Extracto
líneas celulares de cáncer canino progresivamente se han desarrollado, pero todavía están infrautilizados los recursos para la investigación de biología de la radiación. La medición de la radiosensibilidad intrínseca celular es importante porque la comprensión de la diferencia puede proporcionar un marco para dilucidar aún más los perfiles para la predicción de la respuesta a la terapia de radiación. Nuestros estudios se han centrado en la caracterización de diversas líneas celulares de cáncer canino
in vitro
y la comprensión de los parámetros que podrían contribuir a la radiosensibilidad intrínseca. En primer lugar, se determinó la radiosensibilidad intrínseca de 27 líneas celulares de cáncer de canino derivados de diez tipos de tumores usando un ensayo clonogénico. Las 27 líneas de células habían variando radiosensitivities sin importar el tipo de tumor (fracción de supervivencia a 2 Gy, SF2 = 0,19-0,93). Con el fin de entender los parámetros que podrían contribuir a la radiosensibilidad intrínseca, se evaluaron las relaciones de radiosensibilidad celular con características celulares básicas de las líneas celulares. No hubo correlación significativa de SF2 con fracción de la fase S, tiempo de duplicación, el número de cromosomas, ploidía, o el número de cromosomas metacéntricas, mientras que hubo una correlación estadísticamente significativa entre SF2 y la eficiencia de la siembra. A continuación, se seleccionaron las cinco líneas celulares más radiosensibles como el grupo sensible a la radiación y las cinco líneas celulares más radioresistant como el grupo resistente a la radiación. A continuación, se evaluaron parámetros conocidos para la muerte celular por la radiación ionizante, incluyendo doble vertiente romper la reparación del ADN inducido por radiación (OSD) y la apoptosis, en el grupo sensible a la radiación, en comparación con el grupo resistente a la radiación. Los altos niveles de focos residual γ-H2AX en los sitios de DSBs estaban presentes en el cuatro de las cinco líneas celulares de cáncer de canino radiosensibles. Nuestros estudios sugieren que existen diferencias sustanciales en la radiosensibilidad intrínseca en líneas celulares de cáncer canino, y la reparación de DSB inducidas por la radiación que está relacionada con la radiosensibilidad, que es consistente con estudios humanos anteriores. Estos datos pueden ayudar a nuevas investigaciones que se centran en la detección de OSD para predecir la respuesta individual a la terapia de radiación para los perros, independientemente del tipo de tumor
Visto:. J Maeda, Froning CE, Brents CA, Rose BJ, Thamm DH, Kato TA (2016) intrínseca radiosensibilidad celular y caracterización de 27 líneas celulares de cáncer canino. PLoS ONE 11 (6): e0156689. doi: 10.1371 /journal.pone.0156689
Editor: Ying-Jan Wang, de la Universidad Nacional Cheng Kung, Taiwán
Recibido: 14 Enero de 2016; Aceptado: 18-may de 2016; Publicado: Junio del 3, 2016
Derechos de Autor © 2016 Maeda et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. la financiación fue proporcionada por el Dr. Akiko Ueno Fondo Radiobiología (TAK). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es una causa importante de muerte en los perros, así como en los seres humanos. cánceres humanos y caninos tienen características similares, no sólo en el aspecto anatómico e histopatológico, sino también el comportamiento biológico, la genética del tumor y la respuesta a las terapias convencionales [1, 2]. modelos de cáncer caninos han surgido como recursos valiosos en el estudio de cáncer humano [2]. En la investigación del cáncer humano, numerosas líneas celulares de cáncer humano bien caracterizados están disponibles para la investigación del cáncer. líneas celulares de cáncer han sido ampliamente utilizados como
in vitro
sistemas de modelos experimentales in y han demostrado ser útiles para explorar la biología subyacente de cáncer [3]. líneas celulares de cáncer canina progresivamente se han desarrollado y utilizado, pero no son tan completamente caracterizado como líneas celulares humanas. La investigación de la biología celular a través de caracterizaciones de líneas celulares de cáncer canino puede proporcionar información adicional acerca de la biología del cáncer, algunos específicos de los perros, y algunos potencialmente completen las reportadas para el cáncer humano.
Los tumores incluso con un mismo origen histopatológico pueden mostrar una amplia gama de sensibilidad a la terapia de radiación [4, 5]. La medición de la radiosensibilidad intrínseca celular es importante porque la comprensión de la diferencia puede proporcionar un marco para dilucidar aún más los perfiles para la predicción de la respuesta de la radioterapia (RT). radiosensitivities intrínseca medida por
in vitro
ensayos de formación de colonias se expresan como SF2, la fracción de células supervivientes de una dosis única 2 Gy de radiación (IR) ionizante. La dosis de 2 Gy es también una dosis utilizada comúnmente por fracción en RT clínico en seres humanos. El SF2 en humanos se ha demostrado predecir la respuesta tumoral
in vivo
en estudios anteriores [6, 7]. Tales estudios han sugerido que existen diferencias en la radiosensibilidad intrínseca y la comprensión de los mecanismos podría afectar significativamente la práctica para RT personalizada [4, 5].
Los mecanismos que subyacen a las diferencias en la radiosensibilidad intrínseca de las células tumorales es probablemente multifactorial [5] . Reparación del ADN de doble filamento se rompe (DSBs) es conocido como uno de los elementos más importantes que determinan la radiosensibilidad intrínseca debido a que estas lesiones, si sin reparar, conducen a la muerte celular [8]. Anteriormente, la distribución de las células en las fases del ciclo celular y el contenido /cromosoma de ADN se han sugerido como factores que pueden afectar la radiosensibilidad intrínseca de las células tumorales [9, 10]. Además, parte de las diferencias puede ser atribuible a la tendencia a sufrir apoptosis en respuesta a la radiación como se ve en tumores linfoides [11]. Sin embargo, se ha informado de correlaciones inconsistentes con la radiosensibilidad de las células tumorales humanas en la medición de estos parámetros, y el establecimiento de un ensayo útil que predice radiosensibilidad intrínseca es todavía bajo investigación [4].
Nuestros estudios se han centrado en la caracterización diversas líneas celulares de cáncer canino
in vitro
y la comprensión de los parámetros que podrían contribuir a la radiosensibilidad intrínseca. Esta caracterización básica puede proporcionar información de estas líneas celulares para la investigación adicional en la predicción de la respuesta de la radioterapia. Examinamos la radiosensibilidad intrínseca de 27 líneas celulares de cáncer canino derivadas de diez tipos de tumores. Cada línea celular se caracteriza por una combinación de datos que representan la distribución del ciclo celular, tiempo de duplicación celular, el número de cromosomas, patrón de ploidía del ADN y de las planchas eficiencia. Los parámetros conocidos que incluyen la eficiencia de reparación de DSB de DNA y la apoptosis siguientes exposición a la radiación ionizante se evaluaron entre las líneas celulares radiosensibles y radioresistant seleccionados.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
El 27 canina líneas celulares tumorales fueron amablemente suministrados por el Centro de cáncer de Flint Animal de la Universidad del Estado de Colorado (Fort Collins, CO, EE.UU.) (Tabla 1) [12]. líneas de células tumorales adhesivo se cultivaron en medio esencial mínimo (MEM /EBSS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 1% de vitaminas MEM, no aminoácidos esenciales, piruvato de sodio, penicilina, estreptomicina y Fungizone. las células tumorales en suspensión se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco Life Technologies) suplementado con el mismo que el MEM. Las líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en un incubador humidificado con un 95% de aire y 5% de CO
2.
Proliferación Celular
Con el fin de determinar los tiempos de duplicación de las líneas de células, las células se sembraron en placa a diferentes concentraciones en placas de cultivo de 35 mm. Las células se incubaron a 37 ° C. El número de células se contó cada 24 horas utilizando un contador Coulter Z1 (Beckman Coulter, La Brea, CA). tiempos de duplicación celular se calcularon utilizando el software Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Al menos tres experimentos independientes se llevaron a cabo.
número de cromosomas
Las células fueron cultivadas con 0,1 mg /ml colcemid (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 6 horas con el fin de cosechar los cromosomas en metafase. Las muestras se trataron en una solución hipotónica de KCl 75 mM durante 20 minutos a 37 ° C y se fijaron en 3: 1 (metanol: ácido acético) solución de fijación tres veces. metafase para untar se tiñeron con solución de Giemsa, y se observó el número de cromosomas en un microscopio Axioplan (Carl Zeiss, Jena, Alemania). Un mínimo de 100 células en metafase se analizaron para contar los cromosomas por célula. Se analizaron al menos 50 células en metafase para contar los cromosomas por célula metacéntricas.
Análisis de Ciclo Celular
Los cultivos de células en un 60% a un 70% de confluencia fueron fijadas en etanol al 70% a -20 ° C durante la noche o más largo. Las células se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 minutos y se lavaron una vez con PBS. Las células se resuspendieron en 1 ml de solución de tinción (20 mg /ml de yoduro de propidio, 0,1% Triton X-100, 500 g /ml de RNasa A) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. El análisis se realizó utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur con la célula de Quest Pro (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) y el software ModFit LT (Verity, Topsham, ME). Tres experimentos independientes con cada línea celular se llevaron a cabo. Ploidía se estimó como el contenido de ADN de las células G1 en las células tumorales se normalizaron a las células de ovario de hámster chino diploides.
La irradiación
cultivos en fase logarítmica se irradiaron con diferentes dosis de
137Cs gamma rayos utilizando un modelo JL Pastor Mark I-68 nominal de 6000 Ci
137Cs irradiador (JL Shepard, Carlsbad, CA), entregado en aproximadamente 2,5 Gy /min a temperatura ambiente.
Clonigénicas Ensayo de Supervivencia
radiosensibilidad se midió mediante el ensayo clonogénico de líneas celulares nonsuspension. Células que se dividen al azar en T-12.5 frascos fueron irradiados, tripsina y se sembraron por triplicado en placas de cultivo de 100 mm o de 60 mm a una densidad celular apropiada. Después de incubar durante 1-2 semanas para permitir la formación de colonias, los platos se lavaron con 0,9% de NaCl, se fijaron con etanol al 100% y se tiñeron por 0,1% de cristal violeta. Cada colonia formada por más de 50 células se anotó como un sobreviviente. Al menos tres experimentos independientes se llevaron a cabo, a continuación, las curvas de supervivencia se extrajeron utilizando ecuaciones de regresión lineal-cuadrática con el software Prism 5. La fracción de supervivencia a 2 Gy de radiación (SF2) y la fracción de supervivencia a los 5 Gy de radiación (SF5) se obtuvieron por interpolación de la supervivencia celular como estimaciones de la radiosensibilidad intrínseca de cada línea celular
.
Para los cultivos en suspensión, una se usó un ensayo de dilución limitante como se utiliza anteriormente en líneas celulares de cáncer humano [13, 14]. Las células se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos a densidades de 1-200 células por pocillo en dos o tres densidades de células por punto de dosis. Después de la irradiación, las placas se incubaron a 37 ° C durante 2-3 semanas antes de anotar como negativo o positivo para el crecimiento basado en el examen microscópico (es decir pocillos en los que había tenido lugar el crecimiento celular son positivos). Sobre la base de la distribución de Poisson, fracciones de supervivencia se calcularon como se describe anteriormente [15].
γ-H2AX focos en las células irradiadas G1-
inducción de, y DSB de ADN residual por infrarrojos se evaluaron
using el ensayo de γ-H2AX. Se llevó a cabo el ensayo con células sincronizadas y mantenidos en G1 durante la irradiación utilizando el método de isoleucina privación [16]. Esto se hizo porque las células no irradiadas en la fase S tienen niveles mucho más altos de focos γ-H2AX, y también porque el número de focos por célula depende de contenido de ADN [17]. Las células se cultivaron durante 24 horas en portaobjetos de cámara de plástico a aproximadamente 50% de confluencia y se lavaron con PBS una vez. El medio de crecimiento normal se sustituye dos veces en 1,5 tiempos de duplicación con MEM isoleucina deficiente que contiene 5% 3 × FBS dializado para sincronizar las células en la fase G1. Después de la sincronización G1 y la exposición a 0 Gy o 1 Gy de rayos gamma, las células se incubaron con 5-etinil-2 'desoxiuridina (EDU) durante 30 minutos (ya sea inmediatamente o después de la incubación de 5,5 horas para la reparación). Edu-etiquetado se utiliza para juzgar G1 sincronización [18]. Después, las células se lavaron en PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% seguido de permeabilización con 0,5% Triton X-100 y 0,1% SDS. EdU se tiñó primero como las instrucciones del fabricante. Los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS, se fijaron en paraformaldehído al 4% y se bloquearon en PBS con suero de cabra al 10% durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación durante la noche, las células se incubaron con un anticuerpo fosforilados histona H2AX (Ser139) (γ-H2AX) (Millipore, Billerica, MA) y seguidas por Alexa 594 anticuerpo de cabra anti-ratón Fluor-conjugado (Molecular Probes, Eugene, OR) . Las células se montaron en una solución con DAPI contiene lento fundido (Invitrogen). Las imágenes digitales se capturaron usando un microscopio Z-etapa Axioskop motorizado (Carl Zeiss) con CoolSnapHQ2 (Photometrics, Tucson, AZ) y el software Metamorph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Las imágenes fueron utilizados para contar focos γ-H2AX por célula. Tres experimentos independientes se realizaron y los números de la γ-H2AX se contaron durante un mínimo de 50 EdU tinción de las células negativas para cada muestra en cada experimento.
Análisis de Apoptosis
La apoptosis inducción por infrarrojos se evaluó mediante la activación de la caspasa 3/7, anexina V tinción, y el ensayo de la terminal desoxinucleotidiltransferasa (TDT) mediada desoxiuridina trifosfato nick fin de etiquetado (TUNEL). Log células en crecimiento de fase fueron irradiados con 0 Gy o 5 Gy de rayos gamma. Después de 16 horas de incubación, la apoptosis temprana se midió con la activación de la caspasa 3/7 por caspasa-Glo 3/7 kit (Promega, Madison, WI). luminesce resplandor de 10.000 células se midió por Lumat LB9507 (Berthold tecnologías, Oak Ridge, TN). Después de 24 horas de incubación, la apoptosis temprano /tardío se midió con la anexina V tinción mediante el kit de detección de apoptosis FITC Anexina V con 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA). Annnexin V positivo, pero negativo 7-AAD (primeras células apoptóticas) y anexina V positiva y positiva 7-AAD (etapa apoptosis tardía) se determinó por Guava-PCA citómetro de flujo. Después de 48 horas de incubación, la tarde apoptosis se midió con el ensayo TUNEL y la morfología nuclear fragmentado. Las células cytogentrifuged se fijaron con 4% de paraformaldehído y enfriado en hielo 70% de etanol. Las células se incubaron en la mezcla de reacción que contiene CoCl 1,5 mM
2, 12,5 U TdT, 1 mM 5-bromo-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato en tampón TdT (Br-dUTP, Sigma-Aldrich: los demás , Roche, Indianapolis, IN) durante 4 horas a 37 ° C en la oscuridad. Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo BrdU monoclonal de ratón y anticuerpo anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488-conjugado. Finalmente, las células se contratiñeron con DAPI. Aproximadamente 1.000 núcleos de cada diapositiva se contaron, y se calcularon las frecuencias TUNEL positivas. relaciones de apoptosis también se determinaron anotando las células de tinción DAPI con morfología nuclear fragmentado.
Western Blotting
Las células se lisaron con M-PER proteína de mamífero reactivo de extracción (Thermo Fisher Scientific) y los inhibidores de la proteasa. Los extractos de proteína (20 mg por muestra) se fraccionaron de tamaño en NuPage 4-12% Bis-Tris geles (Invitrogen), electro-transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad) en tampón (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 20% (v /v) de metanol, y 0,01% de SDS) a una densidad de corriente de 3,0 mA /cm
2 durante 16 horas a 4 ° C. Los filtros se bloquearon con solución salina tamponada con Tris con 0,05% de Tween 20 que contenía 2% (w /v) leche desnatada, y se hicieron reaccionar con un anticuerpo primario durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido de una incubación con un anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente. Las señales inmunorreactivas se detectaron usando el kit SuperSignal Western Blotting de detección (Thermo Fisher Scientific) y una ChemiDoc XRS + System (Bio-Rad). Expresión de proteínas de fuerza banda se analizó mediante software Lab Image (Bio-Rad). Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio fueron el anti-DNA-PKcs anticuerpo monoclonal de ratón (Ab-4; Neomarkers, Fremont, CA), el anti-Rad51 anticuerpo policlonal de conejo (H-92; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), el conejo anti-FANCD2 anticuerpo policlonal (NB100-182; Novus Productos Biológicos, Littleton, CO) y el anticuerpo beta-actina monoclonal de ratón (Abram 8226; Abcam, Cambridge, MA). Los anticuerpos secundarios fueron de cabra anti-ratón conjugado anticuerpo IgG HRP (1: 10.000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) y la IgG de cabra anti-conejo HRP anticuerpo conjugado (1: 10.000) (la señalización celular, Boston MA ). Cada banda expresión fue estimado a partir del peso molecular de cada proteína y la banda detectada en el A549 línea celular de cáncer humano.
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico se utilizó el software GraphPad Prism 5. Se utilizó la prueba D'Agostino-Pearson para determinar si los valores se distribuyen normalmente. Las diferencias con un valor de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Las correlaciones de SF2 y otros parámetros fueron determinados mediante la prueba de Pearson. Las comparaciones estadísticas de los valores medios en el ensayo de γ-H2AX (control frente a 6 horas después de 1 Gy) se realizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis seguido por prueba de comparación múltiple de Dunn. La comparación estadística de los valores medios en el SF2 /SF5 (grupo radioresistant vs grupo sensible a la radiación) y en el ensayo de la apoptosis (0 Gy vs. 5 Gy) se realizó utilizando no pareada de dos colas t-test.
Resultados
Caracterización básica de líneas celulares de cáncer canino
Cada línea celular se caracteriza por una combinación de datos que representan tiempo de duplicación celular, la distribución del ciclo celular, patrón de ploidía, y el número de cromosomas, con los datos resumidos en la Tabla 1. La tiempos de duplicación de cada línea celular variaron de 15 horas (CML-6M, CTAC) a 40 horas (STSA-1), que muestra una amplia variación. Se midió la distribución del ciclo celular de cada línea celular mediante citometría de flujo. El porcentaje de células en cada fase del ciclo celular varió de 39,3% (CLBL1) al 69,6% (BR) para la fase G1, del 17,3% (Parques) al 50,1% (CLBL1) para la fase S, y desde 1,52% (BR ) a 29,9% (Parques y STSA-1) para la fase G2 /M. Estas líneas celulares muestran números medios variables de cromosomas, que van desde 57 (1771) a 155 (17CM98). Las líneas celulares de cáncer de canino demostraron números de cromosomas metacéntricos (cromosomas en forma de X) que resultan de eventos de translocación robertsonianas [19] incrementaron, con la excepción de dos líneas celulares (Jones y OSW) (Tabla 1). Las frecuencias de cromosomas metacéntricos variaron entre las líneas de células de menos de dos, el cariotipo normal, a 43,2 (D17) por célula. Todas las líneas celulares excepto BR tenían mayor que la cantidad diploide de ADN. Encontramos conjunto de acuerdos entre ploidía anormal y un aumento del número de cromosomas, pero no siempre. Nike, por ejemplo, tenía un menor número de cromosomas por célula con 64,4, pero el patrón de ploidía fue entre diploidia y la triploidía.
clonogénico de supervivencia tras la exposición a radiación gamma
irradia cada uno de las 27 líneas celulares de cáncer de caninos con 0, 1, 2, 3 o 5 Gy de rayos gamma y la formación de colonias medido. Sus curvas de supervivencia se muestran en la Fig 1. valores SF2 y SF5 que se calcularon a partir de la curva de supervivencia de regresión cuadrática lineal, así como la eficiencia de chapado, se presentan en la Tabla 1. Estos datos representan la gama de radiosensitivities de células tumorales caninas a través de diferentes tipos de tumores . El SF2 osciló 0,19-0,93 y el SF5 varió desde 0,01 hasta 0,60. La eficiencia del chapado de estas líneas celulares también demostró una amplia variación y varió de 4% a 65%. La eficiencia de plaqueo de la BR (4%) era demasiado bajo para obtener fracciones de supervivencia fiables; Por lo tanto, su radiosensibilidad no se utilizó para análisis adicionales. La radiosensibilidad de las cuatro líneas celulares OSA canino (D17, Moresco, Gracie y Mackinley) medida por ensayo clonogénico fue consistente con los que han sido previamente publicado [20]. Por lo tanto, también se utilizaron los datos de las características celulares básicas (por ejemplo, el tiempo de duplicación, el análisis cromosómico) que se muestran en el informe para el análisis en este estudio. Se evaluaron las correlaciones entre las variables características celulares y la radiosensibilidad. En estas líneas celulares, no hubo correlación significativa de SF2 con fracción de la fase S, el tiempo de duplicación, el número de cromosomas, o el número de cromosomas metacéntricas, mientras que hubo una modesta pero estadísticamente significativa correlación entre SF2 y planchas de eficiencia (R
2 = 0,34, p = 0,002, prueba de Pearson) (Fig 2). Evaluación frente a los SF5 mostró resultados similares a los obtenidos a partir de SF2 (R
2 = 0,24, p = 0,01, prueba de Pearson).
Los experimentos se llevaron a cabo al menos tres veces y las barras de error indican el error estándar de los medios. Se seleccionaron las líneas celulares más radiosensibles (curvas rojas) y las líneas celulares más radioresistant (curvas azules) para el siguiente análisis.
Cada punto representa una línea celular. Las correlaciones se evaluaron mediante la prueba de Pearson. Las líneas se ajustaron mediante un método de mínimos cuadrados.
selección de los grupos sensibles a la radiación y radioresistant
Las 27 líneas celulares de cáncer canino fueron calificados por los parámetros de radiosensibilidad, SF2 y SF5, y las cinco líneas más sensibles o resistentes para cada parámetro se definieron como los grupos sensibles y resistentes (Fig 3A y 3B). El grupo seleccionado radioresistant muestra los valores SF2 0,19 a la 0,44 (Nike, CML-C2, Bliley, MacKinley, STSA-1). El grupo exhibió valores sensibles a la radiación por encima de 0,86 SF2 (CMT-12, K9TCC, DEN-HSA, CMT-27, Abrams). Las diferencias en la radiosensibilidad de las células tumorales fueron mejores discriminada cuando la radiosensibilidad de las células tumorales se expresó como fracciones de supervivencia a la dosis más alta (SF5). Las líneas celulares en los dos grupos en base a la comparación SF5 fueron ligeramente diferentes de los que se basan en la comparación SF2. Las fracciones de supervivencia entre dos grupos de líneas celulares basados tanto en la comparación SF2 o SF5 fueron estadísticamente diferentes (p & lt; 0,001). (Figura 3C y 3D)
27 líneas celulares se clasifican en base SF2 (A) y SF5 (B). Círculo rojo: Grupo radiosensibles, círculo azul: grupo resistente a la radiación. (C, D) Comparación entre los valores medios de dos grupos basados en la SF2 (C) o SF5 (D). Las barras de error indican la desviación estándar. * P & lt;. 0,001 frente al grupo sensible y resistente (prueba t no pareada) guía empresas
Relación entre intrínseca Radiosensibilidad y RBC de ADN en células G1-Irradiatied
Para examinar si la respuesta de las células al ADN DSBs se correlaciona con la radiosensibilidad en las líneas celulares de cáncer de canino, se utilizó el ensayo γ-H2AX en el cinco líneas de células más radiosensibles cinco más radioresistant y seleccionado de clasificación SF2. focos nucleares de la histona H2AX fosforilada (γ-H2AX) como resultado de daños en el ADN son marcadores sensibles para el ADN DSBs [21]. Se midió el número de focos γ-H2AX después de 1 Gy de irradiación gamma en las células G1 de fase sincronizada siguiente 30-min o 6 horas de tiempo de reparación (Fig 4). En los medios de comunicación deficientes isoleucina para sincronizar las células en G1, la mayoría de las células DEN-HSA murieron después de una incubación de 24 horas, y la línea celular CMT-12 no se sincronizan en los medios. Por lo tanto, estas dos líneas celulares no se han utilizado para este análisis. Las otras líneas celulares mostraron sincronización G1 con menos de 16% en la fase S en la isoleucina medios deficiente durante 1,5 tiempos de duplicación. En algunas células que no están en fase S con 0 tratamiento Gy, se observaron un gran número de focos gamma-H2AX endógenos en todas las células de cáncer de canino. Se excluyeron las células con altos niveles de focos fuera de la distribución de IR inducida a partir del análisis para detectar los niveles de focos inducida por IR. Basándose en el análisis sin células con altos niveles de números de focos γ-H2AX endógenos, 1 Gy de rayos gamma inducidos niveles significativamente más altos de focos γ-H2AX después de 30 min de irradiación en todas las líneas celulares utilizadas en este análisis (p & lt; 0,05 vs 0 Gy, que no se muestra en la figura) (Fig 4B). A los 30 minutos después de la irradiación, la mediana del número de γ-H2AX focos era dependiente del contenido de ADN de cada línea celular. Además, la radiosensibles CML-10C2, Nike, STSA-1 y MacKinley tenían un mayor número de focos γ-H2AX después de 6 horas después de 1 Gy de irradiación en comparación con sus niveles de control (P & lt; 0,05 vs 0 Gy). Por otro lado, los tres de las líneas celulares radioresistant y una línea de células sensibles a la radiación, Bliley, no mostraron diferencias significativas entre las células control y células con 6 horas después de la irradiación.
Las células se sincronizaron en G1 utilizando isoleucina medios deficientes y luego irradiadas con 1 Gy de rayos gamma. Después de 30 min o 6 hr tiempo de incubación, las células se tiñeron con γ-H2AX. (A) Ejemplos de focos γ-H2AX (verde) en DAPI nuclear tinción (azul) en el control, 1Gy seguidos de 30 min de incubación y 1 Gy seguido de 6 horas de incubación en células negativas edu. (B) Análisis cuantitativo de focos gamma-H2AX por célula. Se muestran los datos agrupados de tres experimentos independientes con calificaciones de 50 células en cada experimento. La barra indica media. significaciones estadísticas se muestran sólo el control frente a 6 h después de 1 Gy (prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis).
intrínseca relación entre la radiosensibilidad y la apoptosis en las células irradiadas Frecuencia
La célula radioresistant cinco líneas y las cinco líneas celulares radiosensibles también se evaluaron para la apoptosis a las 18, 24, y 48 horas después de la irradiación (0 Gy y 5 Gy) (Fig 5). Caspasa 3/7 activación se analizó 18 horas después de la irradiación (Figura 5A). expresión de Anexina V se analizó a las 24 horas después de la irradiación (Fig 5B). La actividad de la caspasa 3/7 aumentó en se observaron más de dos veces en CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10C2, Bliley, MacKinly, y STSA-1. El porcentaje de células apoptóticas aumentó significativamente con 5 Gy de irradiación en CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10C2, Bliley, y MacKinley por análisis de Anexina V. Las células apoptóticas fueron contados por tinción TUNEL (Figura 5C) y DAPI indica (figura 5D) e informaron por separado. Aunque la apoptosis se observó en todos los cultivos de control que van desde 0,1 hasta 3,4% en la tinción de TUNEL y 0,37 a 3,3% en DAPI tinción de las células, dependiendo de la línea celular, no hubo diferencia significativa entre las líneas celulares. El porcentaje de células apoptóticas aumentó significativamente con 5 Gy de irradiación en Abrams, Nike, y CML-10C2 mediante tinción con DAPI con relación a 0 muestras Gy (P & lt; 0,05, prueba t no pareada) (figura 5C). El uso de la medición de células apoptóticas mediante ensayo TUNEL, se observaron resultados similares a éstos por tinción DAPI. Un aumento significativo en la frecuencia de apoptosis por IR se observó en uno (Abrams) de las cinco líneas de células radiorresistentes y en tres (Nike, CML-10C2 y MacKinley) de las cinco líneas celulares radiosensibles (Fig 5D).
(a) de la caspasa 3/7 actividad medida por luminomator a las 16 horas después de la irradiación. (B) Anexina V y tinción 7AAD miden por citómetro de flujo a las 24 horas después de la irradiación. (C) la tinción de TUNEL y (D) DAPI tinción medida por microscopio de fluorescencia. Las células irradiadas con 0 Gy y 5 Gy de rayos gamma. *, P & lt; 0,05 frente al 0 Gy y 5 Gy para cada línea celular (prueba t no pareada) guía empresas
Expresión de proteínas de la vía de reparación del ADN en radiosensible y Grupos radioresistant
Dado que el ADN. vías de reparación del OSD están estrechamente relacionados con la muerte celular por IR, se estudió el estado de la proteína de las principales vías en las células de cáncer de canino. Nos centramos en los dos principales recombinación no homóloga (NHEJ) y la recombinación homóloga (HR) en la reparación de DSB y la vía de la Anemia de Fanconi (FA), que posiblemente contribuye a la reparación de daños en el ADN por irradiación. La expresión de proteínas de los principales actores en cada vía, DNA-PKcs en NHEJ, RAD51 en recursos humanos y en la ruta Fanconi FANCD2 fueron detectados por Western Blot en el radioresistant y grupos radiosensibles (figura 6). La expresión de DNA-PKcs, FANCD2 y RAD51 no fueron uniformes entre las líneas celulares, y no había una clara tendencia entre los niveles de expresión en los dos grupos, como se muestra en la figura 6B. La expresión de las tres proteínas en las células de cáncer de canino fueron en general superiores a los de los fibroblastos normales del perro. Se observó menos expresión de las proteínas DNA-PKcs en Nike (1,4 veces mayor de lo normal) y la más alta expresión en STSA-1 (5,4 veces de la normal). Para la proteína FANCD2, la expresión más baja fue en DEN-HSA (0,8 veces mayor de lo normal) y la expresión más alta fue en CMT-27 (7,2 veces mayor de lo normal). Para la proteína RAD51, la expresión más baja de DEN-HSA (0,4 veces mayor de lo normal) y la expresión más alta fue en MacKinley (3,0 veces mayor de lo normal). Cuando se compara entre el canino y la línea celular de cáncer humano (A549), los niveles de expresión de DNA-PKcs en STSA-1, que mostró la más alta expresión de las líneas celulares caninas, eran 10 veces menor que la de A549.
(A) Western blot de DNA-PKcs (460 kDa), FANCD2 (165 kDa) y RAD51 (37 kDa). β-actina (42 kDa) expresión se utilizó como control. Cada banda expresión fue estimado a partir del peso molecular. (B) la intensidad de la banda de transferencia de western. (C, D) Imágenes representativas de focos RAD51 (C) y FANCD2 focos (D) co-localizada con gamma-H2AX en células Moresco.
También observamos los focos de RAD51 y FANCD2 como funcionalmente co-localizada con γ-H2AX en la replicación de estrés sin irradiación en todas las 27 líneas celulares (figura 6C y 6D). Otra ventaja para el ensayo de RAD51 y FANCD2 fue que estas formaciones de focos de proteínas requieren otras proteínas aguas arriba, por ejemplo, cinco proteínas RAD51 paralog y ocho proteínas Fanconi anemia [22-24]. Por lo tanto, la formación de focos de detección nos permitió la detección de la presencia de estas proteínas aguas arriba en todas las 27 líneas celulares de cáncer de canino. Hemos observado focos de RAD51 funcional y FANCD2 en todas las líneas celulares.
Discusión
Las 27 líneas celulares de cáncer canino derivadas de diez tipos de tumores diferentes utilizados en el presente estudio habían radiosensitivities que varían independientemente del tumor escribir con los valores SF2 de 0,17 hasta 0,94 (Fig 1 y la Tabla 1). A partir de datos de radiosensibilidad anteriores utilizando una amplia variedad de tumores humanos, SF2 varió desde 0,038 hasta 0,95 [13]. El rango más bajo de SF2 informó en el estudio en humanos se debió principalmente a los tumores linfoides, que no eran muy sensibles a la radiación en nuestro resultado canina donde SF2 se midió utilizando el mismo ensayo. tumores linfoides son conocidos por ser sensibles a la radioterapia tanto en oncología humana y veterinaria [2]. Esta discrepancia podría deberse a la variación entre las líneas celulares de tumores linfoides como se informó anteriormente [25], ya que sólo cuatro líneas celulares fueron investigados en nuestro estudio.
Con el fin de entender los parámetros que podrían contribuir a la radiosensibilidad intrínseca, se evaluaron las relaciones de radiosensibilidad celular con características celulares básicas en las 27 líneas celulares de cáncer canino. Una variación amplia también se observó en las características celulares en términos de número de cromosomas, la fracción de la fase S, el tiempo de duplicación y enchapado eficiencia en estas líneas celulares (Tabla 1). En nuestro estudio, no hemos encontrado una correlación entre la radiosensibilidad y las características celulares, incluyendo el número de cromosomas, la fracción de la fase S, y el tiempo de duplicación (Figura 2). Anteriormente, el mayor número de cromosomas se ha encontrado en algunas de las células de cáncer humano radiorresistentes [9].