Extracto
células metastásicas migran desde el sitio del tumor primario, a través del estroma, en los vasos sanguíneos y linfáticos, por último colonizar varios otros tejidos para formar tumores secundarios. Numerosos estudios se han realizado para identificar los estímulos que impulsan la cascada metastásica. Esto ha llevado a la identificación de múltiples señales bioquímicas que promueven la metástasis. Sin embargo, la información sobre el papel de los factores mecánicos en la metástasis del cáncer ha sido limitado al efecto de cumplimiento. Curiosamente, el microambiente tumoral es rica en muchos tipos de células incluyendo células altamente contráctiles que son responsables de una amplia remodelación y la producción de la matriz extracelular densa que rodea el tejido canceroso. Se postula que las fuerzas mecánicas producidas por la remodelación de actividades de las células en el microambiente tumoral contribuyen a la eficiencia de la invasión de las células metastásicas. Hemos descubierto una diferencia significativa en la extensión de la invasión en estimulado mecánicamente versos entornos no estimulados de cultivo celular. Por otra parte, esta invasión mecánica mejorada depende de la composición de proteínas sustrato, e influenciado por la topografía. Finalmente, hemos encontrado que se necesita la cofilina proteína para detectar los estímulos mecánicos que mejora invasión. Llegamos a la conclusión de que otros tipos de señales mecánicas en el microambiente del tumor, además de la rigidez, pueden mejorar la capacidad invasiva de las células de cáncer de
in vitro
. Proponemos que más
in vivo de búsqueda células no cancerosas localizadas dentro del microambiente tumoral puede ser capaz de proporcionar el estímulo mecánico necesario durante la remodelación de la matriz extracelular que rodea el tumor.
cita: S Menon, Beningo KA invasión celular (2011) El cáncer se ve reforzada por la estimulación mecánica aplicada. PLoS ONE 6 (2): e17277. doi: 10.1371 /journal.pone.0017277
Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: 15 de agosto de 2010; Aceptado: 27 de enero de 2011; Publicado: 17 Febrero, 2011
Derechos de Autor © 2011 Menon, Beningo. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El apoyo financiero fue proporcionada por una Universidad Facultad Beca de Investigación del Estado de Wayne a KAB y un Premio de Investigación de Graduados de la Universidad Estatal Wayne y Fondos de mejora de SM. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el momento decisivo en la clasificación de un tumor benigno o maligno mentiras en la capacidad de las células tumorales para romper la membrana basal. La extensión de las estructuras invasoras, tales como invadopodios, permite que la célula tumoral para penetrar la membrana basal y el estroma intersticial a través enzimática y medios físicos [1] - [3]. Sin embargo, la célula tumoral no va a ir muy lejos sin la capacidad adicional para migrar. La adquisición células tumorales de propiedades invasivas y migratorias proporcionan los medios para entrar y salir del linfático o el sistema vascular y establecer tumores secundarios en el tejido exterior, completando de este modo el complejo de secuencia de eventos dentro de la cascada de la invasión de metástasis [4], [5] . Es estos tumores secundarios que dan cuenta de más del 90% de las muertes por cáncer, sin embargo, nuestro entendimiento de la invasión y la metástasis es incompleta. Gran parte de la investigación se ha centrado en los factores genéticos y bioquímicos intrínsecas que desencadenan la formación del tumor primario y la metástasis posterior. Sin embargo, estudios más recientes han identificado dos factores físicos y bioquímicos en el microambiente tumoral que también contribuyen a la progresión del cáncer [6], [7].
El estroma que rodea a un tumor está cambiando continuamente en su composición y estructura que la células tumorales primarias progresan a la invasión y la metástasis, un proceso denominado stromagenesis [8], [9]. El estroma tumoral se enriquece en proteínas de la matriz extracelular (ECM) y células no tumorales, incluyendo fibroblastos, macrófagos, adipocitos, pericitos y [8] - [12]. señalización bioquímica del estroma de las células tumorales puede promover la proliferación y la invasividad. Por ejemplo, los macrófagos asociados a tumores establecen un EGF-CSF-1 paracrina bucle de señalización con las células tumorales que promueven el movimiento de células tumorales [10]. Las propiedades mecánicas de la estroma también pueden mejorar la progresión tumoral. Por ejemplo, el estroma que rodea a un tumor se enriquece tanto en colágeno de tipo I y la fibronectina, la creación de un tejido más denso y mecánicamente rígida en comparación con tejido normal [7]. Este aumento de la rigidez aumenta la proliferación y la difusión [13] de células tumorales - [15]. Estudios recientes indican también que la fibronectina se extiende físicamente puede desencadenar una vía de respuesta mecánica en fibroblastos normales [16] - [18]. Dado el aumento en la cantidad de la fibronectina en el estroma, estas observaciones podrían sugerir un mecanismo potencial para la respuesta mecánica de las células tumorales
.
Hay una serie de fuerzas mecánicas, aparte del cambio en el cumplimiento, que pueden impactar en la progresión del cáncer. Un tal fuerza podría ser derivada de los movimientos de células del estroma o la actividad remodelación de la matriz de las células altamente contráctiles del estroma, incluyendo fibroblastos y miofibroblastos. Los miofibroblastos se han demostrado para diferenciar a partir de fibroblastos de tejido normal, y su producción y remodelación de la ECM aumenta la proliferación y la difusión de las células tumorales [19], [20]. La acumulación de miofibroblastos del estroma son una característica definitoria de la desmoplasia más comúnmente asociado con cánceres invasivos de mama, tracto gastrointestinal, pulmones, páncreas y carcinomas de células escamosas, por nombrar algunos [9]. Además del alto nivel de la producción de colágeno de tipo I, miofibroblastos se identifican por su expresión de alfa actina de músculo liso-[7], [9], [21], [22]. Los asociados-actina de músculo liso alfa con la miosina no muscular para formar unidades microfilamentous altamente contráctiles que terminan en la superficie de un miofibroblastos en un fibronexus [23]. Estos son rasgos característicos de miofibroblastos y forman un sistema mecano-transducción que funciona de adentro hacia afuera y de afuera hacia adentro de transmisión de fuerza [23] - [25]. En la remodelación de la ECM dentro del estroma, los miofibroblastos producen un estímulo mecánico, ya que tira y afloja en las fibras [26]. Esto nos lleva a la cuestión que abordamos en este estudio. Podrían las fuerzas mecánicas aplicadas generada por la remodelación de la ECM y tirando de la ECM por las células del estroma contribuyen a las propiedades invasivas de una célula tumoral? Pueden proporcionar un estímulo "ven acá" que anima a las células tumorales que salir del tumor?
Aquí mostramos que un estímulo mecánico de tracción y que liberan de forma aplicada a una matriz de colágeno
in vitro
hace de hecho mejorar la invasión de células de cáncer en una manera dependiente de fibronectina. Esta capacidad parece ser única para las células cancerosas que se sabe que son altamente invasiva, como mal células invasoras y normales no responden de la misma manera a este estímulo. Por último, utilizando el silenciamiento de genes se determinó que la cofilina, un componente normal de invadopodios, es necesario para detectar esta señal mecánica mejorada para la invasión. Este estudio sugiere que los factores físicos, más allá del cumplimiento, están involucrados en la promoción de un comportamiento invasor existente en las células cancerosas y que las señales mecánicas transmitidas desde la actividad física de las células en el estroma puede potenciar la progresión del cáncer.
Materiales y Métodos
Cell Cultura
HT1080 células de fibrosarcoma humano, células de melanoma de ratón B16F10 y fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) células utilizadas en este estudio, se adquirieron de ATCC y se cultivan y se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle - alto glucosa (Sigma) y 10% de FBS (Hyclone). Se pasaron las células por tripsinización utilizando 0,25% de tripsina-EDTA, se termina la reacción con medio completo. El número de pases de cualquier tipo de célula nunca excede ocho pasajes.
Invasión Matrices
Para crear una cultura bien para matrices de espesor (1 mm), un cubreobjetos activado [27] se adjunta con grasa de vacío a la parte inferior de una placa de cultivo (Nunclon) en el que había sido perforado un agujero de 20 mm.
la matriz se compone de 2,5 mg /ml (o 4,5 mg /ml, Figura S2) colágeno tipo I (PureColl y NutraGen, Advanced Biomatrix), 20 mg /ml de fibronectina (Sigma) y 4 l de 1-2 micras perlas paramagnéticas carboxiladas (Polysciences Inc.). El pH de la mezcla se ajustó a 7,4 ± 0,2 con NaOH 0,1 N y 10X PBS. Para "El colágeno única" sustratos, todo excepto la fibronectina se añade a la mezcla de la matriz. Todos los componentes se enfriaron y se mezclaron a 4 ° C. se añadieron 500 l de la solución de matriz a una cultura refrigerados bien, y un 25 mm cubreobjetos se dejó caer en la mezcla de gel para obtener una superficie plana. Para la polimerización, la solución de matriz se colocó a 37 ° C durante 30 minutos. Después de la polimerización, se añadieron 3 ml de medio a los sustratos y se retiró el cubreobjetos superior. Luego los sustratos se esterilizan en una campana de cultivo bajo luz ultravioleta durante 15 minutos a una distancia de 25 pulgadas de la fuente de luz.
Invasión Ensayo
Las células se sembraron a 1,5 x 10
4 células /ml Onto matriz esterilizada y se dejaron adherir durante 1 hora a 37 ° C /5% de CO
2. Para cada experimento, una matriz de cabeza de serie, se incubó a 37 ° C /5% de CO
2 1,5 cm por encima de un imán de tierras raras de 12100 Gauss (25 mm de diámetro y 5,5 mm de espesor). Una segunda matriz de cabeza de serie se incubó fuera del campo magnético. El imán se hizo girar a continuación del cultivo a 160 rpm (2,6 Hz) en un campo orbital de 2 cm en un agitador orbital (Barnstead Thermolyne, Roto-Mix Tipo 50800). Esta frecuencia de rotación se mantuvo la misma para todos los ensayos descritos. El ensayo de invasión se realizó también con el imán gira en frecuencias más bajas (8 y 90 rpm (0,13 y 1,5 Hz)) como se indica. La respuesta celular se registró durante 25 campos microscópicos seleccionados al azar a las 24 horas utilizando un objetivo 10X de fase en una Olympus IX81 microscopio. Los recuentos de células se registraron a ocho incrementos de 100 m /paso dentro del plano z de la matriz. invasión Porcentaje se calculó como el porcentaje de células invadidas en comparación con el recuento total de células. El análisis estadístico se realizó con los alumnos de dos colas t-test
El péptido inhibidor de experimentos se realizaron como anteriormente.; 1,5 × 10
se sembraron 4 células /ml sobre los sustratos, seguido de 100 mg /ml de péptido o péptido GRGDS GRGES (control) (Bachem Americas Inc.) en suspensión en agua. invasión Se calculó el porcentaje de 24 horas después del inicio de la estimulación.
ascendente Invasion Ensayo
pozos de cultivo sin los sustratos se prepararon como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, las células se sembraron primero directamente sobre el cubreobjetos de vidrio recubiertos con una fina capa de colágeno tipo I (200 mg /ml) y fibronectina (62,5 g /ml) antes de la superposición de la matriz. Las células se dejaron adherir durante la noche en un medio a 37 ° C y 5% de CO
2. El medio se retiró y las células se superpone con la matriz de colágeno /fibronectina no polimerizado como se describió anteriormente. Se reemplazó el medio de polimerización siguiente. Para cada experimento, una matriz superpuesta sembrado se cultivó 1,5 cm por debajo de un imán de tierras raras de 12100 Gauss (25 mm de diámetro y 5,5 mm de espesor) y una segunda se mantuvo fuera del campo magnético. El imán se hizo girar por encima de la cultura celebrada en un soporte colocado en el agitador orbital (Barnstead Thermolyne, Roto-Mix Tipo 50800) y hace girar a 160 rpm (2,6 Hz) en un campo orbital de 2 cm. invasión por ciento y el análisis estadístico se describieron anteriormente.
actina despolimerización
células
HT1080 fueron sembradas en sustratos de colágeno /fibronectina. Después de que las células se habían adherido y se extendió sobre los sustratos, 2 M de citocalasina B (Sigma) se resuspendió en DMSO o se añadió un volumen correspondiente de DMSO a placas separadas. Estos luego fueron utilizados directamente para ensayo de invasión.
Cofilin Derribo
CFL1 siGENOME SmartPool y siRNA (RNAi Dharmacon Tecnología, Thermo Scientific) fuera de objetivo se utilizaron para silenciar la expresión de Cofilin y como controles , respectivamente. ARN de se introdujeron en las células mediante nucleofection utilizando un Amaxa Nucleofector II y soluciones de Kit T. Las proteínas se extrajeron para su análisis Western de las células silenciadas y HT1080 de control utilizando un buffer triple de detergente de lisis (100 mM Tris-Cl, NaCl 300 mM, 0,5% de sodio desoxicolato, SDS al 0,2%, 2% Nonidet P 40) que contiene inhibidor de la proteasa Cocktail (Sigma) a las 24, 48 horas y 72 horas después de confirmar nucleofection caída. anticuerpo monoclonal Anti-cofilina, ab54532 (Abcam) y el anticuerpo marcado con HRP anti-ratón (Amersham) se utilizaron para sondear las transferencias de Western y se detectó con ECL Plus Western Blot reactivos de detección (Amersham).
Invasion ensayo utilizando cofilina siRNA y citocalasina B trataron células HT1080
ensayo de invasión se realizó utilizando células HT1080 tratado de control de siRNA y cofilina siRNA. Desde knockdown cofilina es eficiente 48 horas después de nucleofection, se sembraron las células tratadas sobre los sustratos en el punto de tiempo de 48 horas. Después se habían adherido las células, una matriz de cabeza de serie para cada una de las condiciones se colocó por encima del imán que gira a 160 rpm (2,6 Hz), mientras que el otro se colocó fuera del campo magnético. El ensayo también se realizó con citocalasina B o DMSO células tratadas. En cada caso, se proporcionó una matriz de cabeza de serie, la estimulación magnética a 160 rpm (2,6 Hz) mientras que la otra matriz se colocó fuera del campo magnético. Se midió la respuesta celular para cada una de las cuatro condiciones de 24 y 48 horas después del inicio de la estimulación. Porcentaje se calculó la invasión y el análisis estadístico se realizó mediante una prueba T de dos colas estudiante.
Western Blot de la fibronectina secreción de las células HT1080
1,5 × 10
4 células /ml HT1080 las células se cultivaron en medio DMEM libre de suero y se sembraron en matrices de colágeno sólo, preparado como se describe anteriormente, y se realizó el ensayo de invasión estándar. Después de 24 horas de estimulación, los cultivos se raspó en un tubo de microcentrífuga que contiene 2 mg /ml de colagenasa de tipo 4 (Worthington Biochemical Corporation) en solución salina equilibrada de Hanks (Gibco, Invitrogen). La matriz de colágeno se solubilizó durante 10 minutos agitando suavemente el tubo a 37 ° C y las células se sedimentaron por centrifugación a 2000 rpm durante 5 min, se utilizó el sobrenadante para el análisis. También se prepararon extractos celulares de células HT1080 y células MEF cultivadas en placas de cultivo de poliestireno de 100 mm a 80% de confluencia más de 48 horas. Se llevaron a cabo la extracción de la lisis celular y la proteína como se describe anteriormente. Estándar SDS-PAGE se realizó utilizando 30 g de proteína total a partir de extractos de células MEF y HT1080 y 35 l de suspensión de colagenasa. transferencias de Western se prepararon y probaron con anticuerpo monoclonal de ratón [IST-9] a la fibronectina (1:300), ab6328 (Abcam) en la leche 5% en TBS seguido de un HRP de cabra anti-Ig de ratón (BD Pharmingen) anticuerpo secundario (1: 1000) y se detectó que el anterior.
resultados
Diseño estructural de la mecánica invasión Ensayo
el objetivo de este estudio fue determinar si se aplica la estimulación mecánica, tales como los simulando la remodelación de la matriz extracelular, puede mejorar el proceso de invasión. Para hacer frente a nuestra hipótesis, se diseñó un nuevo sistema de ensayo en el que la estimulación mecánica se podría aplicar en ausencia de factores bioquímicos secretadas. Nuestra intención era crear un ensayo que utiliza componentes disponibles en el mercado, el equipo estándar requerido, siempre y control de los parámetros bioquímicos y mecánicos, todo ello en un marco que era ópticamente compatible con un microscopio de fluorescencia ordinaria. Se optó por utilizar una matriz de colágeno tipo I comúnmente utilizado para los ensayos de invasión, razonando que el estroma es altamente enriquecido en esta proteína de la matriz extracelular. Carboxilados paramagnéticas fluorescente micro-perlas se incrustan dentro de la matriz para proporcionar una estimulación mecánica. Para producir una fuerza magnética transitoria, sin la necesidad de un tamaño de micras electro-imán, rotamos un imán de tierras raras en un mezclador giratorio debajo de la cultura, mientras que el cultivo se suspende sobre el imán (Figura 1A). El sistema de cultivo entero se puede mantener dentro de un incubador de cultivo de tejidos estándar (Figura 1B, C).
A) Un pozo se crea en una placa de cultivo de 60 mm y se llena con una matriz de colágeno de tipo I /fibronectina que contiene 2 micras perlas paramagnéticas. Las células se siembran sobre la superficie de la matriz y, o bien se cultivaron fuera de un campo magnético o cultivadas 1,5 cm por encima de un imán de tierras raras en rotación. Tras la estimulación, las células invaden la matriz. B) 60 mm de placa con un agujero de 20 mm perforados en él, con un cubreobjetos activado pegado a la parte inferior, crea un pozo para la matriz. C) El cultivo se suspendió 1,5 cm por encima de un imán de tierras raras colocado en un agitador orbital en un incubador de cultivo celular típico. Vea la sección de métodos para más detalles.
Para comprobar que el imán era capaz de producir suficiente fuerza magnética y que las perlas incrustadas respondieron a la fuerza, en forma transitoria, se utilizó una magnometer para medir el campo magnético fuerza a distancias experimentales definidas. Descubrimos una perla magnética en un punto fijo dentro del centro de la cultura podría ser sometido a una gama de 500 a 80 Gauss como el imán de tierras raras gira 1,5 cm por debajo de la placa de cultivo mientras que completar una órbita de 2 cm a 160 rpm (2,6 Hz) (Figura 2A). Simulación a estas distancias bajo el microscopio dio lugar a desplazamientos de talón de aproximadamente 0,5 a 5 micras (Figura 2B, la película S1, Película S2). Se observaron granos a la primavera de nuevo a su posición original en el plano x-y después de que se retira el imán, indicativo de su unión a la matriz de colágeno y el mantenimiento de la integridad de la red de gel. Para determinar la importancia fisiológica de este desplazamiento, nos dimos cuenta de que podíamos calcular la cantidad de fuerza que se aplica sobre la perla por el imán, sin embargo, una prueba más tangible sería observar células MEF extender y retraer las extensiones dentro de nuestro sistema de cultivo controlado. Registramos desplazamientos de cuentas en el plano x-y de las extensiones celulares de células MEF que van desde 0.08-5.1 micras (Figura 2C, la película S3). Esta es una comparación conservador para los tipos de desplazamientos que podrían ocurrir en el estroma dado que el tipo celular más contráctil encuentra allí, los miofibroblastos, producen una fuerza considerablemente mayor que un MEF [28], [29].
a) un imán de tierras raras coloca 1,5 cm por debajo de una matriz produce un gradiente de campo que van desde 500G a 80G dentro de la matriz a medida que gira en una órbita 2 cm. Una perla paramagnética en la posición X recibiría una fuerza magnética de 500G, ~300G y ~200G cuando el imán está orbitando en las posiciones P1, P2 y P3, respectivamente. B) de la serie de cuatro imágenes que muestran el desplazamiento de los granos por el imán cuando se mantiene en posiciones estacionarias dentro de la órbita. Los racimos de perlas que responden al estímulo mecánico y que muestran un cambio de posición han sido delimitada utilizando un círculo, un cuadrado y una flecha. De izquierda a derecha, la imagen uno está fuera del campo magnético, mientras que el segundo y tercer imágenes fueron tomadas con el imán que tuvo lugar en las posiciones P1 y P2, respectivamente. La imagen final demuestra las perlas vuelven a su posición original después de que se retira el imán. C) MEF extensiones celulares causan el desplazamiento de bolas fluorescentes. Cuatro imágenes (0, 15, 30 y 60 minutos) a partir de un único plano focal fueron seleccionados de una serie de 30 imágenes de fase tomadas cada 2 minutos de una célula MEF dentro de una matriz de colágeno /fibronectina. Se muestran los contornos celulares y los correspondientes imágenes de perlas fluorescentes. Un desplazamiento que experimenta grano se describe el uso de una caja rectangular de color blanco. El área dentro del cuadro de las cuatro imágenes se ha ampliado y se muestra con una regla de inserción para mostrar el desplazamiento del grano con mayor claridad. El contraste de las imágenes ampliadas han sido alterados para reflejar mejor la posición del talón en cada caso. revista Bar = 10 micras.
La estimulación mecánica Mejora la invasión de las células del cáncer
estructuras invasoras han sido previamente descritos tanto en las células invasoras inherentemente normales y en aquellos que han adquirido su capacidad invasiva durante la progresión del cáncer [30]. Pensamos que era poco probable que la estimulación mecánica podría inducir un tipo de células previamente no invasivo para invadir y, por tanto, hemos probado las células se sabe que son altamente invasiva en nuestro sistema de ensayo. Hemos elegido para probar el fibrosarcoma humano HT1080 línea celular de melanoma de ratón y la línea celular B16F10, mientras que la línea de células MEF no invasiva sirvió como control.
Estos tipos de células fueron probados individualmente por su capacidad para responder a la mecánica estimulación proporcionada en el ensayo. En resumen, se sembraron células sobre matrices preparadas, como se describe en métodos, y se dejaron adherir durante 30 minutos antes de comenzar la estimulación. Las células cultivadas en matrices de composición idéntica, pero no sometido a la estimulación magnética, sirvieron como controles. Las células cultivadas sobre matrices que carecen de perlas magnéticas, pero sometidas a estimulación magnética sirvieron como controles adicionales. Invasion se observó bajo el microscopio a partir de las 5 micras desde la superficie hasta una profundidad de 800 micras dentro de la matriz (Figura 3A). El número de células invasoras y no invasoras se contaron después de 24 horas de estimulación y se calculó como la invasión por ciento.
) células de fibrosarcoma HT1080 A fueron sembradas en matrices de colágeno tipo I /fibronectina que contiene perlas paramagnéticas y se cultivan ya sea bajo estimulación magnética o sin estimulación. Una imagen fluorescente fase y combinado de una cultura estimulado mecánicamente se superponen. La flecha señala sólidos a una célula que ha invadido. La flecha de puntos indica un segundo célula dentro de otro plano focal. Las flechas vacías puntos a una perla paramagnética fluorescente. revista Bar = 50 micras. B) La invasión de células HT1080 en condiciones mecánicamente estimuladas y no estimuladas se realizó en matrices que contenían colágeno tipo I (2,5 mg /ml) o ambos colágeno de tipo I y fibronectina o colágeno /fibronectina en presencia o ausencia de péptido RGD. 25 campos de células se contaron 24 horas después de la siembra en múltiples profundidades dentro de cada matriz a partir de 5 m por debajo de la superficie de la matriz y progresando hacia el más lejano profundidad de 800 m. El porcentaje de células invasoras fue 2 veces mayor en los cultivos estimulados en comparación con los controles (
P
& lt; 0,05) en matrices que contienen ambas proteínas de ECM. Resultados similares se obtuvieron cuando los GRGES péptido de control se añadió a los medios de comunicación. El porcentaje de invasión fue aproximadamente la misma con o sin estimulación cuando fibronectina estaba ausente. La adición del péptido GRGDS también resultó en la inhibición de la invasión mejorada a la estimulación mecánica. C) Una diferencia de 20 veces en la frecuencia de estimulación no influye en el porcentaje de invasión de células. El porcentaje de células invasoras 24 horas después de la estimulación a velocidades de rotación magnéticas de 8, 90 y 160 rpm (0,13, 1,5 y 2,6 Hz). Se encontró una diferencia significativa entre las células estimuladas a las 8 y 160 rpm (
P Hotel & gt; 0,05). Los datos representan tres experimentos independientes, de 25 campos. D) colágeno de tipo I matrices /fibronectina que contienen los granos paramagnetc fueron pre-estimuladas durante 24 horas. Estas matrices se siembran a continuación con las células HT1080 y se contaron 24 horas después de la siembra, período durante el cual tanto el pre-estimulados y las placas de control no se estimularon (panel izquierdo). Estos cultivos se continuaron entonces o bien o se colocan sobre el imán (panel derecho), los datos obtenidos 24 horas después de la estimulación. Los datos representan dos ensayos independientes de 15 campos de células en un rango de profundidad de 800 m. El análisis de dos colas mediante test t de Student.
Inicialmente se sembraron las células en matrices compuestas únicamente de colágeno tipo I. Tras la estimulación no observamos una mayor invasión (que varía entre el 5 y el 10% de invasión en cultivos estimulados por no estimulado y). Sin embargo, no sólo es colágeno de tipo I abundante en el estroma, pero el ECM fibronectina proteína de unión de colágeno también se enriquece [7], [31]. Por lo tanto, se compararon matrices compuestas de colágeno solo a las de colágeno y fibronectina, con y sin estimulación. Bajo estas condiciones se observó una diferencia significativa en el número de células invasoras en mecánicamente estimuladas versos entornos no estimulados de cultivo para los tipos de células invasoras cuando se utilizaron matrices de colágeno /fibronectina (Figura 3B). Un aumento de dos veces en el porcentaje de células invasoras en el estimulado (23%) en comparación con la matriz no estimulado (10%) se observó consistentemente en estos cultivos (P & lt; 0,05). Estos resultados indicaron que un estímulo aplicado fue capaz de mejorar la invasión de las células cancerosas, pero requiere en presencia de la fibronectina para la respuesta mecánica. Además, hemos encontrado que las células MEF no invasivos fallaron para invadir tanto en presencia o ausencia de la estimulación mecánica en matrices de colágeno /fibronectina, lo que sugiere la necesidad de una celda para tener una capacidad de pre-definida para la invasión.
para confirmar la importancia de la fibronectina para la respuesta mecánica inhibimos las interacciones célula-fibronectina con péptidos inhibidores RGD. Las células fueron tratadas con el péptido o un péptido GRGDS GRGES de control después de la siembra en las matrices de colágeno /fibronectina. El porcentaje de invasión fue normal en la presencia del péptido GRGES de control (28% con la estimulación y 13% sin estimulación), mientras que la invasión estimulada mecánicamente fue inhibido por el péptido RGD (9% con la estimulación y 11,5% sin estimulación, P & gt; 0,05). Estos resultados no sólo apoyan el hecho de que la fibronectina es necesario para la invasión estimulada mecánicamente, pero sugieren que el nivel "basal" de ~ 10% invasión observado en colágeno /fibronectina (no estimulado) y colágeno (estimulado y no estimulado) culturas es fibronectina independiente. Además, estos resultados sugieren que cualquier fibronectina secretada por las células HT1080 en las matrices (aunque no detectable por transferencia de western; Figura S1). Tiene efecto pequeño en la respuesta mecánica
Debido a la heterogeneidad de tipos de células y de células números dentro del estroma no estaba claro a qué frecuencia el estímulo debe ser aplicado. Para determinar si la frecuencia de la estimulación del grano fue un factor en la invasión mejorada, se ajustó la velocidad del imán giratorio, que gira a una velocidad de 8, 90 y 160 rpm o 0,13, 1,5, y 2,6 Hz, respectivamente. El porcentaje de invasión no difirió significativamente entre los cultivos estimulados a las 8 y 160rpm (
P Hotel & gt; 0,05; Figura 3C). Estos resultados demostraron que, dentro de un rango de 20 veces de la frecuencia, la invasión aumentan en respuesta a la estimulación mecánica no se ve afectada.
células invasoras se encuentran con barreras físicas dentro del estroma tejido o tumor conectivo y es probable que sigan el camino de la menor resistencia [32]. Además, es probable que invadir a lo largo de caminos en el que los factores solubles de la matriz asociada han sido puestos en libertad [19], [33] - [36]. Sobre la base de este conocimiento, era importante asegurarse de que ninguno de estos factores contribuyeron a la invasión mejorada observada en nuestro ensayo.
Una forma en que nuestra matriz podría generar caminos de menor resistencia a la invasión de las células sería a través de una remodelación permanente creada por el movimiento de los talones embebidas. Para probar esta posibilidad, nos pre-estimulado las matrices sobre el imán giratorio durante 24 horas antes de la siembra de las células. Después de 24 horas de cultivo en las matrices de pre-estimulada, pero fuera del campo magnético, no se observó una mayor invasión (Figura 3D, panel izquierdo). Además, los medios de comunicación de la matriz de pre-estimulada no se ha modificado antes de la siembra de las células. Esto eliminó la posibilidad de que los factores solubles en la matriz estaban siendo liberados por el tirón de los granos en la matriz y contribuye a la invasión mejorada. Sin embargo, cuando estos mismos cultivos de células cultivadas en la matriz de pre-estimuladas se dan a continuación, la estimulación magnética, se observó de nuevo una mayor invasión (Figura 3D, panel derecho). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que cualquier remodelación o liberación de factores solubles de la matriz debido al movimiento de las perlas magnéticas no contribuye a la invasión mejorada que observamos tras la estimulación mecánica.
La respuesta Invasion se mejora si el estímulo se libró de superior o inferior
la dimensionalidad del medio ambiente se sabe que influyen en el comportamiento celular. Específicamente, se ha demostrado que las células HT1080 de cambiar su velocidad de migración y la persistencia en tres dimensiones [37]. En nuestros experimentos iniciales, las células se sembraron en la parte superior de la matriz, la invasión de la parte superior hacia abajo, comenzando así en dos dimensiones y en movimiento en tres. Para hacer frente a la influencia de dimensionalidad en la invasión mecánica cambiamos la orientación del estímulo para que las células invadirían hacia arriba. Para ello, primero se sembraron las células sobre colágeno /cubreobjetos recubiertos de fibronectina antes de la superposición y la polimerización de la solución de colágeno /fibronectina /magnética del grano por encima de ellos (Figura 4A). A continuación, el campo magnético se aplicó a la parte superior de la cultura mediante la rotación del imán encima del cultivo estacionario (Figura 4B). Después de 24 horas de estimulación, encontramos las células invadidas tan bien como lo hicieron cuando fueron sembradas en la parte superior de las matrices anteriores a la estimulación (6% en la invasión no estimulado y 13% en los cultivos estimulados) (Figura 4B). Sin embargo, encontramos a las 48 horas, la diferencia entre la invasión no estimulado y estimulado invasión era incluso más grande tal que el 12% de las células invadidas en no estimulado frente a un 41% de invasión en los cultivos estimulados. Por lo tanto, un mayor aumento de la invasión se produce en la respuesta a la estimulación mecánica aplicada cuando las células comenzaron en un entorno de tres dimensiones.
) células de fibrosarcoma HT1080 A fueron sembradas en un cubreobjetos recubiertos de colágeno /fibronectina en la parte inferior del pozo. Después se habían adherido las células, una solución de colágeno de tipo I /fibronectina que contiene microperlas paramagnéticas se superpone a las células y se dejó polimerizar. Los cultivos se sometieron a la estimulación ya sea magnético o cultivan fuera del campo magnético. B) El imán se hace girar por encima de la cultura como células empiezan a invadir arriba en la matriz. células C) HT1080 sembradas sobre un cubreobjetos recubierto con colágeno fibronectina y superpuestos con una matriz de colágeno /fibronectina se cultivaron en presencia o ausencia de un campo magnético. invasión Se calculó el porcentaje de 24 y 48 horas después de la estimulación de tres ensayos independientes (15 campos fueron contados por cultivo).