Extracto
Antecedentes
Claudins se conocen como proteínas de unión estrecha, y su patrón de expresión en el cáncer gástrico es todavía controvertida. La relación entre los patrones de expresión de las proteínas de unión estrecha y la proliferación tumoral en el cáncer gástrico temprano todavía está lejos de ser clara.
Objetivos
Para investigar los patrones de expresión de claudina-18 y Ki-67 en cáncer gástrico temprano en el frente invasivo y que rodea la mucosa gástrica normal y para investigar la función biológica de la claudina-18 en la proliferación y la invasión de las células cancerosas.
Métodos
el setenta y cinco por cáncer gástrico precoz se evaluaron las lesiones extirpadas mediante la resección endoscópica de la mucosa o la resección endoscópica de la submucosa. Todas las lesiones fueron diagnosticadas con cáncer gástrico como adenocarcinoma diferenciado utilizando la Clasificación japonesa de carcinoma gástrico. Para evaluar la proliferación epitelial, inmunotinción con Ki-67 se llevó a cabo, y se calculó el índice de marcaje. Para evaluar la expresión de las proteínas de unión estrecha epiteliales, se realizó la tinción de inmunofluorescencia de claudin-18. La inmunorreactividad de claudin-18 se clasificó de acuerdo con el número de células teñidas. El análisis de correlación se realizó mediante el coeficiente de correlación de Spearman. La transfección de claudina-18 pequeños ARN de interferencia (siRNA) se llevó a cabo en MKN74, una línea celular de cáncer gástrico claudina-18-positivas, para investigar el efecto de la claudina-18 sobre la proliferación y la invasión de las células cancerosas.
Resultados
Claudín-18 fue significativamente las reguladas en el cáncer gástrico en comparación con la mucosa normal circundante gástrica o la metaplasia intestinal. El índice de etiquetado Ki-67 de cáncer gástrico en el frente invasivo se correlacionó inversamente con el nivel claudin-18, pero que a la lesión de la mucosa no se correlacionó. Claudin-18 desmontables promovió significativamente la proliferación de MKN74 comparación con las células siRNA transfectadas de control. MKN74 invasión aumentó significativamente con claudin-18 siRNA transfección en comparación con la transfección de control de siRNA.
Conclusiones
Down-regulación de claudin-18 se asocia con el potencial proliferativo en el frente invasivo del cáncer gástrico, lo que sugiere que tiene un papel fundamental en la progresión del cáncer gástrico
Visto:. Oshima T, J Shan, Okugawa T, Chen X, K Hori, Tomita T, et al. (2013) baja regulación de Claudín-18 se asocia con el potencial proliferativo e invasivo del cáncer gástrico en el frente invasivo. PLoS ONE 8 (9): e74757. doi: 10.1371 /journal.pone.0074757
Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 28 de mayo de 2013; Aceptado: 6 Agosto de 2013; Publicado: 20 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Oshima et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón a través de una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica (C) 2010-2012 (Nº 22590691). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es el cuarto cáncer más comúnmente diagnosticado y la segunda causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [1], [2]. Intramucoso GC puede ser tratado de forma curativa mediante tratamiento endoscópico. Por otra parte, la técnica de disección endoscópica submucosa (ESD) ha ampliado las indicaciones para el tratamiento endoscópico y habilitado resección en bloque de intramucoso grande y poco invasiva precoz submucosa GC [3]. Una resección en bloque por EDS permite un diagnóstico preciso de la profundidad del cáncer [4].
Las uniones estrechas (TJS) son dominios de membrana especializadas en la región más apical del epitelio polarizado y células endoteliales [5]. Claudins son las principales proteínas TJ; que consisten en al menos 27 proteínas miembros y se expresan de una manera específica de tejido [6], [7]. Regulan la permeabilidad paracelular y establecen polaridad celular epitelial por su función valla [6], [8]. Un creciente cuerpo de evidencia reciente sugiere que claudinas son componentes estructurales y funcionales clave de hebras TJ [6], [9], y puede desempeñar un papel crucial en la tumorigénesis y la inflamación [10], [11].
El epitelio gástrico exhibe una serie de cambios en la expresión claudin de mucosa normal a metaplasia intestinal y adenocarcinoma. Aunque GCs han sido recientemente clasificados por la expresión a base de mucina [12], [13], una clasificación basada en GC claudin También se ha propuesto [14]. También hemos informado de que la baja regulación de la claudina-3 estaba relacionada con la proliferación de intramucoso GC [15]. Recientemente, los ratones knock-out claudina-18 mostraron tener atrofia de la mucosa gástrica y paracelular H
+ ion de fugas [16]. Claudina-18a2 se demostró que con frecuencia las reguladas en GC de un fenotipo intestinal, lo que sugiere que la claudina-18a2 sería un buen marcador de GC [17]. Sin embargo, la función biológica de la claudina-18, que podría estar involucrado en el comportamiento de las células cancerosas, nunca se ha examinado. Por otra parte, no está claro qué característica de las células de GC en el frente invasivo está relacionado con el rápido crecimiento o la agresividad de la invasión
.
En el presente estudio, el nivel de expresión de claudina-18 en GC en el frente invasivo y mucosa gástrica circundante se examinó por primera vez, y se evaluó la correlación entre el nivel claudin-18 y el índice de etiquetado Ki-67 (LI) en GC. El efecto de la claudina-18 sobre la proliferación y la invasividad
in vitro
también fue examinado.
Materiales y Métodos
Los pacientes
Una serie consecutiva de 74 pacientes se estudió con GC temprana (Tabla 1). Se evaluaron las lesiones GC (n = 75) que habían sido sometidos a EMR curativa o ESD. GC con invasión submucosa (n = 31) fueron incluidos en este estudio. cánceres dobles se detectaron sólo en un paciente de sexo masculino. Toda la GC fueron clasificados como adenocarcinoma diferenciado utilizando la Clasificación japonesa de carcinoma gástrico [18]. el anonimato del paciente se conservó. Este estudio se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité de ética /Junta Institucional de Hyogo la Facultad de Medicina de la opinión. El tema dieron su consentimiento informado por escrito.
La inmunohistoquímica
Las muestras se fijaron con formalina al 10% y embebidos en parafina. Se cortaron secciones de 3 m de espesor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE). Para evaluar la proliferación epitelial, las muestras se incubaron con el anticuerpo monoclonal Ki-67 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), seguido de incubación con el anticuerpo secundario biotinilado de caballo anti-ratón (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). El método de complejo de estreptavidina-biotina (Vector Laboratories) se utiliza para visualizar la inmunorreactividad. Los núcleos se contratiñeron con hematoxilina.
Inmunofluorescencia La tinción de la unión Las proteínas
conejo anti-claudin 18-anticuerpo policlonal (Invitrogen) y la IgG de cabra anti-conejo conjugado con Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove , PA, EE.UU.) anticuerpo secundario se utiliza para visualizar la inmunorreactividad. La especificidad de la reacción se ensayó por incubación con suero de conejo no inmune (Dako, Glostrup, Dinamarca).
Scoring de inmunotinción de claudina-18 y Ki-67
La inmunorreactividad se evaluó dos observadores independientes (T.Ok., XC), y ambos fueron ciegos a las características clínico-patológicas y los resultados clínicos asociados con cada muestra. se evaluaron para no mucosa gástrica neoplásica sin metaplasia intestinal (no IM) y con metaplasia intestinal (IM) y de las regiones de cáncer. La inmunorreactividad de claudin-18 se clasificó utilizando los siguientes criterios: 0, ausencia de tinción de la membrana; 1+, menos de 10% de las células tumorales con tinción completa de la membrana; 2 +, 10% a 50% de las células tumorales con tinción completa de la membrana; 3+, más de 50% a 75% de las células tumorales con una fuerte tinción completa, la membrana; y 4+, más de 75% de las células con muy fuerte tinción completa, membrana. Cinco campos de alta potencia se analizaron en cada región de los casos y se calculó la puntuación media. Todas las secciones fueron anotados dos veces para confirmar la reproducibilidad de los resultados. El Ki-67 LI se calcula después de contar las células cancerosas 1000.
sirna (siRNA) desmontables experimentos
Para siRNA silenciamiento de claudina-18 humana, en el blanco más SmartPool y un no control de siRNA específico de fue adquirido de Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, EE.UU.). La línea celular MKN74 (Colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación Banco de Células, Osaka, Japón), que es
CLDN18
-positivo, fue seleccionado para estudiar los efectos de la claudina-18 desmontables sobre las propiedades de proliferación e invasión de células GC . Las células fueron transfectadas con 25 nM de ARNsi utilizando DharmaFECTTM3 (Dharmacon, Inc.). Los grupos de control y de ARNsi de control se trataron con los reactivos de transfección sin siRNA y los reactivos de transfección con el control no específico siRNA, respectivamente. Los ensayos se realizaron 3 días después se transfectaron las células MKN74.
Ensayo de proliferación celular
La proliferación celular se determinó mediante un ensayo colorimétrico de viabilidad celular basado en la escisión de la sal de tetrazolio WST-1 por deshidrogenasas mitocondriales (Takara Bio Inc., Otsu, Japón). La absorbancia del tinte de formazán formado, que se correlaciona con el número de células metabólicamente activas en el cultivo, se midió a 450 nm de 1 h después de la adición del reactivo.
Invasion Ensayo
invasión de células MKN74 se ensayó en 24 pocillos cámaras Biocoat Matrigel Invasion (8 micras; Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las cámaras inferiores se rellenaron con RPMI1640 con 10% de FBS, y las células (2 × 10
5) se colocaron en las cámaras de inserción, que contenían RPMI 1640 sin FBS. Después de 24 h de incubación, las células no invasivas se eliminaron con un hisopo de algodón. Las células que han migrado a través de la membrana y adheridos a la superficie inferior de la membrana se fijaron con formalina al 10% y se tiñeron con hematoxilina. Para la cuantificación, las células fueron contados bajo un microscopio en cinco campos de alta potencia al azar. Los ensayos se realizaron por triplicado. Se calculó la relación de controlar la invasión medio.
Análisis estadístico
La evaluación estadística se realizó mediante SPSS13.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.). El análisis de correlación se realizó mediante el coeficiente de correlación de Spearman (rs). Comparaciones múltiples se realizaron mediante el test de Kruskal-Wallis seguido por prueba de Scheffe. comparaciones individuales se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
Expresión de Claudín-18 en la mucosa gástrica y el carcinoma
Un total de 75 casos de CG diferenciadas se analizaron en este estudio. Las secciones se tiñeron con claudin-18, y el nivel de tinción se clasifican. Claudin-18 se detectó en altos niveles en las células epiteliales gástricas en las fronteras lado apical y lateral en no-IM pero no en IM o células de adenocarcinoma diferenciadas (Fig. 1A). Los niveles de claudina-18 fueron significativamente más bajos en las células cancerosas que en las no-IM y mensajería instantánea, así como significativamente menor en comparación con IM no-IM (fig. 1B).
(A) tinción HE de mucosa gástrica con metaplasia intestinal no (no-IM), metaplasia intestinal (IM), y el cáncer. se detecta claudin-18 en la mucosa gástrica con la no-IM en la frontera de la superficie y membrana lateral de las células epiteliales, pero no con IM o cáncer. barra blanca = 100 micras, Amarillo bar = 50 micras. (B) Nivel de Claudín-18 es significativamente menor en los GC que en los no-IM o IM. El nivel es también significativamente menor en IM que en los no-IM.
#
P Hotel & lt; 0,05 frente a IM. **
P
. & Lt; 0,01 frente a no-IM
Detección de Claudín-18 en los GC con submucosa Invasion
GC casos representativos con la invasión submucosa mostró que densa claudina-18 tinción fue evidente en el frente invasivo de las células de la submucosa invadido el cáncer, y Ki-67 LI fue baja en la lesión (Fig. 2A). En un caso con baja claudina-18 tinción en el frente invasivo de las células del cáncer invadido la submucosa, Ki-67 LI fue elevada a la lesión (Fig. 2A).
tinción HE muestra casos de submucosa GC invasivo. Ki-67 núcleos positivos se detectan en las células cancerosas. El Ki-67 LI es baja en un caso de submucosa positivo claudina-18 tinción (3+) (izquierda) y alta en un caso de submucosa negativo claudina-18 tinción (0) (derecha). Bar = 100 micras. (B) El Ki-67 LI se correlaciona inversamente con el nivel de claudina-18 (rs = -0.550,
P = 0,0010
).
Correlación de la Claudín-18 Nivel y Ki-67 LI
el Ki-67 LI de GC en la mucosa y submucosa se determinó por el porcentaje de núcleos Ki-67-positivas. Para determinar la correlación entre la Ki-67 LI y el nivel claudin-18, se realizó un análisis de correlación. El nivel de expresión de la mucosa de la claudina-18 no se correlacionó significativamente con el Ki-67 LI (rs = 0,07,
P = 0,60
). Por otro lado, el nivel de expresión de la submucosa claudin-18 fue significativamente inversamente correlacionada con la submucosa Ki-67 LI (rs = -0,550,
P
= 0,0010) (Fig. 2B).
Efecto de Claudín-18 siRNA sobre la proliferación e invasión de células GC
Una línea celular GC, MKN74, expresado constitutivamente claudina-18, y el nivel de ARNm de claudina-18 se redujo significativamente de siRNA contra claudin- 18 (Fig. 3A). La tinción de inmunofluorescencia con claudina-18 también se redujo después de la transfección (Fig. 3B). En la claudina-18-MKN74 el regulado, el crecimiento celular se incrementó significativamente (Fig. 4A), y la invasión de las células se incrementó significativamente (Fig. 4B).
(B) Tinción de claudina-18 es reducido por el tratamiento siRNA-18 claudin. Bar = 50 micras. Cada valor representa la media ± DE de 3 experimentos independientes. **
P Hotel & lt; 0,01 frente a control o el control de siRNA
(A) Tratamiento Claudín-18 siRNA induce significativamente la proliferación celular.. (B) 18 claudin-células MKN74 siRNA transfectadas muestran una relación de invasión significativamente mayor en comparación para controlar o controlar las células siRNA transfectadas. imágenes típicas se presentan en la parte superior. Bar = 500 micras. Cada valor representa la media ± DE de 3 experimentos independientes. **
P
. & Lt; 0,01 frente a control o el control de siRNA
Discusión
La expresión alterada de claudinas en la parte delantera de la submucosa invasiva podría estar relacionado con la progresión de GC. Estudios recientes sugieren que incluso en ligeramente submucoso GC invasiva sin linfático y la invasión vascular, ESD podría ser factible como una operación curativa [19]. Sin embargo, todavía no está claro qué casos de la submucosa poco invasiva GC se pueden seguir sin más después de la cirugía de la EDS. En el presente estudio, se encontró que no había una correlación inversa entre el nivel claudin-18 y Ki-67 positividad en el frente invasivo de la submucosa GC invasivo, y que claudin-18 la invasión de células GC regulado y la proliferación. Ki-67 inmunohistoquímica se ha sustituido para el recuento mitótico en la evaluación de la proliferación de células tumorales. Los estudios han demostrado que la Ki-67 se correlaciona con células no diferenciadas y metastásicos en tumores malignos [20]. En este estudio, se estudió GC solamente EMR /resecado ESD-en el que la indicación se limita al tipo diferenciado de GC. Por lo tanto, estos datos indican que el nivel de Ki-67 en la parte delantera invasivo estaba relacionado con las células metastásicas en tumores malignos, y que la pérdida de claudin-18 fue uno de los marcadores de la agresividad GC y podrían estar relacionados con el desarrollo de metástasis, lo que requiere cirugía adicional después del tratamiento ESD
Claudins son anormalmente regulada en una variedad de tumores malignos tales como GC, carcinoma hepatocelular, carcinoma del tracto biliar, cáncer de mama, carcinoma de células renales, y mesotelioma [15], [21] -. [ ,,,0],25]. El cambio en claudins en las uniones se asocia con la pérdida de adhesión apretado y la polaridad en el epitelio. La pérdida de la polaridad se asocia con aumento de la proliferación celular y epitelio-mesenquimal, mientras que las interrupciones en los complejos de unión estrecha alteran las interacciones célula-célula, que están relacionados a la invasión y metástasis [23], [26], [27]. En los estudios observacionales, la disminución de la claudina-3 y -4 se han reportado en las células de GC en el frente invasivo y se encontraron que se correlaciona con la progresión del cáncer y la metástasis [14]. Down-regulación de claudins También se ha informado en algunos otros tumores epiteliales, incluyendo la pérdida de claudin-1 en cáncer de mama [28] y el cáncer de colon [29], así como la pérdida de claudin-7 en cáncer de mama [30] y cáncer de cabeza y cuello [31]. En cuanto a la invasión de células tumorales, la reducción de expresión de claudin-7 en el frente invasivo se encontró que se correlaciona con la profundidad de la invasión y la participación linfático en el carcinoma de células escamosas del esófago [32]. A pesar de que la claudina-3 y claudina-7 expresiones fueron más bajas en el frente invasivo submucosa que en las lesiones de la mucosa en nuestro estudio anterior, claudina-3 y claudina-7 niveles en la parte delantera invasiva no se correlacionaron con el Ki-67 LI [15]. Por otro lado, claudin-18 en la parte delantera invasiva se correlacionó inversamente con la Ki-67 LI en el presente estudio. Estos datos pueden estar relacionados con los hallazgos que la claudina-3 y claudin-4 no estaban relacionados con la metástasis de los ganglios linfáticos [33]. Por otra parte, estos estudios de observación no se puede explicar si estos cambios afectan directamente a la invasión tumoral y la metástasis.
Claudín-18 se expresa principalmente en el estómago y células epiteliales del pulmón. Claudina-18a2 es la forma para el estómago, y las isoformas son ligeramente diferentes. En un informe anterior, de tipo gástrico claudina-18 se perdió en GC [17]. Sin embargo, durante metaplasia intestinal, el patrón de expresión de claudins ya difiere de la de los epitelios gástricos normales. Se encontró que la desaparición de claudin-18 para ser asociado con metaplasia intestinal en el estómago [17]. Por lo tanto, la pérdida de claudin-18 expresión en GC avanzada [17] puede no simplemente demostrar el carácter del cáncer. Incluso en el proceso de la progresión de la GC, el nivel de expresión puede cambiar. Para explorar la función de estas moléculas diana, pensamos que era importante examinar tumores en la misma etapa, y se evaluó el nivel de claudina-18, lo que podría afectar a la invasión y la metástasis, en la submucosa ligeramente lesiones invasivas GC. Además, claudin-18 de la mucosa gástrica puede no funcionar justo en TJs, porque la localización expresada en la superficie celular no era sólo en TJs. Se necesitan más investigaciones para examinar las expresiones de proteínas TJ fisiológicos y fisiopatológicos en la membrana lateral.
Para examinar si las alteraciones en los niveles de claudin-18 en la parte delantera invasiva submucosa contribuyó a la proliferación y la invasión de las células cancerosas, un ARNsi enfoque se utilizó para derribar la proteína en la línea celular MKN74 GC, lo que es positivo para la claudina-18. Por lo tanto, el presente estudio mostró por primera vez que la función de claudin-18 en GC usando un enfoque genético, y que la pérdida de claudin-18 estaba involucrado en la proliferación e invasión de células de GC. Junto con estos datos, pérdida de claudin-18 en la parte delantera de la submucosa invasivo indica la adquisición de las características más agresivas y podría permitir la disociación de las células durante la invasión celular. Sin embargo, una limitación de este estudio fue que sólo MKN74 podrían examinarse, porque era la única línea celular de cáncer gástrico diferenciado que expresa la claudina-18 por lo que hemos examinado. Por lo tanto, fenómenos similares no puede ser reproducido con otras líneas celulares de cáncer gástrico.
Tanto la sobre regulación y baja regulación de haber sido informado de que participen en el proceso del cáncer [34], [35] claudinas. Para el análisis de la función de claudins en células de cáncer, también se ha informado de enfoques genéticos a claudins en diversas células cancerosas. Desmontables de claudina-1 de siRNA resultó en la inhibición de la migración de células de cáncer de colon [36]. La sobreexpresión de la claudina-6, claudina-7, o claudin-9 impulsarse el potencial invasivo de una línea celular de adenocarcinoma gástrico [37]. Tal proliferación e invasión claudina-inducida puede parecer paradójico, ya que son conocidos claudinas estar implicados en el sellado de uniones epiteliales. Estos datos sugieren controversiales que las funciones de claudinas son tanto de tipo específico y subtipo de células.
Como limitación de este estudio, que todavía no está claro que esta disminución de la claudina-18 en el nivel de la submucosa frontal es invasivo realmente involucrados en la metástasis del cáncer, ya que es difícil de seguir la historia natural de principios de los GC. Sin embargo, los datos de este estudio indican que un nivel más bajo claudina-18 en la parte delantera invasiva se asoció con una mayor tendencia proliferativa. Es necesario examinar prospectivamente si esta disminución en el nivel de claudin-18 se puede utilizar como un metastásico y biomarcador pronóstico después de la resección endoscópica en un estudio futuro.
En resumen, se ha demostrado por primera vez que claudin-18 se expresa de forma heterogénea en la parte delantera invasiva submucosa de GC temprano, y la baja regulación de claudin-18 se asocia con el potencial proliferativo e invasivo de GC. Estos resultados indican que claudin-18 tiene un papel fundamental en la progresión de la GC y puede ser un biomarcador candidato de progresión de la enfermedad. Un claudina-18 desmontables experimento confirmó que la supresión de la unión claudina-18 promueve la proliferación e invasión de células GC.
Reconocimientos
Agradecemos a Noriko Kamiya para la asistencia técnica.