Extracto
pulmón es la causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en todo el mundo. A pesar de décadas de investigación, las opciones de tratamiento para pacientes con cáncer de pulmón sigue siendo insuficiente, ya sea a ofrecer una cura o incluso una ventaja de supervivencia sustancial debido a su resistencia intrínseca a la quimioterapia. Nuestros resultados proponen la eficacia de la capsaicina en la expresión de VEGF-regulación en las células de carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) en el ambiente hipóxico. La capsaicina-tratamiento reactivado bucle de retroalimentación positiva SMAR1 p53 en estas células de persuadir p53 mediada por la degradación de HIF-1α y la represión inducida por SMAR1 de la Cox-2 expresión que contuvo la localización nuclear de HIF-1α. Tales señal modulaciones en consecuencia abajo reguladas expresión de VEGF para frustrar la migración de células endoteliales y la formación de la red, pre-requisitos de la angiogénesis en microambiente tumoral. Los resultados anteriores abogan por la candidatura de la capsaicina en la orientación exclusivamente angiogénesis por abajo de la regulación de VEGF en las células tumorales para lograr una terapia más eficaz y convincente de NSCLC resistentes
Visto:. Chakraborty S, Adhikary A, Mazumdar M, S Mukherjee , Bhattacharjee P, Guha D, et al. (2014) la activación inducida por capsaicina de p53-SMAR1 Auto-Regulador de bucle regula a la baja VEGF en células no pequeñas de cáncer de pulmón para frenar la Angiogénesis. PLoS ONE 9 (6): e99743. doi: 10.1371 /journal.pone.0099743
Editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute de la Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 31 de diciembre de 2013; Aceptado: 16-may de 2014; Publicado: 13 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Chakraborty et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. SC- Becas de la Universidad Comisión- UGC 2-8 /2002 (SA I) (SA-I), de fecha 06.11.2008. Departamento de Ciencia y AA- /3393/06 de fecha 16.10.2006 Tecnología DST R. Departamento de Biotecnología-DBT-RA MM de fecha 05.06.2009. Consejo de SM-Científica e Industrial Investigación-CSIR 09/015 (0386) /2010 EMR-1, de fecha 22.02.2010. Departamento de Biotecnología-DBT-RA PB de fecha 01.06.2010. DG-University Grants Comisión- UGC 2-8 /2002 (SA I), de fecha 21.04.2011. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma de alta resistencia no microcítico de pulmón (NSCLC) que comprende el 80% de todos los cánceres de pulmón es intrínsecamente resistentes a la quimioterapia y /o terapia de irradiación. Dado que, la angiogénesis es esencial para el crecimiento y la metástasis NSCLC, por lo tanto el control de la angiogénesis asociada a tumores puede ser una táctica prometedora a limitar la progresión NSCLC. Varios factores pro-angiogénicos como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) son altamente expresado en el microambiente tumoral e inducen fuertemente angiogenesishttp tumoral: //www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3827603/- b3 [1] . Este cambio del microambiente del tumor a un estado angiogénico, o "cambio angiogénico" [1], [2], es una tasa importante factor limitante en el desarrollo tumoral.
La expresión del gen VEGF se ha demostrado que es upregulated por hipoxia [3] - [5] y la rotación de VEGF está mediada por la hipoxia-inducible factor-1 de (HIF-1) [2], [3]. En condiciones de normoxia, los niveles de HIF-1α están fuertemente regulados por la tensión de oxígeno a través de la hidroxilación de los residuos prolil, mientras que las condiciones hipóxicas obstaculizan hidroxilación prolil de HIF-1α [4] y se estabiliza la proteína, lo que le permite transactivar genes diana como VEGF [3] . Una gran cantidad de informes vinculan fuertemente HIF-1α de p53 en una relación inversa en la que p53 inhibe la transcripción HIF-1α [6] e induce su degradación bajo varias condiciones subcelulares de estrés [7] por lo tanto http: //www.jbc. org /search = autor1 Joanna + Zawacka-Pankau & amp;? sortspec = fecha & amp; submit = Submitresulting en su potente represión. Curiosamente, p53 se estabiliza por SMAR1, una proteína de unión región de matriz asociada andamio, a través del desplazamiento de Mdm2 de p53 bolsillo N-terminal y p53, por tanto, el rescate de la degradación proteasomal mediada por Mdm2 [8]. informes de la época [9], [10] demuestran que el daño en el ADN leve SMAR1 promueve la desacetilación de p53 a través de la contratación de HDAC1 y específicamente reprime la expresión de Bax y Puma lo cual inhibe la apoptosis. Estos informes no sólo dan fe de la candidatura de SMAR1 en la modulación de la actividad de p53, pero también plantean la posibilidad de implicación de p53 en otras funciones celulares leves en el microambiente que daña el ADN de la célula. Es importante destacar que varios estudios también han identificado transversales complejas conversaciones entre p5
3
y Cox-2, en el que la Cox-2 suprime p53 en las células cancerosas de la red [11], [12] y
[12]. Toda esta información nos incitó a hacer una idea de la existencia de una relación interactiva entre SMAR1, p53, Cox-2 y HIF1-α, si los hay, que decide el destino de la expresión de VEGF durante la angiogénesis tumoral en NSCLC. La inhibición del crecimiento del tumor por los agentes anti-angiogénicos se ha logrado en los que se ha informado de respuestas antitumorales prometedores para una variedad de agentes anti-VEGF. Sin embargo, la toxicidad de la mayoría de estos fármacos, así como el desarrollo de resistencia hacia los agentes significan la necesidad de la identificación de agentes no tóxicos alternativos para lograr la inhibición continua de la angiogénesis para el tratamiento de NSCLC eficaz.
aumento de la evidencia indica la contra el cáncer efectos de la capsaicina (8-metil-
N
-vanillyl-6-nonenamida), el componente activo de la pimienta chili, contra diversos tipos de cáncer [13] - [18]. La capsaicina ha sido reportado para provocar apoptosis y restringe benzo (a) pireno inducida por la tumorigénesis de pulmón en ratones albinos suizos [19] y alivia el desequilibrio de enzimas que metabolizan xenobióticos y marcadores tumorales [20]. De acuerdo con Anandakumar
et al.
[20] Sistema de capsaicina modula pulmonar defensa antioxidante en el benzo (a) pireno cáncer de pulmón inducida en ratones albinos suizos [19]. Además, la capsaicina muestra la actividad anti-proliferativa contra el cáncer de pulmón de células pequeñas humano en cultivo de células y modelos de ratones desnudos a través de la vía de E2F [21]. Informe reciente de nuestro laboratorio ha demostrado el efecto apoptogenic de la capsaicina en células de NSCLC humanos [22]. Sin embargo, no hay ningún informe sobre el papel de este fitoquímico sobre la angiogénesis inducida por NSCLC. Además, aunque capsacin se ha demostrado para suprimir la angiogénesis fibrosarcoma inducido por el hombre en POLLUELO ensayo de membrana corioalantoidea [23] mediante la inhibición de la proliferación inducida por VEGF, y la formación de tubos de tipo capilar de las células endoteliales humanas cultivadas primarias, el efecto de este fitoquímico en el la expresión del VEGF en células NSCLC aún no ha sido explorado en detalle.
Nuestros resultados significar que mientras impedimento de bucle inducido por la expresión de VEGF-p53 en las células SMAR1 NLCSC favoreciendo de este modo la formación de células endoteliales y migración de red (CE) en el ambiente de tumor , replanteo de estas señales pro-angiogénicos por capsaicina bloquea la producción de VEGF, incluso bajo condiciones hipóxicas, restringiendo así la formación de trabajo neto NSCLC inducida por las células endoteliales. Tal desarrollo de su comprensión pueden ofrecer el panorama de la orientación exclusivamente factores pro-angiogénicos y las vías para lograr una terapia más eficaz y convincente cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer humano, A549, MCF-7, HeLa, HCT-15, y fibroblastos pulmonares normales WI-38, se obtuvieron a partir del Centro Nacional para la Ciencia de la célula, la India, y se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO
2 en medio DMEM suplementado con 10% FBS (Lonza, NH), L-glutamina (2 mM), piruvato de sodio (100 mg /ml), aminoácidos no esenciales (100 mM), estreptomicina (100 mg /ml), penicilina (50 U /ml; Invitogen, CA) [24]. Se obtuvieron células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) a partir de HIMEDIA Cultivo Celular (Mumbai, India), y se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO
2 en M199 (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con 20% de SFB y CE suplemento de crecimiento (ECG; BD Biosciences, Bedford, MA). Todos los experimentos se realizaron con HUVECs entre pasajes 2-5. el número de células viables se determinó por exclusión con azul de Trypan prueba [11].
Para imitar la hipoxia, se cultivaron células A549 en presencia de 100 mmol /L CoCl
2 (Sigma, St Louis). Las células fueron tratadas con capsaicina (Sigma, St. Louis) como se requiere en el experimento. Cuando sea necesario, las células A549 se trataron con Brefeldina A (1 g /ml, Calbiochem, NJ) y /o MG 132 (10 mM, Sigma, St Louis) y /o VEGF recombinante (0,8 ng /ml, para mantener cantidad equivalente de VEGF que estaba presente en los medios de comunicación Hy-A549 gastados que se utilizan en relación 1:01 con M199 en células endoteliales; Peprotech, CA) y /o anticuerpo neutralizante de VEGF (25 ng /ml, R & amp; D Biosystems, MN), 6 horas antes de recoger las células.
cicatrización de heridas ensayo
ensayo de cicatrización de la herida se realizó para evaluar la migración de HUVEC. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos y se dejaron formar monocapas confluentes. Las monocapas fueron luego rayados horizontalmente usando una punta de pipeta de 100 l estéril. Luego, las células se cultivaron en medio que contiene 0,5% de FBS durante una noche y se expusieron a diferentes concentraciones de los agentes. Las células se lavaron con PBS y se cultivaron en medio DMEM. Se tomaron imágenes de campo claro de las vistas seleccionadas al azar a lo largo de la línea de raspado. La migración se cuantifica mediante un procedimiento asistido por ordenador semi-automatizado por una persona ciega respecto al tratamiento experimental. Los datos de pocillos por triplicado se calcularon como la media +/- SEM. La tasa de migración de las células de control se tomó como 100% y la de otras placas se compararon con las células de control [25].
Brote ensayo de formación de
Matrigel matriz (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) se descongelaron a 4 ° C durante la noche. placa de 12 pocillos se recubrió con 500 l de Matrigel /por pocillo y se incubó a 37 ° C durante 20 min para la polimerización. HUVECs (1 × 10
5) se resuspendieron en 500 l M199 que contiene 2% de FBS y diferentes concentraciones de los agentes, y se sembraron sobre la placa recubierta con Matrigel. Después de 6-8 horas de incubación, las HUVEC en el grupo de control formado estructura en forma de tubo, que se define como formaciones espinal endoteliales que a ambos lados. la formación de tubos se visualizó al microscopio (Olympus IX71) y se capturaron las imágenes de 10 campos seleccionados al azar por la cámara CCD.
Western Blot y co-inmunoprecipitación
Las células se homogeneizaron en tampón Hepes (20 mM Hepes, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM
2, 1 mM Na-EDTA, 1 mM Na-EGTA, y DTT 1 mM) suplementado con la proteasa y de fosfatasa mezclas de inhibidores de [24]. La concentración total de proteína de lisado celular se estimó por el método de Lowry. Igual cantidad de proteína se sometieron a SDS-PAGE, y después se transfirieron eléctricamente a membranas de PVDF (Millipore, Darmstadt, Alemania). Posteriormente, la membrana se bloqueó durante 1 h con leche no grasa al 5% en TBS-0,1% de Tween 20 (TBST) y se sondeó con anticuerpos específicos como, anti-VEGF, anti-TGF-β, anti-EGF, anti bFGF, anti-HIF-1α, anti-p53, anti-Cox-2, anti-SMAR1 /PNBA, anti-H1-histonas y anti-α-actina (Santa Cruz, CA), anti-fosfo-Ser15-p53, anti- EGFR (señalización celular, MA). La proteína de interés se visualizó mediante quimioluminiscencia (GE Biosciences, NJ) [24]. Para la co-inmunoprecipitación, inmunocomplejos de lisado de células enteras fueron purificados utilizando anticuerpos específicos y los granos A-Sepharose de proteína (Invitrogen, MD) y immunoblotted. La proteína de interés se visualizó mediante quimioluminiscencia. Equivalente a la carga de proteínas se verificó utilizando anticuerpos anti-a-actina.
La citometría de flujo
Para la determinación de la muerte celular por apoptosis, las células se tiñeron con yoduro de propidio (PI) y Anexina-V-FITC ( BD Pharmingen, CA) y se analizaron en el citómetro de flujo (FACS Callibur, BD Biosciences, CA). compensación electrónica del instrumento se hizo para excluir la superposición de los espectros de emisión. Total de 10.000 eventos fueron adquiridos para el análisis utilizando el software CellQuest (BD Biosciences, CA) [26]. células de Anexina-V-positivos fueron considerados como células apoptóticas tempranas [24]. Para la cuantificación de VEGF intracelular, las células pre-tratadas con Brefelidin A se cosecharon, se lavaron con PBS, se fijaron con 4% paraformaldehído durante 10 minutos y se permeabilizaron con 0,1% Triton-X-100 durante 5 min y se incubaron con anticuerpo anti-VEGF seguido de anticuerpo secundario conjugado con TRITC. La fluorescencia se determinó usando citometría de flujo de software CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA).
imágenes de fluorescencia
Las células cultivadas en un cubreobjetos fueron fijadas con 4% para-formaldehído y se tiñeron con anticuerpo específico después de la permeabilización con Triton X100, seguido de TRITC /anticuerpo secundario conjugado con FITC y se visualizaron con el microscopio confocal (Carl Zeiss, Alemania).
ELISA
se recogió el medio acondicionado de las células y clarificado por centrifugación a 2000 rpm durante 10 min. La concentración de la proteína de interés se midió usando el kit de ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ray Biotech, GA).
RT-PCR ensayo
Después de Saha
et al
. [11], 2 g del total de ARN se extrajo con el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU.) se transcribió inversamente y se sometió a PCR utilizando el sistema de RTplus PCR (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) un sistema GeneAmp PCR 2720 (Applied Biosystems; Foster City , CA). Los ADNc resultantes se amplificaron con cebadores específicos para VEGF-5 'GAGATGAGCTTCCTACAGCAC-3' (hacia delante) y 5'-TCACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3 '(hacia atrás), p53 5'-CCCACTCACCGTACTAA-3' (hacia delante) y 5'-3-GTGGTTTCAAGGCCAGATGT '(inverso), HIF-1α 5'-TGGTGACATGATTTACATTTCTGA-3' (hacia delante) y 5'-AAGGCCATTTCTGTGTGTAAGC-3 '(hacia atrás), SMAR1, 5'-GCATTGAGGCCAAGCTGAA-AGCTC-3' (hacia delante) y 5'-C GGAGTTCAGGGTGATGAGTGTGA -3 '(inverso), Cox-2 5'-TGAT-CGAAGACTACGTGCAACA-3' (hacia delante) y 5'-GCGGATGCCAGTGATAGAGTG-3 '(inverso) y GAPDH (patrón interno) 5'-CAGAACATCATCCCTGC-CTCT-3' (hacia adelante ), 5'-GCTT-GACAAAGTGGTCGTTGA-G-3 '(hacia atrás).
Los plásmidos y siRNA transfecciones
p53 pcDNA3.1, pcDNA3.1 SMAR1 y pcDNA3.0 Cox-2 o SMAR1-shRNA (300 pmol /millón de células), y los vectores pcDNA3.0 de control (2 g /millón de células) se introdujeron en las células cancerosas en crecimiento exponencial utilizando Lipofectamine-2000 (Invitrogen, CA) según el protocolo proporcionado por el fabricante. De forma estable clones que expresan se aislaron mediante dilución limitante por selección con G418 (400 mg /ml; Cellgro, EE.UU.) y puromicina (1 mg /ml; Cellgro, EE.UU.) durante 14 días, y las células que sobreviven este tratamiento se clonaron y se evaluaron para p53, SMAR1 y COX-2 por inmunotransferencia. Para silenciamiento endógena de genes específicos, las células se transfectaron con 300 pmol de HIF-1α- /Cox-2 -siRNA (Santa Cruz, CA) y p53 shRNA (Santa Cruz, CA) usando lipofectamina-2000 durante 12 h. Los niveles de ARNm y de proteína se determinaron por RT-PCR y Western Blot.
Inmunoprecipitación de cromatina y PCR
El chip de ensayo se realizó como se informó anteriormente por nuestro laboratorio [9]. En resumen, perlas de agarosa se bloquearon con BSA y, después del lavado, las perlas se pre-incubaron con anticuerpo contra SMAR1 /PNBA (BTG-3 proteína nuclear asociado; Santa Cruz, CA). Los lisados celulares se sometieron a ultrasonidos para cortar el ADN en longitudes entre 200 y 1000 pares de bases y después se centrifugaron a 13.000 rpm durante 10 min a 4 ° C. Los sobrenadantes se diluyeron 10 veces en tampón de dilución de chip y se añaden a las perlas de agarosa granulados que eran pre-incubadas con anticuerpos. Después de la incubación durante la noche a 4 ° C, se lavaron las perlas con bajo contenido de sal, alta concentración de sal, LiCl y tampones Tris /EDTA. Por último, la cromatina se eluyó por incubación de las perlas con 5 M de NaCl a 65 ° C y las proteínas se separaron por tratamiento con proteinasa K. DNA chip fue luego purificado usando un kit de purificación apropiado y se almacenó a -20 ° C. DNA ligado ChIP-SMAR1 se amplificó usando PCR. Las secuencias de sitios de unión probables SMAR1 en Cox-2 promotor son los siguientes: sitio-1: 5'-TGA-CCAGCATCCCAAATGTA-3 '(hacia delante) y 5'-TGAGGGA-AAAACAGGGCATA-3' (inversa); El sitio 2-5'-CAAAAAGAAAATGA-TCCACGC-3 '(hacia delante) y 5'-TCATGAGACACGGATGCCTA-3' (hacia atrás); El sitio-3 5'-CCGTGTCTCA-TGAGGAATCA-3 '(hacia delante) y 5'-ATCATGGGTAGTGCTCAGGG-3' (hacia atrás); El sitio 4-5'-TTCG-GTCATTTTCCTGAATGC-3 '(hacia delante) y 5'-GGGGATTTTGACAGTTGGAA-3' (hacia atrás); El sitio 5-5'-GCCCAGGCA-ACTGAAAAGTA-3 '(hacia delante) y 5'-CTCCCTGATGCGTGGATTAT-3' (hacia atrás); El sitio 6-5'-TTT-TGGACATTTAGCG-TCCC-3 '(hacia delante) y 5'-TGTTCTCCGTACCTTCA -CIC-3' (hacia atrás); El sitio-7 5'-TACCTTTCCC-GCCTCTCTTT-3 '(hacia delante) y 5'-TGGGGCGAGTA-AGGTTAAGA-3' (hacia atrás); El sitio-8 5'-AAC-CTTACTCGCCCCAGTCT-3 '(hacia delante) y 5'-CAGA AGGACACTTGG-CTTCC-3' (hacia atrás).
Cuantitativo PCR en tiempo real
real para la cuantificación -tiempo de PCR se realizó para cuantificar el tiempo que dependen de los niveles de expresión de VEGF y HIF-1α en células Hy-A549 capsaicina tratados (22). cuantitativa en tiempo real PCR se realizó en gradiente termociclador Maestro (un Applied Biosystems 7500 Sequence Detection System), utilizando SYBR verde mezcla Rox (ABgene, Epsom, Reino Unido). Los cebadores usados para VEGF son 5'-TCACAGGTACAGGGATGAGGACAC-3 '(hacia delante) y 5'-CAAAGCACAG-CAATGTCCTGAAG-3' (hacia atrás) y para HIF-1α 5'-TGGTGACATGATTTACATTTCTGA-3 '(hacia delante) y 5'-3-AAGGCCATTTCTGTGTGTAAGC '(inverso).
estadística
analiza
Los valores se han mostrado como error estándar de la media (SEM) o representante del experimento típico, salvo indicación en contrario. Se analizaron los datos, y cuando sea apropiado, la significación de las diferencias entre los valores medios se determinó por
t de Student
. Los resultados se consideraron significativos valores de
p Hotel & lt; 0,05. Todos los experimentos se realizaron de forma independiente tres veces |
Resultados
La capsaicina inhibe la migración y la formación de la red CE NSCLC inducidas
Dado que la migración CE es un paso esencial para la angiogénesis inducida por el tumor.; se determinó la migración de HUVEC en presencia de los medios de comunicación dedicado a partir de cultivos de células tanto normales como NSCLC. En esencia, HUVECs se cultivaron en ausencia o en presencia de medio gastado de las células pulmonares normales de fibroblastos (WI-38) y las células de NSCLC (A549) así como células A549 COCl
2-estimulado (Hy-A549). Los resultados de ensayo de curación de la herida mostraron migración no significativa de HUVECs en presencia de medio gastado de las células WI-38, mientras que se observó una migración significativa en presencia de los medios de comunicación A549 gastado, una situación que imitan la condición de portador de un tumor (Figura 1A) . Porcentaje de migración HUVEC fue aún más en Hy-A549 de medio gastado (Figura 1A), indicando que la condición hipóxica favorece la angiogénesis. Hy-células A549 fueron, por lo tanto, utilizados para el descanso de los experimentos para especificar condiciones hipóxicas.
(A) La migración de HUVEC en presencia o ausencia de medio gastado de NME, WI-38, A549 y A549-Hy (CoCl
2-estimulado para imitar la condición hipóxica requerido para la angiogénesis inducida por el tumor) se sometieron a ensayo de curación de heridas bidireccional durante 24 horas (
panel de la izquierda
). El número de células que migraron en el área de la herida están representados gráficamente (
panel de la derecha
). (B) Imágenes representativas de la migración HUVEC tras la incubación con capsaicina tratados (0-50 mM) medio gastado celular Hy-A549 (
panel izquierdo
). Porcentaje de células migraron en el área de la herida se ha representado gráficamente (
panel de la derecha
). las células (C) Hy-A549 fueron tratados con capsaicina en una manera dependiente de la dosis durante 24 h y la viabilidad celular se puntuó mediante el ensayo de tinte de exclusión de azul de tripano (
panel izquierdo
). células Hy-A549, tratados con capsaicina (37,5 mM), se sometieron a anexina-V-FITC /PI de unión y se analizaron flujo citometría para la determinación del porcentaje de apoptosis temprana (
panel derecho
). (D) el efecto citotóxico de diferentes dosis de capsaisin en las células HUVEC se midieron mediante el ensayo de tinte de exclusión con azul de tripano. (E) Representación gráfica de la migración HUVEC tras la incubación con los medios gastados de capsaicina tratados (37,5 M) HBL-100, HCT-15, HeLa y A549. (F) Imágenes representativas de la formación de brotes de tipo capilar por HUVEC en presencia de medio solo o gastados medios de WI-38 /A549 /A549-Hy /capsaicina tratados con Hy-A549. Los valores son medias ± SEM de tres experimentos independientes en cada caso o representante del experimento típico.
Curiosamente, pasado-media de la capsaicina tratados con Hy-A549, inhibió la migración de HUVEC inducida por tumor en una dosis de capsaicina -dependiente, siendo el efecto óptimo en 37,5 M de capsaicina a las 24 horas a partir del cual se pudo obtener ningún cambio significativo adicional (Figura 1B). El efecto de la capsaicina en la viabilidad de las células Hy-A549 se examinó por el ensayo de tinte de exclusión con azul de tripano. Figura 1C (
panel izquierdo)
representa el efecto dependiente de la dosis de la capsaicina en la viabilidad de las células Hy-A549, así como HUVEC (Figura 1D). Los resultados indicaron que la exposición durante 24 h, la capsaicina no indujo ninguna muerte significativa en cualquiera de las células hasta que la concentración de 37,5 mM. Estos resultados por lo tanto descartar la posibilidad de que el retraso de la migración EC debido a la muerte celular Hy-A549 a esta concentración de capsaicina. Sin embargo, se encontraron concentraciones superiores a 37,5 M a ser tóxicos para las células Hy-A549 y HUVEC (Figura 1C,
panel izquierdo
y 1D). Otros experimentos fueron, por lo tanto, restringidas a 37,5 M. Para evaluar si la reducción en el número de células se debe a la apoptosis temprana, el número de células positivas Anexina-V se determinó por citometría de flujo. Los resultados de la Figura 1C (
panel de la derecha
) demostraron 37,5 M dosis de capsaicina como dosis sub-apoptótica de las células Hy-A549. Estos resultados, junto garantizarse la ausencia de "interferencia" de células apoptóticas en 37,5 M dosis de capsaicina utilizada en los experimentos posteriores. Que el efecto de la capsaicina no se limita a un tipo específico, fue validado utilizando una pieza de líneas de células, es decir, HBL-100, HCT-15, HeLa y, MCF-7 (Figura 1E). Sin embargo, para estudios mecanísticos detallados experimentos se realizaron con células Hy-A549.
A continuación, el ensayo de formación de brotes de ECs se realizó en Matrigel, un ensayo de angiogénesis bien establecida. HUVECs formado redes similares a tubos dentro de las 8 h (Figura 1F). la formación de brotes angiogénicos de HUVECs fue mayor en la presencia de medio gastado de células Hy-A549 seguido de la de las células A549 y células WI-38 (Figura 1f). Sin embargo, la capsaicina pre-tratamiento de Hy-A549 obstaculizada de manera efectiva la formación de brotes por HUVEC (Figura 1F), donde estructuras tubulares se redujeron tanto en anchura como en longitud y mostraron incompletos, así como estructuras de red rotas (Figura 1F).
capsaicina inhibe VEGF para retardar inducida por células de cáncer de CE migración
Todas las reacciones se produjeron hasta ahora definen independiente del contacto directo de las células HUVEC con células tumorales o incluso proximidad, aumentando así la posibilidad de la presencia de tumor -shed factores pro-migratorias soluble en el medio gastado. En apoyo de esta, pasó medio de tratado con Brefeldina-A Hy-A549 no para inducir la migración significativa CE (Figura 2A) y la capsaicina no podría introducir más lejos efecto (Figura 2A). Para volver a confirmar nuestra hipótesis, el efecto de la capsaicina en la regulación de factores pro-angiogénicos como el VEGF, bFGF, EGF, TGF-β, se controló en un Brefeldina células Hy-A549 pretratadas. A pesar de que la capsaicina no lograron alterar bFGF, EGF y TGF-β niveles significativamente las reguladas expresión de VEGF (Figura 2B). Estudios posteriores revelaron que los medios gastados de células Hy-A549 (10
6 células /ml de medios de comunicación) contenían un promedio de 1,6 ng de VEGF que redujo significativamente después de la capsaicina tratamiento (Figura 2C,
panel de la izquierda)
. Que resuelva el efecto de la capsaicina en la regulación de VEGF en las células Hy-A549, hemos adoptado algunos enfoques. En el primer enfoque, las células Hy-A549 cuando pretratados-A Brefeldina fueron tratados con capsaicina durante 24 h, el VEGF intracelular fue abrogada tanto en mRNA y los niveles de proteína (Figura 2 C,
panel del medio
). Estas observaciones fueron apoyadas además por nuestra cuantitativa en tiempo real PCR datos que representan una disminución de la expresión relativa de ARNm de VEGF en las células Hy-A549 después del tratamiento con capsaicina (Figura 2C,
panel de la derecha
) y re-confirmada por microscopía confocal (Figura 2D). En el segundo enfoque, los medios de control suplementado con VEGF recombinante (0,8 ng /ml) aumento de la migración de células endoteliales y la formación de brotes (Figura 2E & amp; 2F). En el tercer método, cuando los medios gastado capsaicina pretratados Hy-A549 fue suplementado con proteína recombinante VEGF (0,8 ng /ml), la inversión de efecto capsaicina sobre la migración CE y brote formación se observó (Figura 2E & amp; 2F). En el cuarto enfoque, HUVECs mostró una reducción significativa de la migración (Figura 2E) y la formación de brotes (Figura 2F) cuando el medio gastado de células Hy-A549 fue pre-tratada con anticuerpo anti-VEGF. Sin embargo, el anticuerpo anti-VEGF no pudo proporcionar ningún efecto significativo adicional inhibidora sobre la migración HUVEC y la formación de brotes en la capsaicina pre-tratados medios Hy-A549 gastados (Figura 2E & amp; 2F). Estos resultados, junto validaron la hipótesis de que las células arrojar Hy-A549 VEGF juega un papel crucial en la migración de CE inducida por el cáncer y la formación de brotes. observaciones anteriormente amueblados nos incitó para demarcar el mecanismo subyacente a la completa regulación de la angiogénesis tumoral por la capsaicina.
(A) microfotografías de contraste de fase Representante que demuestran la migración HUVEC tras la incubación con el medio gastado de Brefeldina-A-pretratados, la capsaicina ( 37,5 M) tratados con células Hy-A549 (
panel izquierdo
). Porcentaje de células migraron en el área de la herida se ha representado gráficamente (
panel de la derecha
). (B) Las inmunotransferencias que muestran perfiles de expresión de factores pro-angiogénicos VEGF, bFGF, EGF, TGF-β, en presencia o ausencia de capsaicina. (C) VEGF secretado a partir de sobrenadante libre de células de Hy-A549 se cuantificó por ensayo ELISA (
panel izquierdo
). los perfiles de expresión dependientes del tiempo de VEGF-mRNA /-proteína en las células Hy-A549 capsaicina tratados fueron determinados por Western blot y RT-PCR, respectivamente (
panel del medio
). Se examinaron las células Hy-A549 capsaicina tratada para la variación dependiente del tiempo en los perfiles de expresión de VEGF por análisis de PCR cuantitativa en tiempo real y representados gráficamente (
panel derecho
). (D) Imágenes de Immuno-fluorescente (60x aumentos) que muestra un patrón dependiente del tiempo de la proteína VEGF (TRITC-fluorescente) en células Hy-A549 capsaicina tratados estaban representados junto con tinción nuclear (DAPI: azul). (E) Imágenes representativas de la migración HUVEC tras la incubación con (i) medios de control de VEGF-complementado recombinantes, o de medio gastado VEGF-complementado de células Hy-A549 capsaicina tratada, o con (ii) con tratamiento anti-VEGF Hy-A549 pasado medios (
panel izquierdo
). Porcentaje de células migraron en el área de la herida está siendo representado gráficamente (
panel de la derecha
). (F) Imágenes representativas de la formación de brotes de tipo capilar por HUVEC tras la incubación con medios recombinantes VEGF-complementado gastados de células Hy-A549 capsaicina tratada o con medio gastado anti-VEGF-tratada Hy-A549. GAPDH /α-actina se utilizó como control de carga interno. Los valores son medias ± SEM de tres experimentos independientes en cada caso o representante del experimento típico.
La capsaicina inhibe la transcripción de VEGF por la orientación de HIF-1α
A medida que la capsaicina reduce VEGF tanto en la transcripción así como los niveles de la traducción la hipótesis de que este fitoquímico podría tener un efecto regulador sobre HIF-1α, el principal factor de la transcripción de VEGF durante la hipoxia [4]. Curiosamente, la capsaicina reduce HIF-1α a nivel de proteínas, pero no a nivel de ARNm en células Hy-A549 (Figura 3A,
panel izquierdo
), el cual fue confirmado por nuestra cuantitativa en tiempo real PCR datos (Figura 3A,
panel de la derecha
). células Hy-A549 Además,-transfectadas con siRNA HIF-1α decoradas disminución en la expresión de VEGF (Figura 3B) y medio gastado de estos transfectantes demostrado significativamente menos migración CE (Figura 3C). Estos resultados indican que la capsaicina inhibe VEGF por abajo la modulación de su clave de factor de transcripción HIF-1α (Figura 3C). Sin embargo, dado que la capsaicina tratamiento de estos transfectantes demostrado la reducción adicional del VEGF, la participación de la vía (s) de HIF-1α-independiente de la inhibición de VEGF por la capsaicina no puede ser negada.
(A) dependientes del tiempo los perfiles de expresión de HIF -1α mRNA y-proteína se determinaron por Western blot y RT-PCR, respectivamente, en células Hy-A549 capsaicina tratado (
panel izquierdo
). Se examinaron las células Hy-A549 capsaicina tratada para la variación dependiente del tiempo en los perfiles de expresión de HIF-1α por análisis de PCR cuantitativa en tiempo real y representados gráficamente (
panel derecho
). (B) células Hy-A549, transfectadas transitoriamente con un no-focalización de control-siRNA o HIF-1α-siRNA, se incubaron con /sin capsaicina durante 24 h; a continuación, las células se analizaron para determinar la expresión del VEGF en la proteína y los niveles de mRNA (
panel izquierdo
). Inmunotransferencia que muestra la eficacia de transfección de HIF-1α (
panel de la derecha
) (C) transfectadas-HIF-1α-siRNA Control de siRNA /Hy-A549 sobrenadantes celulares se utilizaron para evaluar la migración de HUVEC mediante un ensayo de curación después de la capsaicina herida -tratamiento (37,5 M; 24 h) y la representación gráfica. (D) perfil de expresión dependiente del tiempo de p53-mRNA y-proteína se determinó por transferencia de Western y RT-PCR en células Hy-A549 capsaicina tratado (
panel izquierdo
). También se evaluó la fosforilación de p53 en la serina-15 posición (
panel de la derecha
). células (E) Hy-A549, transfectadas con control shRNA /p53-shRNA se incubaron con capsaicina para 24 h y HIF-1α VEGF-mRNA y-proteína se determinaron por Western blot y RT-PCR (
panel izquierdo
). La eficacia de transfección se comprobó mediante el análisis de nivel de expresión de p53 (
panel de la derecha
). (F) HIF-1α se inmunoprecipitó a partir de lisados de células Hy-A549 capsaicina tratada y inmunotransferencia con anticuerpo anti-Ub para ensayar ubiquitinación HIF-1α. La escalera de bandas representaba ubiquitinated HIF-1α. En el experimento paralelo, los inmunoprecipitados se analizaron para determinar los niveles de HIF-1a por Western blot. entrada proteína Comparable se confirmó mediante transferencia Western directa con anti-α-actina utilizando 20% de los lisados de células que se utilizaron para la inmunoprecipitación. células Hy-A549 pretratada con las drogas (G) de control y MG-132 se sometieron a la capsaicina-tratamiento durante 24 h y luego se examinaron para la expresión de HIF-1α /VEGF mediante transferencia Western. α-actina /GAPDH se utilizó como control de carga interno. Los valores son medias ± SEM de tres experimentos independientes en cada caso o representante del experimento típico.
La capsaicina se dirige a HIF-1α en una forma dependiente de p53
Desde p53 apunta directamente a HIF 1α para la degradación proteosomal [9], se evaluó el papel de p53, en su caso, en la regulación inducida por capsaicina de HIF-1α y VEGF.