas de células de pulmón normales, normal epiteliales bronquiales humanas (NHBE) y Human pequeña vía aérea epitelial (SAEC) las células (Lonza, Walkersville, MD), utilizando un protocolo de tratamiento /TSA 5-aza que ha sido previamente éxito en la definición de candidato genes supresores de tumores por líneas de células tumorales de desmetilación. Con el entendimiento de que las CTA son silenciados por la metilación en el tejido normal, se utilizó líneas celulares normales para identificar los genes que normalmente son reprimidos en los tejidos normales, pero puede ser re-expresadas por la manipulación farmacológica. Dos líneas de células pulmonares normales, NHBE y SAEC, fueron tratadas con 5 mM desoxicitidina 5-aza durante 72 horas y tricostatina A durante 24 horas antes de la cosecha total de ARN para el análisis de expresión gama utilizando la plataforma de 2,0 expresión Affymetrix Human Genome U133 Plus. Estos resultados fueron analizados mediante dChip y análisis de la importancia microarrays (SAM) [17], [18]. Los genes se clasifican en base a su puntuación SAM (d). SAM también informó de las veces el cambio en la media de expresión de los genes diana en el grupo de tratamiento /TSA 5-aza frente al grupo control (Figura 1B).
Se analizaron simultáneamente a los datos de 40 pulmón normal y 111 expresión NSCLC microarrays de conjuntos de datos Expo (todos corren en la plataforma de expresión del ARNm de 2,0 Affymetrix Human Genome U133 Plus) a disposición del público en línea como parte de la expresión génica Omnibus (GEO /NCBI). Para nuestro análisis de estos 151 conjuntos de datos de expresión gama de tejidos primarios, se utilizó una técnica conocida como cáncer de valores atípicos Perfil Análisis (COPA). COPA es un método para buscar marcada sobreexpresión de genes particulares que se producen sólo en un subconjunto de los casos, mientras que los métodos analíticos tradicionales basados en medidas estadísticas estándar fallan para encontrar genes con este tipo de perfil de expresión [19]. COPA era un método particularmente útil para nosotros para la búsqueda de las CTA y los genes con similares perfiles de expresión basados en estudios anteriores que muestran que las CTA se expresan de forma heterogénea tanto en una población amplia de pacientes y dentro de las muestras tumorales individuales [26], [27], [28] . Los genes con una expresión normal de la COPA tejido escalados score & gt; 2 en el percentil 95 fueron eliminados de la lista espesa. Todos los restantes genes fueron clasificados en función de su puntuación de la COPA en la 90
percentil; significación estadística de las diferencias de expresión en los diagramas de la COPA se midieron por Mann-Whitney U test (Figura 1C)
.
En el brazo final de nuestro enfoque de detección, se utilizaron los datos anteriores se establece con NSCLC 111 y un adicional Expo conjunto de datos con 79 otros tejidos tumorales de NSCLC primario también se ejecutan en la plataforma de expresión del ARNm de 2,0 Affymetrix Human Genome U133 Plus. En estas 190 muestras de NSCLC primarios, hemos correlacionado BORIS patrones de expresión dentro de cada tumor con expresión de todas las transcripciones incorporados en el U133 Plus 2,0 array mediante el cálculo de un coeficiente de correlación utilizando Excel. Todos los genes fueron clasificados en función de la fuerza de la correlación entre la expresión y la de expresión de BORIS en todas las 190 muestras
.
Tres listas de rangos fueron producidas por la clasificación de los genes según puntuación de la SAM (d) después de 5-aza /TSA tratamiento en líneas celulares de pulmón normales, la puntuación de la COPA en el tejido primario, y la correlación BORIS en el tejido primario. Estos 3 listas de rango se combinaron mediante el uso de un producto de rango (x * y * z). El uso de un umbral de significación (α = 0,005) y permutaciones aleatorias posteriores de nuestras listas de rango, se identificaron 290 genes que fueron significativamente diferente Upregulated basan en la detección epigenética y los patrones de expresión de microarrays de tejidos (Tabla S2) [29].
en un principio, un
in silico
aproximación utilizando MethPrimer se utilizó para confirmar la presencia de islas CpG en las regiones promotoras de los principales candidatos [20]. Se seleccionaron los mejores 100 de los 290 genes importantes, así como 22 genes seleccionados en base a la relevancia biológica en las vías relacionadas con el cáncer que se proyectarán a través de este enfoque, y se encontraron 101 para contener 1 o más promotor islas CpG.
a continuación, utiliza una cohorte independiente de 11 tejidos pulmonares normales de los pacientes sin un diagnóstico de cáncer para confirmar el silenciamiento epigenético a través de la metilación del promotor en la mucosa normal de los pulmones de pacientes sin una neoplasia pulmonar. Se utilizó la secuenciación de bisulfito de islas CpG en las regiones promotoras de los 55 objetivos de genes seleccionados con las islas CpG para determinar el estado de metilación. Sólo 17/55 regiones promotoras demostraron metilación completa en todos los sitios CpG secuenciados en todos o casi todos los tejidos normales (Tabla S2). Estos objetivos fueron posteriormente bisulfito secuenciados en una cohorte independiente de 28 NSCLC primario para buscar la presencia de promotor de la hipometilación. De estos objetivos restantes, 10/17 mostraron promotor desmetilación de alguna fracción de tumores, incluyendo:
MAGEA3 gratis (13/28, p = 0,0067),
MAGEA12 gratis (19/28, p = 0,0001 ),
MAGEA4 gratis (9/27, p = 0,0378),
MAGEA1 gratis (21/27, p = 0,0001),
SBSN gratis (13/28, p = 0,0067),
TKTL1 gratis (5/27, p = 0,2949),
MAGEA5 gratis (9/23, p = 0,0172),
ZNF711 gratis (21/24, p = 0,0001),
NY-ESO-1 | (14/20, p = 0,0002),
G6PD gratis (17/18, p = 0,0014), (prueba exacta de Fisher, dos caras ) (Tabla 1 y Figura 2)
se muestran los resultados de la secuenciación de bisulfito con valores p asociados en 28 muestras de tumores de NSCLC y 11 tejidos pulmonares normales para:.
MAGEA3 gratis (13/28, p = 0,0067),
MAGEA12 gratis (19/28, p = 0,0001),
MAGEA4 gratis (9/27, p = 0,0378),
MAGEA1 gratis (21/27, p = 0,0001),
SBSN gratis (13/28, p = 0,0067),
TKTL1 gratis (5/27, p = 0,2949),
MAGEA5 gratis (9/23 , p = 0,0172),
ZNF711 gratis (21/24, p = 0,0001),
NY-ESO-1 | (14/20, p = 0,0002),
G6PD
(17/18, p = 0,0014). Entre paréntesis son la relación de promotores desmetilado en los tumores y los valores de p calculados por la prueba exacta de Fisher comparando desmetilación en los tumores en comparación con los normales. Las casillas sombreadas representan los promotores metilado, ND = no determinado estado de metilación mediante secuenciación de bisulfito.
transcripcional regulación positiva de genes diana después de 5-aza tratamiento /TSA en nuestro sistema de línea celular se confirmó mediante RT cuantitativa -PCR en las células normales tratados con TSA /5-aza comparación con las células tratadas de forma simulada para estos 10 genes (Figura S1). Cada gen con la excepción
MAGEA12
demostró la regulación al alza significativa por tratamiento con 5-aza /TSA en al menos una línea de células de soporte de la regulación de genes funcionales por el promotor de la hipometilación.
CTA y genes asociados son Coordinadamente y desmetilado la expresión se correlaciona con el promotor desmetilación
con el fin de confirmar los resultados de la secuenciación de bisulfito en nuestros genes diana y proporcionar un conjunto de datos de las variables continuas para expresar la condición de promotor desmetilación, ideamos un ensayo rápido, cuantitativo para medir específicamente promotores no metilados, que hemos denominado cuantitativo no metilación específica de PCR (QUMSP). Que analizaron el ADN extraído de nuestra cohorte de 28 muestras primarias de tumores de NSCLC y 11 muestras de pulmón normal de pacientes sin cáncer (Figura 3A). desmetilación específico de tumor significativa se encontró en
MAGEA3 gratis (p & lt; 0,005),
MAGEA12 gratis (p & lt; 0,025),
MAGEA4 gratis (p & lt; 0,018),
MAGEA1 gratis (p & lt; 0,001),
TKTL1 gratis (p & lt; 0,025) y
MAGEA5 gratis (p & lt; 0,007). Dos objetivos adicionales ligeramente perdido importancia en α & lt; 0,05,
SBSN gratis (p & lt; 0,07) y
NY-ESO-1 | (p & lt; 0,09) (2 colas la prueba t de Student suponiendo una varianza desigual ).
(a) QUMSP se llevó a cabo en nuestra cohorte de 28 CPNM y 11 tejidos pulmonares normales. Los experimentos se realizaron por triplicado, los valores medios se muestran representa el porcentaje de promotores no metiladas en una escala logarítmica. Estadísticamente significativa desmetilación específica del tumor fue encontrado en
MAGEA3
,
MAGEA12 gratis (p & lt; 0,025),
MAGEA4 gratis (p & lt; 0,018),
MAGEA1
(p & lt; 0,001),
TKTL1 gratis (p & lt; 0,025) y
MAGEA5 gratis (p & lt; 0,007). Dos objetivos adicionales ligeramente perdido importancia en α & lt; 0,05,
SBSN gratis (p & lt; 0,07) y
NY-ESO-1 | (p & lt; 0,09) (2 colas la prueba t de Student suponiendo varianzas desiguales ). (B) Promotor hipometilación (QUMSP) matriz de correlación de p-valor para el NSCLC (n = 28; permutación de prueba de correlación de Spearman). Las celdas sombreadas representan los valores de p significativos.
Dado el patrón desmetilación específica del tumor visto por nuestros genes diana, el próximo querían determinar si la desmetilación de las regiones promotoras de estos genes se produjo de forma coordinada dentro de muestras tumorales. Hemos utilizado la prueba de permutación de correlación de Spearman para determinar la desmetilación coordinada significativa utilizando los resultados QUMSP de nuestra cohorte de 28 NSCLC (Figura 3B). La matriz de p-valor de coeficiente de correlación de Spearman muestra que para cualquiera de los genes diana, desmetilación tendía a ocurrir de forma coordinada con un mínimo de 6 de los otros genes. Las celdas sombreadas representan los valores de p significativos. Esto ofrece evidencia de que la desmetilación está muy asociada con la regulación coordinada de estos genes diana CTA y relacionados en el CPNM, y sugiere un mecanismo epigenético de la activación.
Con el fin de confirmar la expresión específica del tumor de nuestros genes diana, se utilizó RT-PCR cuantitativa para determinar la expresión de ARNm en nuestra cohorte de NSCLC y el tejido pulmonar normal (Figura S2A-J). Seis genes habían aumentado significativamente la expresión en los tumores
MAGEA12 gratis (p & lt; 0,02),
SBSN gratis (p & lt; 0,002),
TKTL1 gratis (p & lt; 0,02),
ZNF711 gratis (p & lt; 0,008),
NY-ESO-1 | (p & lt; 0,001),
G6PD gratis (p & lt; 0,006). Tres genes perdieron poco significado en el α & lt; 0,05:
MAGEA3 gratis (p & lt; 0,09),
MAGEA4 gratis (p & lt; 0,06) y
MAGEA1 gratis (p & lt; 0,08) (2 colas la prueba t de Student suponiendo una varianza desigual).
próximo querían determinar si la desmetilación fue responsable de la desrepresión de la CTA y los genes relacionados en el CPNM. Cuatro genes diana mostraron una correlación positiva significativa entre la expresión de ARNm (RT-PCR cuantitativa) y el promotor hipometilación (QUMSP):
MAGEA12 gratis (p = 0,024),
MAGEA4 gratis (p & lt; 0,004),
SBSN gratis (p = 0,004) y
NY-ESO-1 | (p & lt; 0,004) (Figura S3 A-D) (permutación de prueba de correlación de Spearman).
TKTL1 gratis (p = 0,1),
MAGEA5 gratis (p = 0,104) y
MAGEA3 gratis (p = 0,2) también mostraron una correlación positiva entre la desmetilación y la expresión, pero se perdió significación (Tabla S3). Estos datos sugieren desmetilación de regiones promotoras es parcialmente responsable de la regulación de la mayoría de nuestros genes diana.
CTA y asociado a la diana genes se expresan Coordinadamente
Teniendo en cuenta las conclusiones de los análisis previos de nuestro cohorte de tejido primario que muestra que estos genes diana se expresan diferencialmente en los tumores, sus regiones promotoras se desmetilado coordinadamente dentro de los tumores y la expresión se correlaciona con la desmetilación, examinamos nuestra cohorte inicial de 111 tumores ensayada mediante el Affymetrix Human Genome U133 Plus mRNA 2,0 plataforma de expresión para determinar si nuestros genes diana se expresaron de forma coordinada dentro de las muestras tumorales en este gran conjunto de la muestra. La Figura 4A muestra un mapa de calor de la expresión del transcrito medida por el U133 Plus 2.0 matriz para 40 muestras de pulmón normal de pacientes sin cáncer y 111 muestras de tejido primario NSCLC. Esta figura visualiza la relación entre la expresión de los 10 genes diana en muestras normales y tumorales. Los datos se normalizaron primero mediante el establecimiento de la media y la desviación estándar de cada gen a 0 y 1 respectivamente a través de todo 151 muestras. Los datos fueron agrupados en el dominio de ejemplo utilizando la agrupación jerárquica con el promedio de vinculación y una distancia métrica euclidiana. Esto proporcionó tres grupos: 1) los 40 muestras normales, 2) 43 de las muestras de tumores 111 que muestran alta expresión en la mayoría de los genes y fuertes correlaciones entre ellos (Tumor 1), y 3) 52 de 111 muestras de tumor que muestran la expresión más baja pero con la expresión aún por encima de las normales (tumor 2). Los 16 de 111 muestras de tumores restantes no se agrupan o en estos grupos. Este análisis no sólo proporcionó la confirmación de que la expresión de nuestros genes diana se limita a un subconjunto de tumores con poca o ninguna expresión en el tejido normal, pero también, que estos objetivos parecen expresarse de forma coordinada en un gran subconjunto, 38,7%, de estos tumores.
(A) mapa de calor de la expresión del transcrito tal como se mide por la plataforma de expresión de ARNm de 2,0 Affymetrix Human Genome U133 Plus.