Extracto
Los estudios han demostrado que el miR-221 y miR-222 se desregulada en muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata. Sin embargo, la función biológica y los mecanismos subyacentes de miR-221 y miR-222 en la patogénesis del cáncer de próstata independiente de andrógenos todavía no están claras. La proliferación, la apoptosis, la distinción del ciclo celular, y la capacidad de migración de las células de la próstata se determinaron después de la transfección de miR-221 o miR-222 inhibidor. Se investigaron el impacto biológico y la regulación de SIRT1 en las células de cáncer de próstata. MiR-221 y miR-222 fueron altamente expresado en células PC-3 en comparación con el de las células LNCaP. Después de miR-221 o miR-222 expresión fue inhibido, las tasas de proliferación y migración de células PC-3 disminuyeron y aumentaron la tasa de apoptosis. Por otra parte, la proteína SIRT1 fue hasta reguladas en las células después de que fueron transfectadas con el miR-221 o miR-222 inhibidor. Las células transfectadas con siSIRT1 mostraron un aumento de la migración y una tasa de apoptosis disminuida, pero no hubo ningún efecto significativo sobre la proliferación celular en comparación con los controles. Hubo una correlación negativa entre el miR-221 o miR-222 y SIRT1, pero no se identificó ninguna relación directa destino. Estos datos demuestran que miR-221 y miR-222 son altamente expresado en células PC-3. Su inhibición conduce a la proliferación celular y la migración reducida y aumento de la apoptosis en células de cáncer de próstata. Estos efectos son potencialmente mediados por la regulación de la SIRT1
Visto:. Yang X, Y Yang, Gan R, L Zhao, Li W, Zhou H, et al. (2014) baja regulación de miR-221 y miR-222 Reprime la proliferación de células del cáncer de próstata y la migración que es en parte mediada por la activación de SIRT1. PLoS ONE 9 (6): e98833. doi: 10.1371 /journal.pone.0098833
Editor: George Calin, Universidad de Texas, MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Febrero, 2014; Aceptado: May 7, 2014; Publicado: Junio del 3, 2014
Derechos de Autor © 2014 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China y la Fundación de Ciencias Naturales Provincial de Zhejiang (81170257 y Y2110513). Este estudio también fue apoyado en parte por el Fondo Anderson Centro de Cáncer MD inicio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es una de las enfermedades más comunes y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres en el mundo occidental. Aproximadamente 238.590 nuevos casos se diagnosticaron en 2013 [1]. La mayoría de los PCA crecen lentamente y son dependientes de andrógenos para el crecimiento; por lo tanto, que responden al tratamiento de privación de andrógenos (ADT). ADT es eficaz, pero la enfermedad de la mayoría de los pacientes finalmente llegará a ser refractaria y el progreso de CaP andrógeno-dependientes de andrógeno-independiente (resistente a la castración) ACC, que trajo grandes desafíos para el tratamiento de CaP [2]. Por lo tanto, la identificación de un enfoque terapéutico nuevo y efectivo ha convertido en el foco de la lucha contra el CP
.
Los microARN (miRNA) son pequeñas (aproximadamente 21-23 nucleótidos), ARN no codificantes de proteínas que funcionan como post- reguladores transcripcionales de los genes diana. Estas moléculas se encuentran principalmente en las células eucariotas y están totalmente o parcialmente integrados, de manera complementaria, con el ARNm objetivo 3'UTR, lo que resulta en la inhibición de la degradación o la traducción de ARNm diana. miARN funciones en la regulación transcripcional y post-transcripcional de la expresión génica, que influyen en muchos procesos biológicos celulares [3]. miRNAs están involucrados en varios procesos de diferenciación celular, proliferación y apoptosis que están estrechamente relacionados con la tumorigénesis [3]. Recientemente, algunos miRNAs expresadas aberrantemente fueron descubiertos en CaP y otros tipos de cáncer, lo que indica que desempeñan un papel crítico en el mecanismo molecular de la patogénesis y progresión del cáncer [2], [4] - [8]. Además, los estudios han demostrado que el miR-221 y miR-222 están desreguladas en muchos tipos de cáncer, incluyendo CaP [9] - [14], y los dos miRNAs juegan un papel importante en la tumorigénesis y progresión de CaP andrógeno-dependiente a independiente de andrógenos CP [15] - [17]. Sin embargo, los resultados son inconsistentes e incluso controversial y los mecanismos subyacentes todavía no están claras.
En los mamíferos, el regulador de información silencio 1 (SIRT1) es un miembro de la familia de las sirtuinas y se ha demostrado ser altamente homóloga con SIRT2 en la levadura [18]. SIRT1 también se conoce como dependiente de NAD histona desacetilasa y está implicado en la regulación de muchos procesos fisiológicos, tales como la proliferación celular, la respuesta inflamatoria, el ciclo celular, y la migración celular [19]. Sin embargo, se desconoce si SIRT1 actúa como un gen supresor de gen promotor o debido a su complejidad [20] - [23]. Su papel en el cáncer no ha sido bien definida. Por ejemplo, SIRT1 mostró acción anti-oncogén y su nivel de expresión se asocia con el pronóstico en el cáncer de colon [24], [25]. Sin embargo, se considera un oncogén en el cáncer de mama [26]. En el CP, sin embargo, el papel de SIRT1 sigue siendo controvertida [27], [28].
En este estudio, se investigó su papel regulador de miR-221 y miR-222 y sus posibles mecanismos moleculares en el CaP mediante la transfección de miR-221 o miR-222 inhibidor en células de CaP.
Materiales y Métodos
cultivo de células y transfección del plásmido
CaP humano PC-3 células (independiente de los andrógenos ) y las células LNCaP (andrógeno-dependiente) se adquirieron en el Instituto de Bioquímica y Biología celular de la Academia china de Ciencias. Las células se mantuvieron en F12 (Gibco, Carlsbad, CA) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) (Gibco, Carlsbad, CA) a 37 ° C en una atmósfera de CO2 al 5%.
El pcDNA3.1- vector vacío (pEX-5), pcDNA3.1-hsa-miR-221 esponjas de inhibidor (miR-221 inhibidor), pcDNA3.1-HSA-miR-222 esponjas de inhibidor (miR-222 inhibidor), pGPU6 vacío (pGPU6) y pGPU6-siSIRT1 (siSIRT1) fueron sintetizados por GenePharma (Shanghai, china). La de tipo salvaje región 3'UTR SIRT1 se construyó en psiCHECK-2 por GenePharma (Shanghai, China). Células PC-3 fueron cultivadas a 80% -90% de confluencia y se transfectaron con plásmidos usando Lipofectamine 2000 (DNA /Lipofectamine 2000 = 1/2) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuatro horas después de la transfección, el medio de cultivo fue reemplazado con F12 fresco que contenía 10% de FBS. Una expresión de la transfección estable de líneas de células se estableció después de las células habían sido incubadas en medio F12 completo con G418 (1000 g /ml) durante 15 días. Verificamos los clones mediante Western blot y PCR en tiempo real, y se agruparon los clones de éxito para los experimentos. Los resultados de la verificación de western blot se muestran en la Figura S1. Además, todos los experimentos también fueron confirmados por transfección transitoria.
La proliferación celular y el ciclo celular ensayo
Para el ensayo de proliferación celular, sembramos PC 3-células con expresión estable establecido (pEX- 5, el miR-221 inhibidor, miR-222 inhibidor, pGPU6, o siSIRT1) en microplacas de 96 pocillos a una densidad de 2 × 10
3 células por pocillo y se les incubó durante varios períodos de tiempo (1 a 7d). Después de eso, 10 l de contador de células Kit-8 de reactivo (CCK-8) a cada pocillo y se incubaron las células a 37 ° C durante 1,5 h. Se midió la absorbancia a 450 nm usando un lector de electroluminiscencia ensayo inmunoabsorbente (ELISA).
Para el ensayo de ciclo celular, las células transfectadas se sembraron en placa de 12 pocillos durante 48 h. Las células en cada pocillo se recogieron y se fijaron con etanol al 70% enfriado en hielo durante 24 horas a -20 ° C. Después de ser lavado con solución salina tamponada con fosfato (PBS) tres veces, se incubaron con RNasa durante 1 h en hielo y se tiñeron con yoduro de propidio durante 15 minutos en hielo. La distribución de ADN se midió por citometría de flujo en 4 h.
Apoptosis ensayo
Las células transfectadas de forma estable se sembraron en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante 48 h. Las células se recogieron a continuación y se recogieron por centrifugación a 2000 rpm. Después de ser lavado con PBS tres veces, se tiñeron con proteína mejorada-V Anexina verde fluorescente (FITC) y yoduro de propidio (PI) durante 15 min, protegido de la luz. La tasa de apoptosis de las células se determinó mediante citometría de flujo en 1 h.
Heridas ensayo de la curación y la migración transwell ensayo
Un ensayo de cicatrización de la herida se realizó para imitar la migración celular [26]. En resumen, las células transfectadas se sembraron en una placa de seis pocillos a una densidad de 1 × 10
6 células por pocillo. Las células fueron cultivadas a 80% de confluencia y varias líneas de heridas estaban rayados verticalmente a la parte inferior con una punta de pipeta de 200 l. Después de ser lavado con PBS tres veces, las células se incubaron en medio de crecimiento que contiene 1,5% de suero. La anchura de la herida se determinó cada 24 h durante un período de 72 horas a 100 × bajo un microscopio Nikon Eclipse TS100 (Nikon, Japón). Los valores se expresan como el porcentaje de cierre de la herida, que se calcula de la siguiente manera: porcentaje de cierre de la herida = 1- (ancho
t
/anchura
0
) × 100 %.
para el ensayo de migración transwell celular, las células se mueren de inanición durante 24 h, se resuspendieron con medio F12 libre de suero, y se sembraron (5 × 10
4 células) en un transwell 24 pocillos con una 8- micras de poro de la membrana de inserción (Corning, EE.UU.). medio F12 suplementado con 10% FBS, se colocó en la cámara inferior como un quimioatrayente. Las células se incubaron durante 72 h. Las células que penetraron la membrana fueron fijadas con 4% de paraformaldehído durante 15 min, se tiñeron con cristal violeta durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se fotografiaron bajo el microscopio (Nikon, Japón). células invadidas se eluyeron hacia abajo con ácido acético. Se midió la absorbancia a 590 nm en un lector de ELISA.
Invertir la transcripción y en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa
Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el ARN total fue extraído a partir de células cultivadas utilizando TRIzol (Invitrogen , EE.UU.) siguiendo los protocolos del fabricante. Por miARN y SIRT1 transcripción reversa, 500 ng de ARN total fueron transcritas invertir cDNA con cebadores específicos de genes miARN RT (RiboBio, China) y cebador aleatorio (Takara, Japón), respectivamente. La expresión génica se midió mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (PCR) utilizando un Applied Biosystems 7500 Secuencia Fast sistema de detección y SYBR Green PCR Kit (QIAGEN, Alemania) bajo las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 10 seg y el recocido y extensión a 60 ° C durante 30 seg. Los niveles relativos de expresión de ARNm de los genes miARN y se normalizaron por U6 y β-actina, respectivamente.
Western El análisis de transferencia
Setenta y dos horas después de la transfección, se cosecharon y se lisaron en presencia de una células cóctel inhibidor de la proteasa y se centrifugó a 12.500 rpm durante 20 minutos a 4 ° C. Se recogió la fracción sobrenadante y la concentración de proteínas se midió utilizando un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (Shenggong Bio-Tech Co, Ltd, Shanghai, China). Una parte alícuota de 80 g de proteína desnaturalizada de cada muestra se aplicó a una electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 2 h a temperatura ambiente, seguido de incubación con el anticuerpo primario (dilución 1:2000, Abcam, EE.UU.) a 4 ° C durante la noche y anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (dilución 1:1000, Abcam , EE.UU.) durante 1 h a temperatura ambiente. Las transferencias se incubaron después con un aumento de quimioluminiscencia durante 2 min. Las señales fueron detectados y cuantificados por densitometría usando software Quantity One. β-actina se utilizó como control endógeno de los datos de expresión normalizados
objetivo de predicción SIRT1 y la actividad luciferasa ensayo
miARN objetivos se prevé utilizar la base de datos Miranda (http:. //www.microrna. org /). Para el ensayo de la actividad de luciferasa, los nucleótidos 2341 a 2731 (la completa predijo miR-221 y miR-222 sitio de destino de la SIRT1-3'UTR) se insertaron corriente abajo del gen de la luciferasa de Renilla en a /Renilla plásmido reportero de luciferasa de luciérnaga, psiCHECK- 2 (GenePharma, Shanghai, china). PC-3 células fueron transfectadas con 0,5 g de plásmidos informadores por pocillo además de miR-221 o miR-222 plásmido inhibidor. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, Renilla /luciérnaga actividad luciferasa se midió mediante un ensayo reportero luciferasa dual (Promega, EE.UU.) en un lector de microplacas automático (Thermo, EE.UU.).
El análisis estadístico
Todo los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS versión 17.0 (Chicago, Illinois, EE.UU.). Los datos se expresaron como el valor medio ± SEM. La significación estadística se determinó mediante un análisis de varianza o la prueba t de Student de dos colas. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces.
Resultados
La expresión de miR-221 y miR-222 en células de CaP
miR-221 fue altamente expresado en el PC-3 las células en comparación con LNCap (P & lt; 0,05) (Figura 1A). Del mismo modo, miR-222 también se incrementó notablemente en células PC-3 en comparación con LNCap (P & lt; 0,01) (Figura 1B). La transfección con el inhibidor de miR-221 suprime de forma espectacular la expresión de miR-221 en células PC-3 (P & lt; 0,05) (Figura 1C). Del mismo modo, la expresión de miR-222 se redujo significativamente después de la transfección del inhibidor de miR-222 (P & lt; 0,01). (Figura 1D): perfil
miR-221 niveles (A) en las células LNCaP PC-3 y. (B) de miR-222 niveles en las células LNCaP PC-3 y. (C) miR-221 niveles en las células PC-3 después de la transfección con PEX-5 (plásmido vector vacío) o un inhibidor de miR-221. (D) de miR-222 niveles en las células PC-3 después de la transfección con PEX-5 o el miR-222 inhibidor. Los datos representan el valor medio ± SEM de tres experimentos separados.
* P & lt; 0,05,
** P & lt;. 0,01
Efectos de miR-221 y miR-inhibidor 222 inhibidor sobre la proliferación celular, la distribución del ciclo celular y la apoptosis en PC- 3 células
Como se muestra en la Figura 2, en comparación con las células transfectadas con el vector vacío (pEX-5), células transfectadas con miR-221 inhibidor o inhibidor de miR-222 demostraron una reducción significativamente la proliferación en el quinto, sexto, y séptimo días (P & lt; 0,01 a 0,05).
PC-3 células fueron transfectadas con el vector de plásmido vacío inhibidor (pEX-5), inhibidor de miR-221 o miR-222. La proliferación celular se analizó utilizando un ensayo de CCK-8. La proliferación de las células transfectadas con miR-221 inhibidor o inhibidor de miR-222 se redujo en comparación con la transfectadas con PEX-5. Los datos representan el valor medio ± SEM de tres experimentos separados.
*,#P & lt; 0,05 frente PEX-5,
**, ## P & lt; 0,01 vs PEX-5
Un análisis de citometría de flujo reveló que el 70,2 ± 1,8% de. células transfectadas con pEX-5 estaban en las fases G0 /G1, mientras que 87,1 ± 2,0% y 81,9 ± 0,9% de las células transfectadas con miR-221 inhibidor y miR-222 inhibidor estaban en G0 /G1, respectivamente (P & lt; 0,01) ( Figuras 3 A y B). La transfección con miR-221 inhibidor o inhibidor de miR-222 dio lugar a un porcentaje mucho menor de células en fase S en comparación con las transfectadas con PEX-5 (4,9 ± 1,9% o 9,9 ± 1,1% frente a 21,9 ± 1,7%, P & lt; 0,01 ). No hubo diferencias significativas en las células en G2 /M fases entre los grupos.
(A) de distribución de contenido de ADN de la célula en cada fase. (B) Porcentaje de células distribuidas en cada fase del ciclo celular. **,
## P & lt; 0,01 vs PEX-5
Las tasas de apoptosis de las células PC-3 transfectadas con el miR-221 o el inhibidor de miR-222 inhibidor se incrementaron en 2,8 veces. y 2,6 veces, respectivamente, en comparación con las transfectadas con pEX-5 (P & lt; 0,05). (Figuras 4A y B)
(A) la distribución de células apoptóticas de las células PC-3 transfectadas con pEX-5 MIR -221 inhibidor o miR-222 inhibidor mediante citometría de flujo. (B) tasa de apoptosis relativa de cada grupo. Los datos representan el valor medio ± SEM de tres experimentos separados (
*,#P & lt;. 0,05 vs PEX-5
Efectos de miR-221 inhibidor y el inhibidor de miR-222 en PC-. 3 migración celular
Como se muestra en las Figuras 5A y B, las tasas de cierre del inhibidor de miR-221 y miR-222 grupos de inhibidor fueron más bajos que era la de pEX-5 grupo. Por ejemplo, las tasas de cierre eran 25 ± 1,5% y un 34 ± 2,9% para el miR-221 y los inhibidores de miR-222, respectivamente, frente a 57 ± 7% de pEX-5 (P & lt; 0,01 a 0,05) a las 48 h, y 47 ± 2,7% y 59 ± 9,9 % frente a 100% (P & lt; 0,01).. a las 72 h resultados similares para la inhibición de la migración se observaron utilizando un ensayo transwell Como se muestra en las Figuras 5C y D, la migración celular se redujo significativamente después de la transfección con miR-221 inhibidor o miR-222 inhibidor en comparación con las células transfectadas con pEX-5 (P & lt; 0,01).
(a) de la herida ensayo de curación muestra las tasas de cierre de células transfectadas con pEX-5 (plásmido vector vacío), inhibidor de miR-221, o miR-222 inhibidor. (B) cuantificación de las tasas de cierre de heridas en diferentes puntos temporales. ensayo (C) Transwell muestra que las células penetraron la membrana de inserción. (D) La cuantificación del número de células que penetraron la membrana de inserción. Los datos representan el valor medio ± SEM de tres experimentos separados.
*,#P & lt; 0,05 frente PEX-5,
**, ## P & lt; 0,01 vs PEX-55) guía empresas
La inhibición de miR-221 y miR-222 aumento. expresión de la proteína SIRT1
Western blot demostró que los niveles de proteína SIRT1 de células transfectadas con el miR-221 inhibidor y miR-222 inhibidor fueron marcadamente aumentado en comparación con los de las células transfectadas con pEX-5 (P & lt; 0,05 y P & lt ; 0,01, respectivamente) (figuras 6A y B). Sin embargo, no hubo diferencias significativas en los niveles de mRNA (Fecha en que se muestra en la Figura S2).
(A) Expresión de los niveles de proteína SIRT1 en células PC-3 después de la transfección se determinaron por análisis de transferencia Western. (B) Cuantificación de la expresión de la proteína SIRT1. Los datos representan el valor medio ± SEM de tres experimentos separados.
* P & lt; 0,05 frente PEX-5,
## P. & Lt; 0,01 vs PEX-5
Efectos de SIRT1 sobre la proliferación, la apoptosis y la migración de las células PC-3
expresión SIRT1 se suprimió significativamente en células transfectadas con siSIRT1 en comparación con las transfectadas con pGPU6 como un control (Figura 7A). No hubo diferencias significativas en la proliferación celular entre las células transfectadas con siSIRT1 y pGPU6 (Figura 7B). Sin embargo, las células transfectadas con siSIRT1 resultaron en una reducción de dos veces en la tasa de apoptosis en comparación con la de las células transfectadas con pGPU6 (P & lt; 0,01) (Figuras 8A y B). Curiosamente, la migración de las células transfectadas con siSIRT1 significativamente aumentó en comparación con la de las células transfectadas con pGPU6 (P & lt; 0,05). (Figuras 9A y B)
(A) los niveles de proteína SIRT1 en células PC-3 transfectadas con pGPU6 (plásmido vector vacío) o siSIRT1 (pGPU6-si-SIRT1) por Western blot. proliferación (B) de la célula se cuantificó usando un ensayo de CCK-8. No hubo diferencias significativas entre los dos grupos (P & gt; 0,05). Los datos representan el valor medio ± SEM de tres experimentos independientes.
(A) La apoptosis se midió por citometría de flujo de células INPC-3 transfectadas con pGPU6 o pGPU6-siSIRT1. (B) tasa de apoptosis relativa de cada grupo. Los datos representan el valor medio ± SEM de tres experimentos separados.
** P & lt;. 0,01 vs pGPU6
(A) Un transwell ensayo se utilizó para medir la migración de células transfectadas con pGPU6 o pGPU6-siSIRT1. (B) Número de células penetrado la membrana de inserción. Los datos representan el valor medio ± SEM de tres experimentos separados.
* P & lt;. 0,05 vs pGPU6
Sirt1 no es un objetivo directo de miR-221 y miR-222
Como muestran los datos Miranda, miR-221 y miR -222 unido a una de las secuencias diana ubicadas en el 3'-UTR de SIRT1 mRNA (Figura 10A). Para determinar la interacción directa entre el miR-221 o miR-222 y SIRT1 ARNm-UTR 3 ', se llevó a cabo el ensayo de actividad de luciferasa. Sin embargo, las actividades de luciferasa no revelaron diferencias estadísticamente significativas en el miR-221 o miR-222 de nivel en células PC-3 co-transfectadas con SIRT1-3'UTR vinculante secuencia de plásmido indicador en comparación con el control (Figura 10B). En otras palabras, el miR-221 y miR-222 no se unen a la secuencia de SIRT1 directamente y no ejercen una interacción biológica directa.
(A) Los sitios de unión complementarias de miR-221 y miR-222 en SIRT1-3'UTR predicho por la base de datos Miranda. (B) La actividad de luciferasa se llevó a cabo para verificar la interacción de unión y de miR-221 y miR-222 con SIRT1. No hubo diferencias en la actividad de luciferasa entre los grupos (P & gt; 0,05). Los datos representan el valor medio ± SEM de tres experimentos independientes.
Discusión
Varios estudios han demostrado que el miR-221 y miR-222 son regulados hasta en varios tipos de cáncer y son por lo tanto meditadas oncogenes [9], [13], [29]. De hecho, los estudios han encontrado que miRNAs afectan una serie de procesos biológicos a través de unión complementaria a uno o varios genes diana. Por ejemplo, p27, TRPS1, PTEN, ARHI, TIMP3, HECTD2 y RAB1A eran los genes diana de miR-221 y miR-222 [10], [11] ,. Estos hallazgos sugieren que estos miRNAs son una diana terapéutica. Hemos demostrado que los niveles de miR-221 y miR-222 se incrementaron significativamente en células PC-3 en comparación con el de las células LNCaP, lo cual es consistente con otros resultados [34]. El descenso de regulación de miR-221 o miR-222 inhibe la expresión de la proliferación celular y la migración y el aumento de la apoptosis en las células PC-3. Por otra parte, la transfección eficaz de miR-221 inhibidor o inhibidor de miR-222 dio lugar a un mayor porcentaje de células en las fases G0 /G1 y un menor porcentaje de células en fase S. Estos resultados indican que la inhibición de miR-221 o miR-222 expresión ejerce importantes efectos biológicos sobre la proliferación celular, apoptosis, migración celular, la distribución del ciclo celular, y la transición de células en las células PC-3. La expresión de SIRT1 se incrementó en las células PC-3 después de miR-221 y miR-222 se redujeron reguladas. Este hallazgo sugiere que SIRT1 juega un papel supresor contra la acción promotora de tumores de miR-221 y miR-222. SIRT1 se ha informado para restringir la proliferación celular LNCaP [35]. Wang et al. expresión SIRT1 reducida demostrado en el tejido CaP en comparación con el tejido en la hiperplasia prostática benigna [27]. SIRT1 puede servir como un promotor de tumores o supresor de tumores, en función de la vía oncogénica específica a determinados tumores [19], [22], [24]. SIRT1 podría actuar como un oncogén mediante la inhibición de genes supresores de tumores, tales como p53 [36], y podría actuar como un anti-oncogén mediante la represión de varios oncogenes o oncoproteínas tales como β-catenina y survivina [37], [38].
en nuestro estudio, derribando SIRT1 en células PC-3 conducido a una mayor migración celular y una tasa de apoptosis disminuida, pero no hubo diferencia significativa se observó en la proliferación celular. Estos hallazgos sugieren que la SIRT1 participa en la supresión de la migración y la promoción de la apoptosis en células PC-3, pero tiene poco papel en la regulación de la viabilidad celular. La inhibición de miR-221 y la expresión de una mayor expresión SIRT1 miR-222, lo que sugiere que el aumento de la apoptosis observada y la disminución de la migración después de la transfección con miR-221 o miR-222 inhibidor está regulada por la activación de SIRT1. la capacidad de supresión de la proliferación de estas células después de miR-221 y miR-222 baja regulación puede ser modulada a través de otras vías moleculares, tales como p27 [31] o ARHI [39]. Aunque SIRT1-3'UTR existe en los sitios de unión de miR-221 y miR-222, un ensayo indicador de luciferasa no identificó una relación de vinculación directa entre SIRT1 y miR-221 o miR-222. Esto sugiere que el miR-221 y miR-222 indirectamente restringen la expresión de SIRT1 a través de otras vías moleculares. Se necesitan más estudios para ilustrar los mecanismos y vías moleculares de miR-221, miR-222, y SIRT1 que están involucrados en la patogénesis del CP mediante la sobreexpresión de los dos microARN y la modulación de la expresión de SIRT1 en diferentes líneas celulares. La investigación de las funciones biológicas de MIR-221/222 y SIRT1 y su relación en vivo utilizando un modelo animal también debe ser considerado.
En resumen, el miR-221 y miR-222 son altamente expresado en células PC-3 . La inhibición de miR-221 o miR-222 expresión se reduce la proliferación y migración celular y aumenta la apoptosis en células de CaP. proteína SIRT1 es hasta reguladas en las células después de la transfección de miR-221 o miR-222 inhibidor. Las células transfectadas con siSIRT1 muestran un aumento de la migración y una tasa de apoptosis disminuyó, pero ningún efecto sobre la proliferación celular. Estos datos indican que los efectos biológicos de miR-221 y miR-222 en las células de cáncer de próstata se asocian con SIRT1. La modulación de la expresión de estas moléculas podría afectar a la tumorigénesis del cáncer de próstata. Estos hallazgos pueden proporcionar un enfoque terapéutico potencial para el cáncer de próstata.
Información de Apoyo
figura S1. Autenticación de las células transfectadas con el miR-221 o miR-222 inhibidor de Western blot. 1-8: clones numerados. El éxito de los clones indicados por las flechas se agruparon para verificar los experimentos biológicos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0098833.s001 gratis (TIF)
figura S2. La expresión de SIRT1 mRNA. PCR en tiempo real se llevó a cabo para medir los cambios SIRT1 mRNA en células PC-3 transfectadas con PEX-5, el miR-221 inhibidor o inhibidor de miR-222. No hubo diferencia estadística entre los grupos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0098833.s002 gratis (TIF)