pruebas
Extracto
No está acumulando activado que desregula la señalización JAK se produce en una amplia variedad de tipos de cáncer . En particular, las mutaciones en JAK2 pueden dar lugar a la activación constitutiva de factores de transcripción STAT y conducir a un crecimiento oncogénico. quinasas JAK se establecen las proteínas Hsp90 cliente y aquí nos muestran que la novela pequeña molécula Hsp90 ganetespib inhibidor (anteriormente STA-9090) muestra una potente
in vitro e
in vivo
actividad en un rango de sólidos y células tumorales hematológicas que son dependientes de la actividad JAK2 para el crecimiento y la supervivencia. Es de destacar que los resultados del tratamiento ganetespib en el agotamiento sostenido de JAK2, incluyendo el constitutivamente activa JAK2
mutante V617F, con la consiguiente pérdida de actividad STAT y la expresión del gen STAT-diana reducida. En contraste, el tratamiento con las JAK-pan P6 inhibidor resultados en sólo efectos transitorios en estos procesos. una mayor diferenciación de estos modos de intervención, los estudios de expresión de ARN y proteínas muestran que ganetespib modula, además, las proteínas reguladoras del ciclo celular, mientras que P6 no lo hace. El impacto concomitante de ganetespib tanto en el crecimiento celular y la señalización de la división celular se traduce en eficacia antitumoral potente en modelos de ratón de xenoinjertos y difundió la leucemia JAK /STAT-conducido. En general, nuestros resultados apoyan la inhibición Hsp90 como un nuevo enfoque terapéutico para combatir las enfermedades que dependen de la señalización JAK /STAT, con la acción multimodal de ganetespib que demuestra ventajas sobre los inhibidores de JAK-específicos
Visto:. Proia DA, Foley KP, Korbut T, Sang J, Smith D, Bates RC, et al. (2011) Intervención múltiples por parte de la Hsp90 inhibidor Ganetespib (STA-9090) en las células cancerosas con Activado JAK /STAT de señalización. PLoS ONE 6 (4): e18552. doi: 10.1371 /journal.pone.0018552
Editor: Olivier Gires, Universidad Ludwig-Maximilians, Alemania |
Recibido: 26 Enero, 2011; Aceptado: March 4, 2011; Publicado: 14 de abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Proia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
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Conflicto de intereses:. Todos los autores son o eran empleados de Synta Pharmaceuticals, Inc. y todos, excepto RC Bates y AF Rosenberg son titulares de acciones u opciones en Synta Pharmaceuticals, Inc. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
JAK2 es un miembro de expresión ubicua de la familia quinasa asociada a Janus (JAK) de tirosina quinasas no receptoras que funcionan para mediar en la señalización aguas abajo de los receptores de citoquinas y factores de crecimiento [1]. La activación inapropiada de la señalización JAK subyace en la proliferación celular y la supervivencia en una variedad de tumores sólidos [2], [3] y neoplasias hematológicas [4]. En particular, una mutación de punto de activación en JAK2 (JAK2
V617F) se ha descrito con alta frecuencia en los trastornos mieloproliferativos crónicos (MPD) [5], [6], [7], [8], [9], [ ,,,0],10] y la activación de JAK2 constitutiva causada por translocaciones cromosómicas ha sido reportado en varios tipos de leucemia [11], [12], [13].
complejos de citoquinas JAK activados reclutar y fosforilar moléculas efectoras incluyendo transductores de señal y activadores de la transcripción (STAT) proteínas [14]. proteínas STAT median una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo el crecimiento celular, la diferenciación, la apoptosis, la inflamación y la respuesta inmune [15]. Dos STAT, en particular, STAT3 y STAT5, representan los principales sustratos para JAK2 que rigen myelopoeisis [16], [17] y pueden contribuir a la transformación celular [18], [19]. Su activación persistente se ha relacionado con la proliferación aumento de células tumorales, la supervivencia, la metástasis y la inflamación promotor de tumores en ambos tumores sólidos y hematológicos [20]. En consecuencia, la inhibición de este eje de señalización por el uso de inhibidores de moléculas pequeñas específicas de JAK2 recientemente se ha investigado como un punto de intervención terapéutica en múltiples indicaciones de tumores humanos [3], [21], [22], [23], [24] .
proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es una chaperona molecular necesario para la estabilidad después de la traducción de sus sustratos de proteína o "proteínas cliente". Las células cancerosas contienen niveles elevados de Hsp90 activo [25] y, debido a que muchas proteínas cliente desempeñan papeles críticos oncogénicos, las células cancerosas son particularmente sensibles a la inhibición de Hsp90. Por otra parte, una característica única de la orientación Hsp90 es que los resultados de inhibición en el bloqueo simultáneo de múltiples cascadas de señalización oncogénicas, la superación de posibles redundancias de la vía, y sensibilizar a las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos [26], [27], [28], [29]. Por lo tanto, Hsp90 representa una diana molecular atractivo para el desarrollo de nuevas terapias del cáncer [28], [30], [31]. De relevancia aquí, quinasas JAK se establecen clientes Hsp90 que sugieren que la inhibición de Hsp90 puede ser eficaz en el tratamiento de trastornos neoplásicos dirigidas-JAK [32], [33].
Para probar esta hipótesis, hemos empleado la molécula pequeña sintética ganetespib inhibidor (STA-9090), un compuesto que contiene resorcinol-no relacionado con geldanamicina, que se une en el dominio de unión a ATP de Hsp90. En estudios preclínicos, el fármaco ha mostrado actividad bajo nanomolar
in vitro
contra una variedad de líneas celulares de cáncer humano y eficacia antitumoral potente contra modelos de xenoinjertos humanos [34], [35]. Ganetespib está actualmente en ensayos clínicos tanto para tumores sólidos y neoplasias malignas hematológicas. Aquí mostramos que ganetespib induce potentemente la apoptosis en una variedad de líneas tumorales dependientes de la persistente JAK /STAT de señalización para el crecimiento y la supervivencia. Además, demuestran que el fármaco también altera muchos elementos de la regulación del ciclo celular en las células cancerosas, una actividad ausente de un inhibidor de JAK-específico.
In vivo
, ganetespib de coordenadas impacto tanto en el crecimiento celular y la división celular da como resultado una potente actividad antitumoral en modelos de JAK /STAT-conducido de leucemia humana. Así, la inhibición de la actividad de Hsp90 representa un enfoque prometedor para combatir las enfermedades que dependen de la señalización de JAK /STAT constitutiva, con ganetespib demostrando potenciales ventajas terapéuticas sobre los inhibidores de JAK-específicos.
Resultados
Ganetespib inhibe JAK2- mediada por la transducción de la señal y la proliferación en los cánceres hematológicos
Con baja potencia nanomolar, ganetespib reducción de la viabilidad celular en un grupo de hematológicos humanos y líneas celulares de tumores sólidos seleccionados por su dependencia de JAK /STAT de señalización y variando el tipo de cáncer (Fig. 1A). En cada una de las líneas ensayadas, ganetespib era más potente que la ansamicina Hsp90 inhibidor de 17-AAG. Es de destacar que ganetespib era mayor de 100 veces más potente que el 17-AAG en las células SET-2 y leucemia HEL92.1.7, las líneas celulares que albergan constitutivamente activas JAK2
mutaciones V617F que actúan como sus conductores oncogénicos.
(a) SET-2, HEL92.1.7, MV4-11, las células NCI-H1975 y DU145 fueron tratados con ganetespib o 17-AAG lo largo de un amplio rango de dosis (0,0001 a 1 M) durante 72 h y la viabilidad celular evaluada por Alamar La tinción con azul. (B) Ganetespib exhibe inhibición más duradera de la señalización de JAK /STAT en comparación con P6. células HEL92.1.7 se cultivaron en presencia de 250 nM o ganetespib 1000 nM P6 y se recogieron entre 0 y 48 h. Los niveles de expresión de las proteínas indicadas se determinaron por transferencia de western. (C) Ganetespib es significativamente más potente que la 17-AAG. Set-2 células fueron dosificados con las concentraciones indicadas de ganetespib o 17-AAG durante 24 horas y se analizaron para determinar JAK /STAT de proteínas y de destino utilizando los niveles de los anticuerpos indicados.
El uso de las células HEL92.1.7 , se comparó la /STAT actividad inhibidora de la JAK de ganetespib al compuesto de piridona-6 (P6) [36], a, inhibidor de pan-ATP competitivo reversible de las JAKs (Fig. 1B). Ganetespib y P6 cada señalización dependiente de JAK2 bloqueado, como lo demuestra la pérdida de fosfo-STAT3 y STAT5 fosfo-y señalización de ERK. Sin embargo, ganetespib era por lo menos cuatro veces más potente y suprimió STAT de señalización más tiempo en comparación a P6. tratamiento Ganetespib sola conducido a los dirigidos, dependiente de proteasoma (datos no mostrados) pérdida de JAK2 y los niveles de proteína fosfo-AKT (fig. 1B), ambas proteínas Hsp90 cliente. Por lo tanto, los resultados del tratamiento ganetespib en la inhibición sostenida de múltiples objetivos oncogénicos en estos modelos celulares de malignidad JAK2 impulsada. Efectos similares en la señalización de JAK /STAT se observaron con las células Set-2, en los que 50 nM ganetespib fue capaz de desestabilizar JAK2 lo suficiente como para provocar la pérdida de activado (
es decir
, fosforilada) STAT3 y STAT5 expresión (Fig. 1C ). 17-AAG mostró efectos comparables como ganetespib pero era 200 veces menos potente, de acuerdo con los datos de viabilidad descritos anteriormente. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que ganetespib posee actividad inhibidora superior de JAK /STAT tanto a P6 y 17-AAG en términos de potencia o duración de la respuesta.
Ganetespib abroga la señalización de JAK /STAT en tumores sólidos
Además de su incidencia en tumores malignos hematológicos, la activación de STAT oncogénico es también frecuente en una variedad de tumores sólidos. Por ejemplo, STAT3 persistentemente activado se encuentra en 50% de los adenocarcinomas de pulmón y se observa principalmente en los tumores que albergan mutaciones en el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) [37], [38]. La línea de células no pequeñas de cáncer de pulmón de células NCI-H1975 (CPNM) expresa la Hsp90 cliente EGFR
L858R /T790M, una forma constitutivamente activada y erlotinib resistente del EGFR, y el tratamiento ganetespib resultó en una disminución dependiente de la dosis en el EGFR expresión en estas células (Fig. 2A). Por otra parte, también indujo ganetespib potente degradación de JAK2 y la pérdida de STAT3 fosforilado en una forma dependiente de la dosis. La inactivación de AKT y GSK3, proteínas importantes en la regulación de la apoptosis, se observó con una respuesta a la dosis similar a la de la señalización /STAT3 JAK2. Recientemente se demostró que JAK2 puede modular la actividad de los reguladores de apoptosis adicionales tales como Bad y Bcl-XL para promover la supervivencia celular [21]. En consonancia con esto, hemos detectado una reducción concomitante de los niveles de Bad fosforilada (Fig. 2A), lo que reduce la actividad pro-apoptótica de esta proteína. Estos datos sugieren un mecanismo potencial para tener en cuenta la respuesta citotóxica observada con el tratamiento ganetespib (Fig. 1A).
(A) regulación a la baja de proteína de cliente en NSCLC. células NCI-H1975 se dosificaron con las concentraciones indicadas de ganetespib durante 24 h y sus lisados celulares se analizaron para determinar JAK /STAT y los niveles de proteína Hsp90 cliente utilizando los anticuerpos indicados. (B) Ganetespib bloques de IL-6 inducida y la actividad constitutiva de STAT3 en células de NSCLC. HCC827 células de cáncer de pulmón fueron tratados con concentraciones crecientes de ganetespib o P6 durante 24 h seguido por una estimulación 15 min con o sin 50 ng /ml de IL-6 humana recombinante. Los niveles de JAK2, total y fosfo-STAT3, y PIM2 se analizaron por Western blot. GAPDH se incluye como control de carga. (C) la degradación de proteínas de cliente en células de cáncer de próstata. células DU145 se dosificaron con concentraciones graduadas de ganetespib durante 24 h y lisados de células sometidas a inmunotransferencia de tipo Western para determinar JAK /STAT y apuntar a los niveles de proteína utilizando los anticuerpos indicados. (D) Hsp90 funcional se requiere para la JAK2, pero no JAK1, la estabilidad en las células DU145. DU145 células fueron tratadas con DMSO (control, C), 15 nM, 60 nM o 240 nM ganetespib durante 24 o 48 h lisados y sondeadas por Western blot con los anticuerpos indicados.
El JAK /STAT eje de señalización es un modulador clave de la señalización de citoquinas y un mecanismo propuesto para la activación de STAT3 aberrante en el cáncer de pulmón implica la regulación al alza de autocrina y /o paracrina IL-6 señalización [2]. Por lo tanto, se investigó si ganetespib podría inhibir esta señalización en las células NSCLC. En ausencia de ligando externo, las células tratadas con HCC827 ganetespib mostraron una disminución dependiente de la dosis en la expresión de JAK2, que conduce a una pérdida de actividad STAT3 y la expresión de la diana aguas abajo STAT PIM2 (Fig. 2B). la inhibición bioquímica de JAK2 por P6, aunque a concentraciones más altas, de manera similar el regulado la actividad constitutiva de STAT3, pero no influye en los niveles totales de proteína JAK2. Del mismo modo, los dos compuestos bloquean la estimulación de señalización JAK /STAT cuando la vía se activó por exógenos IL-6 tratamientos (Fig. 2B).
desregulada de IL-6 de señalización /JAK2 también se ha implicado en la tumorigénesis del cáncer de próstata [39 ], [40]. La línea celular de cáncer de próstata DU145 expresa una autocrina de IL-6 señalización de bucle [41] y, recientemente, se informó a ser sensibles a los efectos de un nuevo inhibidor de molécula pequeña JAK2
in vitro
y
in vivo
[3], [41]. Ganetespib era un potente inductor de la muerte celular en esta línea (Fig. 1A). Caracterización bioquímica de las células DU145 reveló efectos inhibitorios similares sobre la señalización de JAK2 después del tratamiento ganetespib (Fig. 2C). No se observó pérdida de JAK2, fosfo-STAT3 y fosfo-SHP2, una fosfatasa JAK2 interactuar importante para la transducción de señales JAK2, tras la adición de ganetespib. Curiosamente, la JAK1 quinasa relacionada expresado en esta línea celular no estaba destinada a la degradación, sino que pareció aumentar después de la exposición ganetespib (Fig. 2D). Se obtuvieron resultados similares para la línea celular de cáncer de próstata PC-3 (datos no mostrados). Estos datos muestran que la degradación selectiva de JAK2 en células de la próstata DU145 fue suficiente para abrogar la posterior activación de la señalización de STAT3.
inhibición Hsp90 regula a la baja la transcripción de dianas de señalización JAK /STAT y los genes del ciclo celular
En HEL92 .1.7 células de eritroleucemia, la inhibición bioquímica de JAK2 mediante tratamiento P6 dieron como resultado una pérdida de la viabilidad celular, pero con 30 veces menos potencia que ganetespib (IC
50 valores 600 frente a 20 nM) (Fig. 3A). Para comparar el impacto celular de cada inhibidor, que identificó por primera condiciones en las que la actividad JAK2 se redujo a niveles equivalentes por cada medicamento en base a sus diferencias cinéticas y potencia. Como se ilustra en la Figura 3B, el P6 4 horas (1000 nM) y ganetespib 24 horas fueron seleccionados (250 nM) tratamientos debido a los efectos comparables sobre STAT3 /5 de señalización. la expresión del ARN de perfiles en estos puntos de tiempo reveladas, como se esperaba, que muchos genes diana JAK /STAT (tales como miembros de la familia SOCS y PIM) se downregulated por ambos fármacos (Fig. S1, Tabla S1). Sin embargo, los genes adicionales fueron alterados por el tratamiento ganetespib que no se vieron afectados en las células tratadas-P6 (Fig. 3 C, D). Además de llevar a la regulación por incremento esperado de numerosos genes de las proteínas de choque térmico, el tratamiento ganetespib también alteró selectivamente la expresión de un gran conjunto de genes que participan en actividades relacionadas con el ciclo celular, incluyendo la replicación y reparación del ADN (BRCA1 /2), la regulación del ciclo celular (CDC2 , CDC25), las actividades centrosoma /husillo (BUB1 /3, CENPE /M, KIF14, FAM33A), la condensación de cromosomas (TOP2A, NCAPG), y la replicación (RFC3 /4, la familia MCM) (Fig. S1). De hecho, el análisis de los genes alterados por la agrupación jerárquica y enriquecimiento Resultado reveló que los moduladores de la división celular fueron los procesos más destacados disminuidos por el tratamiento ganetespib (Tabla 1).
(A) Efectos comparativos de ganetespib y P6 en HEL92 .1.7 viabilidad de células tumorales. HEL92.1.7 células fueron tratadas con ganetespib o P6 en un amplio rango de dosis (0,0001 a 10 uM) durante 72 h y la viabilidad celular evaluados por Alamar azul. (B) Efectos en el tiempo y dependientes de la dosis contra objetivos JAK /STAT por ganetespib y P6. HEL92.1.7 células fueron tratadas con ganetespib o P6 para 4 y 24 h y lisados de células sometidas a western blot para determinar los niveles de JAK2 /STAT y la proteína diana utilizando los anticuerpos indicados. (C) Affymetrix GeneChip análisis de las células tratadas con ganetespib y P6. células HEL92.1.7 tratadas con 250 nM ganetespib durante 24 h o 1.000 nM P6 durante 4 h. los niveles de expresión de genes en DMSO tratados (es decir, el control del vehículo) las células (eje X) se representan gráficamente frente a los de las células tratadas con fármaco (eje Y). (D) diagrama de Venn del número de genes diferencialmente regulados por ganetespib y P6.
La modulación de la expresión de proteínas del ciclo celular mediante ganetespib induce la detención del crecimiento
Para ampliar estos resultados, miramos experimentalmente a los efectos sobre el ciclo celular. Ganetespib indujo una G temporal
1 y G
arresto 2 /M en células HEL92.1.7, con la pérdida concomitante de la fase S (Fig. 4A). En contraste, el tratamiento P6 induce la acumulación de G
1 única fase, sin la pérdida de la fase S o G
2 arresto /M. También se examinaron los efectos selectivos de ganetespib sobre mediadores críticos de la división del ciclo celular a nivel de proteínas. Nos observó reducción niveles de la proteína quinasa dependiente de ciclina 1 (CDK-1), un regulador clave de la G
2 /M puesto de control, después de una exposición de 24 horas a ganetespib, un efecto que persistió hasta por lo menos 48 horas (Fig. 4B). En contraste, P6 no tuvo ningún efecto sobre la expresión de Cdk1. Además, el nivel de fosfo-Chk2, otra quinasa de control integral, se redujo mediante el tratamiento ganetespib. Se encontraron resultados similares para fosfo-Chk1 (datos no mostrados). Como se muestra en la Figura 4C, la desestabilización de las quinasas de ciclina también se asoció con una acumulación temporal de las ciclinas B1 y A1 en respuesta a la adición del fármaco. Por otra parte, no se observaron estos efectos de ganetespib en tanto la regulación JAK2 /STAT de señalización y del ciclo celular en tipos adicionales del cáncer, incluyendo cáncer de mama (MCF-7), del estroma gastrointestinal (GIST882), de páncreas (HPAF) y de próstata (DU145) líneas de células tumorales ( Fig. 4D). En general, estas influencias adicionales en la maquinaria de división celular sugieren que ganetespib posee ventajas sobre los inhibidores de JAK-específicos para el control de enfermedades malignas conducidos-STAT decidió.
(A) células HEL92.1.7 fueron tratados con 250 nM o ganetespib 1000 nM P6 (o DMSO como un control) y la distribución del ciclo celular se determina por citometría de flujo a los 3, 5, 9 y 24 h después del tratamiento. (B) las células se dosificaron con HEL92.1.7 ganetespib (250 nM) o P6 (1000 nM) durante 48 h. Las células se recogieron en los puntos de tiempo indicados y los niveles de total y fosfo-Cdk1, fosfo-Chk2 y GAPDH analizados por Western blot. (C) Cinética de efectos ganetespib en JAK /STAT y la expresión de proteínas del ciclo celular. HEL92.1.7 células fueron tratadas con 100 nM ganetespib, recolectadas en intervalos de una hora durante un transcurso de tiempo de 11 h, y están sujetas a Western blot con los anticuerpos indicados. (D) MCF-7, células GIST882, HPAF y DU145 se dosificaron con concentraciones graduadas de ganetespib para 24 h y se analizaron por transferencia de Western usando los anticuerpos indicados.
Ganetespib prolonga la supervivencia en un JAK2
modelo de ratón V617F mutante de la leucemia humana
Para determinar si estas dos actividades de ganetespib en JAK2 /STAT de señalización y la progresión del ciclo celular observaron
in vitro
se traduce en eficacia antitumoral
in vivo
, establecimos un modelo de leucemia ortotópico usando HEL92.1.7 células. Esto dio lugar a la enfermedad diseminada con una morbilidad general resultante de la parálisis de la extremidad posterior causada por metástasis de la columna vertebral (no se muestran datos). Para estudiar el efecto de ganetespib en la supervivencia, comenzando un día después de la implantación de las células tumorales, el fármaco se administró por vía intravenosa a la dosis no tóxica más alta severidad (HNSTD) de 25 mg /kg en un horario de 5 × /semana hasta el día 19. Como se muestra en la Figura 5A, el tratamiento ganetespib más del doble mediana de supervivencia global (76,5 días.
vs
34 días,
P Hotel & lt; 0,0001). El tratamiento fue bien tolerado ganetespib, sin pérdida significativa de peso corporal encontrado después de 3 semanas de tratamiento (Fig. S2). El aumento de la supervivencia de los animales tratados se correlacionaron con disminuyó drásticamente la carga de células tumorales en la médula ósea y la médula espinal, como se determina por análisis histológico (Fig. 5B).
(A) análisis de Kaplan-Meier de supervivencia global en un modelo de leucemia establecido por iv inyección de células HEL92.1.7 en ratones SCID, lo que resultó en el desarrollo de la enfermedad diseminada. Comenzando un día después de la implantación de las células tumorales, ganetespib era i.v. dosifica a su HNSTD (25 mg /kg) en un cinco veces por semana horario durante 3 semanas hasta el día 19 (n = 10 /grupo). *
P Hotel & lt; 0,0001; 2 caras prueba de log-rank. (B) Ganetespib inhibe drásticamente la carga de células tumorales en la médula espinal y la médula ósea adyacente. tinción Immunohistochemistical (H & amp; E) de secciones transversales de la columna lumbar de control del vehículo (paneles de la izquierda) o tratarse ganetespib (paneles de la derecha) los animales. Inserciones se han aumentado en los paneles inferiores. Aumento original: 40 × en los paneles superiores; 200 × en los paneles inferiores.
Ganetespib muestra una potente
in vivo
eficacia en STAT5 impulsado xenoinjertos AML
células de leucemia mieloide aguda
MV4-11 expresan la actividad constitutiva STAT5 como consecuencia de una mutación de duplicación en tándem interna (ITD) en el receptor tirosina quinasa FLT3, otra proteína Hsp90 cliente [42] y, como tal, representa un modelo alternativo de la oncogénesis STAT-conducido. Estas células son muy sensibles a ganetespib
in vitro
(Fig. 1A) y se evaluó su respuesta a la dosis para ganetespib tratamientos en xenoinjertos. Ganetespib se administró por vía intravenosa a ratones SCID portadores de tumores, ya sea en la HNSTD diaria o semanal de 25 mg /kg o 150 mg /kg, respectivamente. Como se muestra en la Figura 6A, el programa de tratamiento semanal dio como resultado la inhibición del crecimiento tumoral significativa y dependiente de la dosis, mientras que el régimen de dosificación diaria (25 mg /kg 5 × /semana, tal como se utiliza en el modelo ortotópico arriba) dio lugar a la regresión significativa del tumor ( 84%). En ambos regímenes de dosis, el crecimiento del tumor fue suprimida durante un máximo de una semana o más, una vez se interrumpió el tratamiento. Más allá de este período, como lo demuestra la cohorte de tratamiento una vez por semana, el crecimiento del tumor podría volver a iniciar.
(A) ratones SCID se implantaron subcutáneamente con MV4-11 células de leucemia mieloide aguda. Ratones portadores de xenoinjertos establecidos MV4-11 (100-200 mm
3, n = 8 ratones /grupo) fueron i.v. dosificada (puntas de flecha) con ganetespib en cualquiera de 25 o 150 mg /kg una vez por semana durante 3 semanas, o en el HNSTD de 25 mg /kg cinco veces por semana, como se indica. % T /C los valores se indican a la derecha de cada curva de crecimiento y las barras de error son los s.e.m. (B) ganetespib inhibe STAT-5 fosforilación y expresión Cdk1 en xenoinjertos de tumores en ratones SCID. ratones SCID con tumores MV4-11 (n = 4 ratones /grupo) se trataron con vehículo o ganetespib en cualquiera de 25 mg /kg o 150 mg /kg en los puntos de tiempo indicados entre 6 h y 144 h (6 días). Los tumores fueron resecados y los niveles de p-STAT5, Cdk1, Hsp70 y GAPDH fueron determinados por Western blot.
Para determinar si estas respuestas tumorales correlacionadas con la modulación de destino
in vivo
, ratones adicionales que llevan xenoinjertos de MV4-11 fueron tratados con una sola dosis de vehículo solo o ganetespib a 25 o 150 mg /kg. Los tumores se cosecharon entre 6 y 144 horas después y análisis farmacodinámico se realizó mediante el examen de los niveles de expresión de fosfo-STAT5, Cdk1 y Hsp70 (Fig. 6B). De acuerdo con el
in vivo
datos de crecimiento del tumor, no se observaron efectos dependientes de la dosis en la duración de la inhibición de destino dentro de los tumores. A 150 mg de dosis única /kg de ganetespib reprime la activación de STAT5 y suprimió la expresión de Cdk1 durante más de tres días, de acuerdo con su eficacia en la dosificación una vez por semana. A 25 mg /kg, una potente inhibición de la actividad de STAT5 se logró dentro de 6 horas como fue la pérdida de Cdk1 a las 24 horas después de la administración ganetespib. Es de destacar que la actividad STAT5 recuperó en estos tumores por las 24 horas, mientras que la expresión Cdk1 permaneció suprimida a través de al menos 48 horas incluso con esta dosis baja (Fig. 6B). Mientras que la recuperación relativamente rápida de la activación de STAT5 debería haber permitido que el tumor para reiniciar el crecimiento, la supresión más duradera de los reguladores del ciclo celular parece haber mantenido el crecimiento de los tumores detenidos hasta la siguiente dosificación de fármacos. Estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que la pérdida de las señales de crecimiento celular y la división celular orquestada por cuenta ganetespib para la potente actividad antitumoral del fármaco en este modelo de coordenadas.
Discusión
Permanente JAK /STAT de activación es oncogénico y característico de muchos tumores malignos humanos y por lo tanto proporciona un atractivo punto de intervención para la terapéutica dirigidos molecularmente. En este estudio, mostramos que ganetespib tiene actividad antitumoral profunda en una variedad de cánceres JAK /STAT-driven y, sobre todo, puede derogar la señalización aberrante a través de múltiples mecanismos. Ganetespib dirige eficazmente el regulador de aguas arriba JAK2, incluyendo el constitutivamente activa JAK2
mutante V617F, para la degradación en una gama de hematológicas y tumores sólidos tipos con pérdida prolongada subsiguiente de STAT3 y STAT5 señalización. Los resultados no sólo subrayan el papel patogénico de la señalización de STAT en la tumorigénesis, pero apoyan la utilidad terapéutica potencial de ganetespib para una variedad de cánceres humanos. A este respecto, la inhibición sostenida del eje de señalización JAK2 /STAT alcanzados por ganetespib fue más eficaz que la observada con la P6 inhibidor de pan-JAK, y ganetespib fue uniformemente más potente que la ansamicina basado Hsp90 inhibidor de 17-AAG en nuestros ensayos.
Mientras JAK2 mutación es un medio común para estimular la actividad STAT oncogénico, las perturbaciones en otras redes de señalización, tales como las mediadas por EGFR, IL-6 /IL-6R o FLT3, puede también contribuir a la señalización STAT activado en células del cáncer [2], [43]. Nuestros resultados muestran que la inhibición de Hsp90 interrumpe efectivamente estos, así, con ganetespib potentemente degradar EGFR y el bloqueo de la IL-6 y FLT3 mediada por la activación de proteínas STAT. Así, mientras ganetespib impone directamente sus efectos farmacológicos sobre Hsp90, las consecuencias aguas abajo implican claramente una matriz sustancial de proteínas cliente y las rutas bioquímicas. De esta manera, Hsp90 inhibición por ganetespib se puede ver como una modalidad multi-nodal en lugar de un enfoque terapéutico específico de diana, tal como la generada por un JAK2 u otro inhibidor de la quinasa (Figura 7).
ejerce Ganetespib potentes efectos antitumorales a través de la perturbación de múltiples cascadas de señalización, incluyendo el eje de señalización JAK /STAT y mediadores del ciclo celular. (A) La vía de JAK /STAT es un mecanismo de señalización principal de una gran variedad de citocinas y factores de crecimiento. Hiperactivación de esta vía, a través de ligandos del receptor activado por tirosina quinasas (EGFR o FLT3), receptor de citoquinas mediada por la activación de JAK2, o la activación de mutaciones tales como JAK2
V617F, se asocia a menudo con la oncogénesis. La regulación del ciclo celular implica una serie de procesos altamente coordinados y esenciales, incluyendo el control de punto de control y detección /reparación del daño genético, crítica para la progresión correcta y la división celular. (B) La inactivación de Hsp90 por resultados ganetespib en la degradación mediada por proteasoma de los componentes de señalización aguas arriba (indicado en gris) crítica para STAT, MAPK y la activación de AKT, que resulta en la inhibición del crecimiento. Además, la regulación por disminución concomitante de genes reguladores del ciclo celular clave inducidas por ganetespib (como se muestra en la Tabla 1) da lugar a la detención del ciclo celular en el G
1 y G
2 /M fases del ciclo celular, y la subsiguiente la pérdida de la fase S.
También en apoyo de esto, mientras tanto ganetespib y P6 alteran un conjunto común de objetivos JAK /STAT, único tratamiento ganetespib ejerce efectos concomitantes sobre la maquinaria reguladora del ciclo celular. En los datos presentados celulares leucémicas, la exposición a ganetespib resultó en G
1 y G
2 /M detención, en parte a través de la degradación de Cdk1 y acumulación atípica de ciclinas A1 y B1. Además, se derogó la fase S. Además de los genes asociados con la replicación del ADN y el ciclo celular, varios componentes del centrosoma y el husillo se vieron afectados en el nivel transcripcional por ganetespib, de acuerdo con hallazgos anteriores de que estos componentes se sintetizan en fase S y que Hsp90 es esencial para el montaje centrosoma [44], [45]. Es importante destacar que esta fue una respuesta general en todas las células estudiadas, como hemos observado efectos combinatorios similares en la inhibición de JAK /STAT con pérdida de la actividad de la quinasa dependiente de ciclina en la LMA, de mama, del estroma gastrointestinal, los tipos de tumores pancreáticos y de próstata.
Ganetespib también mostró potente
in vivo
actividad. En ratones con MV4-11 establecido (STAT5-driven) xenoinjertos, la administración semanal de ganetespib el crecimiento del tumor inhibió significativamente de una manera dependiente de la dosis. Por otra parte, un programa de dosificación diaria de ganetespib también fue muy eficaz y resultó en la regresión del tumor significativa durante la administración del fármaco. En este modelo, el crecimiento del tumor vuelve a aparecer alrededor de una semana después de interrumpir el tratamiento con fármacos (por la alta dosis, 1 x /semana cohorte). Es importante destacar que, nuestro análisis farmacodinámico mostró que estas respuestas tumorales correlacionan con el grado y la duración de STAT5 y Cdk1 pérdida de proteínas inducida por los regímenes de dosificación diferentes. El vínculo estrecho de STAT5 baja regulación con la inhibición del crecimiento del tumor seis horas después de la administración del fármaco en cualquiera de las dosis indica la rápida respuesta de esta vía de señalización a la administración del fármaco. Al /dosis de 150 mg kg, la señalización STAT5, pero no la expresión Cdk1, devuelto por seis días. La pérdida sostenida de Cdk1 y otras proteínas del ciclo celular, presumiblemente, mantiene la detención del ciclo celular y previene el crecimiento vuelva a ocurrir entre las dosis en el calendario semanal, incluso en presencia de la actividad STAT5 re-emergente. Del mismo modo, la expresión de Cdk1 se suprimió más tiempo en comparación con STAT5 a la dosis 25 mg /kg, y es probable que explicar la potente actividad de ganetespib en el × /semana régimen más frecuente 5. Estos datos sugieren fuertemente que la administración ganetespib a cada horario era suficiente para abolir ambas señales de supervivencia y el crecimiento celular el tiempo suficiente para prevenir el crecimiento tumoral. Debido ganetespib presumiblemente conduce a la pérdida de incluso más proteínas cliente, su potente actividad antitumoral probablemente refleja su impacto combinado sobre estas proteínas diana adicionales.
En un sistema que imita con mayor precisión la patología de la enfermedad leucémica, la eficacia de ganetespib también fue evaluado en un modelo de enfermedad diseminada usando HEL92.1.7 células. Ganetespib aumentó de manera efectiva la supervivencia en este modelo ortotópico, más del doble de la mediana de supervivencia de los ratones. supervivencia prolongada se asoció con reducido drásticamente la carga tumoral en la médula ósea, como se evidencia por una disminución significativamente la infiltración de células leucémicas humanas y la reducción de las metástasis de la columna vertebral. En conjunto, estos datos son consistentes con un efecto directo de ganetespib sobre el crecimiento celular leucémica
in vivo
y demostrar la utilidad terapéutica potencial de este compuesto para JAK2
malignidades V617F impulsada.
La relación causal entre la actividad JAK2 constitutiva y neoplasia se ha traducido en el desarrollo de una variedad de inhibidores de moléculas pequeñas potentes y selectivos JAK2 [46].