Extracto
densidad de microvasos (MVD) como un predictor de la angiogénesis es ineficiente per se en el cáncer pronóstico. Se evaluaron los valores de pronóstico de la combinación de -positivo densidad intratumoral alfa-actina de músculo liso (α-SMA) las células estromales y MVD después de la resección curativa en el carcinoma hipervascularizada hepatocelular (HCC) y cáncer de páncreas hipovascular (PC). microarrays de tejidos se construyeron a partir de 305 tumores HCC y 57 pacientes de PC sometidos a resección curativa y analizadas para α-SMA y la expresión de CD34 por inmunotinción. Se examinaron los valores de pronóstico de estas dos proteínas y otras características clinicopatológicas. Ambos baja densidad de α-SMA y alta MVD-CD34 se asociaron en el CHC con la presencia de metástasis intrahepática y la invasión microvascular, y que estaban relacionados con la participación de los ganglios linfáticos y la invasión microvascular en PC (
p Hotel & lt; 0,05) . Aunque CD34 solo, pero no α-SMA, fue un factor pronóstico independiente de supervivencia global y la supervivencia libre de recidiva, la combinación de baja α-SMA y alta CD34 fue un predictor de peor pronóstico para ambos tipos de tumores y tenía un mejor poder de para predecir la muerte del paciente y la recurrencia temprana (
p Hotel & lt; 0,01). Además, los resultados muestran que la distribución de la mayoría de las células α-SMA-positivas y las células endoteliales vasculares superponerse, mostrando importante colocalización en las paredes vasculares. integridad de los microvasos Poor, como se indica por la alta MVD, junto con la cobertura celular α-SMA-positivas perivascular baja está asociada con la recurrencia temprana, metástasis desfavorable, y la supervivencia a corto después de la resección del tumor. Este hallazgo pone de relieve la importancia de la calidad vascular en la progresión tumoral, que proporciona un complemento optimizado a la cantidad vascular en el pronóstico de los pacientes postoperatorios
Visto:. Wang WQ, Liu L, Xu HX, Luo GP, Chen T, Wu CT, et al. (2013) intratumoral α-SMA Mejora el pronóstico potencia de CD34 asociados con el mantenimiento de la integridad de los microvasos en el carcinoma hepatocelular y cáncer de páncreas. PLoS ONE 8 (8): e71189. doi: 10.1371 /journal.pone.0071189
Editor: Johannes Haybaeck, Universidad de Medicina de Graz, Austria |
Recibido: 26 Enero, 2013; Aceptado: June 27, 2013; Publicado: 5 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81172005 y 81172276), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de Shanghai (11ZR1407000), Ph.D. Fundación de los programas del Ministerio de Educación de China (20110071120096), y la Chinesisch-Deutsches Forschungsprojekt (GZ 857). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la desregulación de la angiogénesis es indispensable para la metástasis tumoral, y es una de las características del cáncer [1]. suministros neovascularización no sólo oxígeno y nutrientes a las células tumorales proliferativa pero sirve también como el conducto para la migración [2]. densidad de los microvasos (MVD) es el indicador más reconocido para evaluar la angiogénesis de tumores sólidos. La inmunotinción de un marcador vascular de las células endoteliales (CE), tales como CD34, se utiliza para etiquetar MVD [3] - [6]. Se ha informado de que MVD es un predictor adverso en varios tipos de cáncer [7], [8], incluyendo el carcinoma hepatocelular (HCC) [3], [4] y el cáncer pancreático (PC) [9]. Sin embargo, los resultados paradójicos también se han observado [10], [11].
El microambiente tumoral juega un papel esencial en la tumorigénesis y progresión. Aparte de CE vascular, fibroblastos carcinoma-asociado (CAF) es el componente celular importante en este medio [12], [13]. Sigue siendo controvertido si las células del estroma que son immunopositive para actina de músculo liso alfa (α-SMA) representan activan la CAF en los tejidos intra /peritumoral [14], [15]. A pesar de que se informó anteriormente que las células α-SMA-positivas peritumoral se correlacionan con un peor pronóstico de los pacientes con HCC [16], la potencia pronóstico de intratumoral α-SMA es una pregunta abierta. Recientemente hemos observado colocalización de α-SMA- y tinción con CD34-positivo tanto en el tejido intra y peritumoral, y creemos que la importancia del hallazgo es digno de exploración.
Recientemente, algunos estudios clínicos han puesto de manifiesto que el éxito de la monoterapia antiangiogénica es generalmente poco impresionante, con bajas tasas de respuesta objetiva y beneficios de supervivencia no significativos [17] - [19]. Otros estudios preclínicos han demostrado que antiangiogénesis inhibe el crecimiento tumoral pero acelera metástasis [20], [21]. Estos hallazgos fueron probablemente relacionados con un enfoque en la cantidad recipiente solo, dejando de lado la calidad de la vasculatura, a saber, la integridad de los microvasos (MVI). En otras palabras, la antiangiogénesis podría reducir MVD pero deteriorar MVI, lo que conduce a la metástasis [22]. En realidad, la pared vascular tumor se compone de un continuo de tipos de células, que van desde CE, las células del músculo liso vascular, y pericitos [23], de los cuales los dos últimos están clasificados como células perivasculares (PVC) [19]. Dado que MVD es un marcador sólo para CE, no puede representar la vasculatura integral. Más importante aún, hemos encontrado un patrón colocalización para α-SMA y CD34, así como marcadores adicionales de la CE descritos por otros grupos [19], [24] - [26]. Sobre esta base, la hipótesis de que la función de las células concertada α-SMA-positivas perivasculares y EC en la pared vascular es la estabilización de los vasos tumorales y la migración de las células tumorales a través de bloques intra /extravasación. Por lo tanto, una combinación de α-SMA y CD34 como marcadores predictivos (CD34
+ /α-SMA
+) podría ser útil para la evaluación de MVI. Gran parte de la evidencia acumulada sobre la MVI en el cáncer proviene de estudios preclínicos. Su importancia en la clínica, sin embargo, es desconocido.
Dos cánceres comunes y letales, que contrastan en términos de la vasculatura intra /peritumoral, son HCC y PC. Los tejidos de HCC están altamente vascularizados con menor contenido de estroma [3], mientras que los de PC son poco vascularizado pero con abundante estroma [13]. En este estudio, se realizó un análisis de la integridad vascular de estos dos tipos de tumores, que tiene una representación significativa. Hemos investigado el valor pronóstico de la α-SMA por separado y de forma combinatoria con MVD después de la resección curativa del tumor primario, inicialmente en HCC y luego en PC. Los resultados en PC confirman los encontrados en el CHC.
Materiales y Métodos
Los pacientes, muestras, seguimiento y tratamiento postoperatorio
Un total de 305 pacientes (cohorte 1, Tabla S1 S1 en en archivos) que fueron sometidos a resección hepática curativa para el CHC patología probada en el Instituto de cáncer de hígado de Zhongshan hospital de la Universidad de Fudan, fueron examinados. Ninguno de ellos ha recibido ningún tipo de tratamiento contra el cáncer preoperatorio. El seguimiento ha sido entre octubre de 2004 y noviembre de 2010, con un tiempo total de seguimiento de 72 meses. Los criterios para la resección, la recogida de muestras, la determinación del estadio del tumor y la diferenciación, y los procedimientos de seguimiento se han descrito en otra parte [27] - [29]. La supervivencia global (SG) y la supervivencia (RFS) libre de recidiva se define como el intervalo entre las fechas de la cirugía y la muerte, y entre las fechas de la cirugía y la recurrencia, respectivamente. Si se sospecha de recurrencia, la tomografía computarizada o resonancia magnética se realizó inmediatamente; si la recurrencia no había sido diagnosticado, los pacientes fueron observados hasta la muerte o el último seguimiento. En el último seguimiento del estudio, 132 pacientes tuvieron recurrencia del tumor, y 108 fueron encontrados para haber muerto. Las tasas de supervivencia a 1, 3 y 5 años fueron del 88%, 65% y 64%, respectivamente; las tasas de recurrencia más de esos mismos intervalos de tiempo fueron 25%, 42% y 43%, respectivamente.
entre enero de 2010 junio de 2011, 179 pacientes consecutivos con patología PC-probada sometidos a resección curativa en nuestro instituto, con cirugía realizada por el mismo equipo [30]. Los criterios resecables se reunieron con el National Comprehensive Cancer Network (NCCN) Guías de Práctica Clínica en Oncología-cáncer pancreático Directriz 2010 (http://www.nccn.org). De los pacientes con CP, 57 casos (cohorte 2, el cuadro S2 S1 en el archivo) recuperado al azar de una base de datos recogidos prospectivamente fueron identificados como teniendo ningún tumor residual microscópicamente observable (R0). Ninguno de ellos ha recibido ningún tipo de tratamiento contra el cáncer preoperatorio. Se recogieron los tumores enteros. Los tumores se clasifican de acuerdo al sistema de nodo metástasis tumoral (TNM) [31]. la diferenciación del tumor fue clasificado por la NCCN Orientación. la afectación ganglionar se determinó a partir diagnóstico patológico postoperatorio. Todos los pacientes fueron monitorizados hasta julio de 2012, con una mediana de seguimiento de 15,5 meses. Las modalidades de tratamiento después de la recaída se administraron también de acuerdo con la Directriz de la NCCN. Las tasas de OS y RFS se definen como anteriormente. En el último seguimiento, 33 pacientes tuvieron recurrencia del tumor, y 22 habían muerto. Las tasas de supervivencia de 0,5, 1 y 2 años fueron del 98%, 86% y 61%, respectivamente; y los 0,5-, 1- y 2 años las tasas de recurrencia y en los mismos intervalos de tiempo fueron 21%, 42% y 58%, respectivamente. Otra cohorte de pruebas independiente 3, incluyendo 52 pacientes tratados de PC en nuestro instituto, también se recogió para el estudio (Tabla S3 en Archivo S1).
Este estudio fue aprobado por los comités de ética de investigación de Zhongshan Hospital y la Fudan Universidad del Centro del cáncer de Shanghai. El consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente antes de participar en este estudio de acuerdo a las regulaciones de los dos comités.
Tissue Microarray construcción, inmunohistoquímica y la construcción de microarrays de tejidos Evaluación
(TMA) fue tan se describe [28]. En resumen, dos núcleos para la cohorte 1 y tres núcleos de cohortes 2 y 3, perforados desde cada una, tejido tumoral incluido en parafina y fijado en formalina representativa, fueron utilizados para hacer TMA diapositivas (Shanghai biochip Company Ltd, Shanghai, China). Se obtuvieron dos o tres cilindros de diferentes áreas de muestras de tumores; en consecuencia, se prepararon un total de cuatro chips de TMA para la cohorte 1 y dos chips para cohortes 2 y 3.
El marcador utilizado para PVC fue α-SMA [13], [19], y CD34 se utilizó como marcador de la CE [3], [4]. 1α factor inducible por hipoxia (HIF-1α) y anhidrasa carbónica IX (CA IX) fueron seleccionados como el biomarcador hipoxia tumoral [24], [32], [33]. Inmunohistoquímica (IHC) el análisis de estos marcadores en TMA secciones (4-m de espesor) hecho por un método de dos pasos como se describe [29]. El monoclonal primario de conejo anti-humana de anticuerpos α-SMA (1:100; Abcam, Cambridge, MA), monoclonal de ratón anti-CD34 humano (1:100; Abcam), monoclonal de conejo CA IX anti-humana (1:150; Abcam ), y anticuerpo monoclonal de ratón HIF-1α anti-humana (1:100; Sigma, St. Louis, MO) se utilizaron. La incubación con anticuerpos primarios se realizó durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda. El sistema de detección Envision-plus con un polímero anti-conejo /ratón (/EnVision + HRP /Mo, Dako, Glostrup, Dinamarca) fue empleado. Los productos de reacción se visualizaron por incubación con 3,3'-diaminobencidina. Los controles negativos se trataron de forma idéntica pero con la omisión del anticuerpo primario.
Densidad de tinción positiva en vista todo se midió utilizando un sistema de imagen computarizado compuesto de una cámara Leica de carga acoplada dispositivo, DFC500, conectado a un Leica DM IRE2 microscopio (Leica, Cambridge, Reino Unido). Imágenes de cinco campos representativos a 200 × magnificación fueron capturados por el software Leica v3 QWin Plus. Una configuración idéntica se utilizó para todas las imágenes. Para la evaluación de la densidad vascular, la integridad vascular, y la intensidad hipoxia, el área y la densidad óptica integrada (IOD) de inmunotinción en cada imagen se midieron usando Image-Pro Plus software v6.2 [28]. Los resultados se cuantificaron como α-SMA- o área CD34-positivo /área total, y HIF-1α o CA IX IOD /área total.
tinción inmunohistoquímica de secciones seriadas
quince pares (en total treinta) de las muestras tumorales y peritumoral emparejados (tejido adyacente al tumor dentro de una distancia de 10 mm) de pacientes con HCC y PC fueron recogidos y utilizados para la preparación de diapositivas de serie incluidos en parafina y tejidos congelados. La sección de diapositivas de parafina se utilizaron para la IHC de α-SMA y CD34. Ocho secciones transversales de cada muestra se sometieron a análisis cualitativo. El procedimiento de IHC se describió anteriormente [29]. Bajo × 200 aumentos, imágenes de campos de representación en la misma ubicación de las secciones de serie emparejados con tinción positiva α-SMA y CD34 fueron capturados utilizando un sistema de imagen por ordenador.
inmunofluorescencia doble tinción de α-SMA y CD34
Las secciones congeladas se utilizaron para la doble tinción de inmunofluorescencia de α-SMA y CD34. El protocolo fue como se describe [29]. Después de la reacción con los anticuerpos primarios (1:80) y posterior aclarado, las secciones se incubaron con tanto Cy3 conjugado de cabra anti-conejo y anticuerpos de cabra anti-ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (tanto 1:100; Jackson, West Grove, PA) y contrastados con 4 ', 6-dihidrocloruro diamidina-2' fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos. Imágenes representativas fueron adquiridas mediante microscopía confocal láser.
Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS 16.0. Se utilizó el chi-cuadrado de Pearson o la prueba exacta de Fisher para comparar las variables cualitativas y variables cuantitativas se analizaron mediante la prueba de
t-
prueba o Spearman. El punto de α-SMA o la densidad de CD34 para la definición de los subgrupos de corte fue el valor mediano (Fig. S1 S1 en el archivo). Las características clínico se compararon entre los dos grupos de riesgo mediante una prueba de Mann-Whitney. Para el análisis de supervivencia, las curvas de Kaplan-Meier se elaboraron, y las diferencias entre las curvas se calcularon mediante la prueba de log-rank. importancia pronóstica independiente de los factores de riesgo identificados por el análisis univariado se calculó mediante el modelo de riesgos proporcionales de Cox. se utilizó el análisis de funcionamiento del receptor característico (ROC) curva para determinar el valor predictivo entre los parámetros. Un valor de
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Los patrones de las células del estroma perivasculares α-SMA-positivas y EC Distribución
en todos los tumores recogidos, HCC siempre mostró un contenido muy bajo del estroma, mientras que PC contenía abundante estroma (Fig. 1). Representante de tinción alta y baja α-SMA /CD34 puede verse en esta figura. La densidad celular media de α-SMA-positivo para HCC fue 0,0540 ± 0,0611 (mediana de 0,0389; rango, ,000320-,563), y fue 0,232 ± 0,111 para PC (mediana, 0,202; intervalo, desde 0,0494 hasta 0,474). (Fig S1A y 1C en S1 File). Se observó una tinción específica de los vasos capilares-como por anti-CD34 en el CHC (media MVD-CD34 de 0,116 ± 0,106; mediana, 0,0877; rango, ,00102-0,545) y PC (media MVD, 0,0217 ± 0,0212; mediana, 0,0112; rango , ,00103-0,0928) (Fig. S1B y 1D en S1 archivo). Un contenido rico de microvasos se encontró en HCC, mientras que el contenido de microvasos en PC era pobre (Fig. 1). En comparación con el patrón de los vasos homogénea en el tejido del hígado o páncreas normal, peritumoral, la morfología vascular intratumoral fue heterogénea (Fig 1;.. Fig S2 en File S1). La inmunohistoquímica de secciones en serie reveló una colocalización de α-SMA y las distribuciones de tinción CD34 (Fig. 2A y 2B, 2C y 2D), y un aspecto similar se encuentra en el tejido peritumoral (Fig. S3 en S1 File). Este fenómeno fue confirmado por doble tinción de inmunofluorescencia de α-SMA y CD34, donde se observaron células α-SMA-positivas para envolver alrededor de la CE sobre las paredes vasculares (Fig. S4 en Archivo S1).
Caso 85 (HCC ) y la caja de la PC 36 mostró una alta densidad de α-SMA (A, G) y los valores MVD-CD34 (D, J); mientras que, caso HCC 226 y caja de la PC 19 mostraron baja densidad de α-SMA (B, H) y MVD (E, K) (× 200). (C, F, I, L) Densidad promedio de α-SMA y MVD grupos de alto o bajo riesgo de HCC y PC.
* Muestras independientes
t
prueba mostró una diferencia estadística entre los dos grupos.
(por pares A y B, C y D) La tinción inmunohistoquímica de secciones seriadas mostraron una expresión conjunta patrón de α-SMA y CD34 (× 200).
las correlaciones entre el tumor α-SMA-positivas densidad celular o MVD y Características clinicopatológicas
Cuando el valor de la mediana se establece como el punto de corte para α-SMA y densidades CD34, los pacientes se dividieron en subgrupos de alto o bajo riesgo (figura 1;. Fig. S1 S1 en el archivo). Como se muestra en la Tabla 1 (que se detallan en las Tablas S4 y S5 en S1 File), en HCC, los pacientes con una baja densidad de α-SMA eran propensos a tener presencia de metástasis intrahepática y la invasión microvascular, y la diferenciación bajo tumor; MVD alta se asoció con el tamaño del tumor grande, α-fetoproteína en suero de alta concentración, presencia de metástasis intrahepática y la invasión microvascular, y de la etapa alta TNM. En PC, bajo α-SMA se relaciona con alta afectación ganglionar, la invasión microvascular, la diferenciación tumoral baja, y el estadio TNM alta; MVD alta correlaciona con el tamaño del tumor de gran tamaño, tasa de afectación ganglionar linfático alta, y la presencia de invasión microvascular. En los pacientes con HCC con cirrosis (etapa 4;
n
= 72), había valores de α-SMA significativamente menor que en pacientes sin cirrosis (etapas 1 a 3;
n
= 233; 18.30 % frente a 28,95%;
p = 0,029
); MVD se distribuye por igual entre los dos subgrupos (22,88% frente a 24,34%;
p = 0,763
) guía empresas
Impacto pronóstico de un tumor α-SMA-positivas densidad celular o en MVD. postoperatoria de supervivencia y recurrencia
En el análisis univariante de HCC, el tamaño del tumor, la diferenciación del tumor, la presencia de invasión microvascular y la metástasis intrahepática y el estadio TNM se asociaron con ambos OS y RFS; antígeno positivo e de la hepatitis B también se asoció con RFS. En PC, la presencia de invasión microvascular se asoció tanto con OS y RFS; la diferenciación del tumor también se asoció con OS; y la afectación ganglionar era un factor de impacto potencial de la SSR (Tabla 2). Los valores de α-SMA, tanto de HCC y el PC no se asociaron con el sistema operativo o RFS (para el CHC:
p = 0,071
y
p = 0,079
, la figura 3A y 3B; para PC.:
p = 0,072
y
p = 0,107
, Fig. 3I y 3J). La mediana de SG y los tiempos de RFS para los pacientes con alta MVD fueron de 26,5 y 16,0 meses para el CHC, y 15,0 y 9,7 meses para PC, respectivamente. Estos períodos fueron significativamente más cortos que los de los pacientes con baja MVD (para el CHC: 57,4 y 33,1 meses, tanto
p Hotel & lt; 0,001, figura 3C y 3D; para PC:. 20,0 y 17,8 meses,
p = 0,046
y
p = 0,008
, Fig. 3K y 3L).
(A, B, I, J) La densidad de α-SMA se asoció con ninguno, ni OS RFS. (C, D, K, L) bajo MVD se correlaciona con una supervivencia prolongada y RFS. (E, F, H, N) Los pacientes en cada cohorte se clasificaron en cuatro grupos en función de su densidad intratumoral α-SMA y MVD. (G, H, O, P) Los valores predictivos de combinación de marcadores y otros factores de riesgo identificados por el análisis multivariante fueron estudiados por análisis de las características de funcionamiento del receptor (ver Resultados para más detalles). UICC, Unión Internacional contra el Cáncer
Los factores de riesgo identificados por el análisis univariado se combinaron en un análisis multivariado de riesgos proporcionales de Cox. (Tabla 2; también se indica en los cuadros S6 y S7 en S1 Archivo). Los resultados muestran que, en ambos tipos de tumores, α-SMA no es un factor de riesgo independiente de OS o RFS. MVD alta es un factor de riesgo independiente del SO (para el CHC: hazard ratio [HR] = 4,236,
p Hotel & lt; 0,001; para PC: HR = 3,578,
p = 0,018
) y de RFS (para el CHC: HR = 2,585,
p Hotel & lt; 0,001; para PC: HR = 2,230,
p = 0,034
)
Teniendo en cuenta la recurrencia. características de HCC [34], se adoptaron 24 meses ya que el valor de corte para separar precoz versus tardía de los subgrupos de la recurrencia del tumor. Por desgracia, no se encontraron diferencias entre los pacientes con alto y bajo α-SMA, ya sea en la recurrencia temprana (66 de 153 versus 89 de 152 pacientes,
p = 0,528
; Fig. S5A en Archivo S1) o recurrencia tardía (87 de 153 versus 63 de 152 pacientes,
p = 0,665
). Más pacientes con alta MVD (en comparación con los pacientes con baja MVD) tuvieron una recurrencia temprana (110 de 153 frente a 45 de 152 pacientes,
p = 0,001
; Fig. S5B en S1 de archivos) en lugar de una recurrencia tardía (43 de 153 versus 107 de 152 pacientes,
p = 0,429
). Para PC, 6 y 12 meses se establecen como valores de corte para distinguir temprana versus tardía recurrencia [35], respectivamente; en estas condiciones, no se encontraron diferencias significativas para α-SMA y MVD entre los subgrupos.
Para eliminar la influencia del tamaño del tumor en la evolución del paciente, que investigarse más a los factores pronósticos en el HCC-subgrupo pequeño tumor (máximo diámetro de ≤ 5 cm,
n
= 179); en el PC, el tamaño del tumor no se correlacionó con el sistema operativo o RFS. Los valores MVD se asociaron con OS y RFS (
p Hotel & lt; 0,001 y
p = 0,001
, respectivamente) en este subgrupo; mientras que, α-SMA estaba relacionada con ninguno de SO ni RFS (
p = 0,520
y
p = 0,153
, respectivamente; Fig. S6A a 6D en S1 Archivo). correlaciones detalladas de otros factores con el resultado del paciente para el HCC subgrupo pequeño de tumor se resumen en la Tabla S8 en S1 Archivo.
Valor pronóstico de la combinación de la densidad celular α-SMA-positivas y Análisis MVD y la República de China
los pacientes del estudio fueron divididos en cuatro grupos de acuerdo a sus valores de densidad intratumoral y MVD α-SMA: grupo I (CHC /PC:
n
= 68/14), α-SMA y baja MVD baja; el grupo II (CHC /PC:
n
= 84/15), α-SMA alta y baja MVD; el grupo III (CHC /PC:
n
= 86/13), bajo α-SMA y alta MVD; y el grupo IV (CHC /PC:
n
= 67/15), α-SMA alta y alta MVD (ver Tabla S9 en el Archivo S1, las características clínico-patológicas detalladas de pacientes de diferentes subgrupos de α-SMA y MVD). análisis pronóstico mostró diferencias significativas en las tasas de SG (
p Hotel & lt; 0,001 y
p = 0,026
para el CHC y PC, respectivamente) y las tasas de RFS (
p Hotel & lt; 0,001 para ambos) entre los cuatro grupos combinacionales (Tabla 2). En HCC cohorte 1, las tasas de SG y RFS 5 años fueron del 88,1% y 70,2%, respectivamente, para el grupo II; pero sólo 38,4% y 44,2%, respectivamente, para el grupo III (Fig. 3E y 3F). En la cohorte 2 PC, las tasas de SG y RFS 2 años fueron del 100% y 86,7%, respectivamente, para el grupo II; pero sólo eran 40,0% y 15,4%, respectivamente, para el grupo III (Fig. 3 M y 3 N). Los resultados del análisis multivariado mostró que la combinación de la densidad de α-SMA y MVD fue un factor pronóstico independiente para el sistema operativo y la SSR (Tabla 2 y los cuadros S6 y S7 en S1 Archivo). Un resultado similar se encontró en la recurrencia del CHC temprano (Fig. S5C en Archivo S1) y subgrupos HCC pequeña tumorales (Fig. S6E y 6F, y en la Tabla S8 en S1 de archivos), y se confirmó en la cohorte de prueba de PC independiente 3 ( . Fig. 4)
se adoptaron los factores de riesgo identificados por el análisis multivariado y la combinación de α-SMA y MVD, y sus valores predictivos se determinaron mediante análisis ROC (Tabla 3; se detalla en los cuadros y S10 S11 en S1 File). Tumor MVD predijo la muerte y recurrencia (
p Hotel & lt; 0,05). A pesar de α-SMA predijo ni la muerte ni la recurrencia, la combinación de α-SMA y MVD muerte predijo con precisión y recurrencia temprana (
p Hotel & lt; 0,01 para todos). Excepto por el estadio TNM y la recurrencia en el CHC, y para la diferenciación del tumor y la muerte en el PC, el valor predictivo de la combinación de α-SMA y MVD fue mayor que otros factores. Cuando el valor de corte se estableció como el grupo III (con baja α-SMA y alta MVD) frente a otros grupos de tres, el valor predictivo negativo, valor predictivo positivo, la sensibilidad y la especificidad de HCC cohorte 1 fueron 0,749, 0,616, 0,491, 0,832 para el sistema operativo y 0,616, 0,558, 0,364, 0,780 para la SSR y la cohorte de PC 2 fueron 0,690, 0,600, 0,409, 0,829 y 0,476 para el sistema operativo, 0,733, 0,333, 0,833 para la RFS, respectivamente. Las áreas bajo la curva de esta combinación fueron 0,743 /0,758 (CHC /PC) para la muerte (
p Hotel & lt; 0,001 y
p = 0,001
, respectivamente) y 0,615 /0,790 (CHC /PC) para la recurrencia (
p = 0,001
y
p Hotel & lt;.. 0,001, respectivamente) (figura 3G, 3H, 3O y 3P) guía empresas
la intensidad de HIF-1α y CA IX Expresión en subgrupos de diferentes MVI
los valores de HIF-1α y CA IX se utiliza como indicador de la hipoxia tumoral, y sus intensidades fueron divididos en cuatro grupos de acuerdo a la combinación de a-SMA y MVD. El HIF-1α o CA IX densidad media fue mayor para el grupo I y combinatoria más pequeño para el grupo IV en el CHC cohorte 1 y PC cohorte de análisis 2 (unidireccional de la varianza,
p Hotel & lt; 0,001 y
p = 0,008
de HIF-1α, y
p = 0,012
y
p Hotel & lt; 0,001 para CA IX, respectivamente; Fig. 5). En comparación con el grupo I, el HIF-1α o CA IX del grupo II fue significativamente menor; en comparación con el grupo III, HIF-1α o CA IX del grupo IV también fue menor (ambos
p Hotel & lt; 0,05).
El indicador de la hipoxia tumoral se HIF-1α y CA IX, y sus intensidades se dividieron en cuatro grupos, como se describe. La densidad de HIF-1α o CA IX fue mayor en el grupo I y la más baja en el grupo IV para ambos (A) El carcinoma hepatocelular (HCC) cohorte 1, y (B) el cáncer de páncreas (PC) cohorte 2; (
p Hotel & lt; 0,001 y
p = 0,008
de HIF-1α, y
p = 0,012
y
p Hotel & lt; 0,001 para CA IX , respectivamente).
* En comparación con el grupo I., y
** en comparación con el grupo III; ambos
p Hotel & lt; 0,05. IOD, la densidad óptica integrada.
Discusión
En el presente estudio, hemos encontrado que una baja densidad celular intratumoral α-SMA-positivas, junto con los valores altos MVD-CD34, está asociado de forma significativa con una alta incidencia de trombosis tumoral intravascular y pobre supervivencia después de la resección del HCC. De estos dos marcadores, solamente MVD es un factor pronóstico independiente; sin embargo, la combinación de los dos tiene un mayor poder de predecir la muerte del paciente y la recurrencia temprana. Además, nuestro trabajo revela que la localización de la mayoría de las células α-SMA-positivas perivasculares y ECs se superpone sobre las paredes vasculares, y no es mayor que 80% colocalización en el intersticio del tumor. Este hallazgo también se observó en PC y una cohorte independiente de prueba PC. Por lo tanto, proponemos que una combinación de α-SMA y MVD puede, en parte, ser un buen indicador de la MVI (CD34
+ /α-SMA
+); que MVI es más crítico que MVD solo en el desarrollo de la invasión microvascular; MVI y que es fundamental para comprender los posibles nuevos mecanismos subyacentes de la antiangiogénesis como un acelerador de la metástasis tumoral.
Una reconocida marca CE es humano CD34. Ha habido informes en un modelo de ratón que a-SMA y CD31 de un marcador CE pueden coexpress en las paredes vasculares [24], [26]; sin embargo, esto no está clara en humanos. Nuestro trabajo confirma este patrón de co-expresión α-SMA y CD34 (véase el diagrama esquemático en la Fig. S7 en S1 Archivo). Esas células α-SMA-positivas perivasculares que se envuelven alrededor ECs fueron identificados como los PVC, y se utilizó la densidad de PVC como un indicador de MVI. Antes de este estudio, un gran desafío era seleccionar un marcador molecular apropiado de los PVC. Expresión de ha sido reportado en PVCs varios marcadores; es decir, NG2, derivado de plaquetas factor de crecimiento receptor-beta (PDGFRß), α-SMA, desmina, y RGS5 [23], y su expresión podría ser específica de tejido. A pesar de algunos marcadores de PVC de HCC y el PC después de haber sido identificados en experimentos con animales [25], [26], [36], [37], el estudio de su expresión en biopsias humanas ha sido en gran parte inexplorado. Nuestros resultados sugieren que α-SMA es un marcador adecuado para MVI, debido a su tasa-tinción positiva y expresión colocalized con CD34. Por lo tanto, nuestros hallazgos establecen que es un marcador de PVC. Esto es consistente con Feig et al. [13] que se considera que los fibroblastos del estroma a-SMA-positivas probablemente podría representar PVC. Para aunque NG2 podría ser teñidas positivamente en muestras de ratón [38], la investigación de la misma y otras moléculas de predicción fueron fallidos en los tejidos humanos recogidos en nuestro instituto (ver Fig. S8 en File S1).
Nuestros resultados también demuestran que en pacientes con MVD alta tumor, siempre que su MVI también es alta, la probabilidad de metástasis podría ser baja, y en este caso, el pronóstico estaría bien. Por el contrario, el pronóstico podría ser pobre para los pacientes con baja MVD y también bajo la MVI. Pobre integridad de los vasos ofrece numerosas posibilidades para las células tumorales intra /extravasación de la arquitectura vascular con fugas, y esas células podrían trasplantar en órganos diana, dando lugar a metástasis. Lo que hace que empeorar las cosas es que en áreas de colapso vascular, que surgen de una mala cobertura de PVC, reducido drásticamente la perfusión sanguínea tumor podría resultar y producir hipoxia regional [19]. Las células tumorales hipoxia dotado resultantes tendrían propiedades migratorias e invasivas a través de la transición epitelio-mesénquima inducida por HIF-1α [22], [32], [39]. Esta situación crearía un ambiente hostil tumor donde estas células podrían fácilmente invadir a través de los vasos anormales y formar trombos tumor. Esta hipótesis está apoyada por un excelente estudio que muestra que el agotamiento de los pericitos provoca la hipoxia tumoral y la metástasis [22], y por nuestro estudio anterior muestra que el aumento de la MVI alivia la hipoxia e inhibe la metástasis [38]. Estos hallazgos son consistentes con nuestras observaciones clínicas. El presente trabajo examina también la hipoxia HIF-1α biomarcadores y las intensidades CA IX de acuerdo con grupos marcadores diferentes combinatorias de MVI, y encontramos su efecto, presenta una distribución del gradiente. En ambos grupos de bajos MVD I y II, y en ambos grupos MVD altas III y IV, la mayor MVI se correlaciona con una menor HIF-1α y CA IX. ¿Cómo se regula la MVI no está claro. Mazzone et al. informaron que la hipoxia y la 1α HIF-proteína PHD2 /-2α asociado-pudiera dañar MVI [24], y se ha encontrado que la orientación de genes de
PhD2
resultado en una mayor MVI y la mejora de la respuesta del tumor a la quimioterapia [40 ]. Esta última observación sugiere que MVI podría ser regulada por la hipoxia /HIF-1α través de una vía de realimentación. Sin embargo, no tenemos un valor pronóstico independiente de PVC marcados por α-SMA, que es diferente de los resultados de Cooke y sus colegas [22]. Las posibles razones de esta diferencia podría ser la heterogeneidad de diversos tumores, o la posible falta de especificidad de α-SMA. Nuestros resultados implican que el examen de los PVC por sí sola es insuficiente; el punto clave, más bien, radica en la asociación de PVC con EC.
Recientes datos emergentes, tanto de nuestro grupo y otros, se ha puesto de manifiesto que el factor de crecimiento endotelial vascular o receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) por bloqueo sorafenib o sunitinib conduce a la metástasis mejorado [20], [21], [41]. Hay algunas ideas sobre el mecanismo de este fenómeno, pero todavía no se entiende completamente. Especulamos que probablemente se deba a objetivos antiangiogénicos tanto de la CE y de PVC, como sunitinib puede bloquear VEGFR2 y PDGFR [42]. Sin embargo, los resultados fueron inconsistentes. Tabla S4. Figura S2. Figura S3. Figura S4. Figura S5. Figura S6. Figura S7. Figura S8.