Extracto
La hipoxia ha sido desde hace mucho tiempo reconocido como importante microambiente del cáncer de promoción. En tal condición restrictiva energía, post-transcripcional mecanismos ganan importancia sobre la maquinaria de transcripción de genes costosa energía. Aquí nos muestran que la aparición de características de células madre de cáncer inducido por hipoxia requiere la beta-catenina que dependen de post-transcripcional regulación de la expresión génica y CA9 SNAI2. En respuesta a la hipoxia, la beta-catenina se mueve desde la membrana plasmática al citoplasma donde se une y estabiliza SNAI2 y CA9 mRNAs, en cooperación con la proteína estabilizante mRNA Hur. También proporcionamos evidencia de que la actividad post-transcripcional de beta-catenina citoplasmática opera bajo la normoxia en células de cáncer de mama triple negativo /basal, al igual, donde la caída de beta-catenina suprime el fenotipo de células madre
in vitro y
el crecimiento del tumor
in vivo
. En tales células, se desentrañar la implicación generalizada de la maquinaria beta-catenina-impulsado en la estabilización de los ARNm de EGF inducida, incluyendo el regulador de cáncer de células madre IL6. Nuestro estudio pone de relieve el papel crucial de los mecanismos post-transcripcional en el mantenimiento /adquisición de características de células madre del cáncer y sugiere que el impedimento de la función beta-catenina citoplasmática puede representar una estrategia sin precedentes para la orientación madre del cáncer de mama /células de tipo basal.
Visto: D'Uva G, Bertoni S, M Lauriola, de Carolis S, Pacilli A, D'Anello L, et al. (2013) beta-catenina /Hur post-transcripcional Maquinaria cáncer gobierna Tallo Características de células en respuesta a la hipoxia. PLoS ONE 8 (11): e80742. doi: 10.1371 /journal.pone.0080742
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Julio, 2013; Aceptado: 7 Octubre de 2013; Publicado: 15 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 D'Uva et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo ha recibido el apoyo de: Ministerio italiano de Educación, Universidades e Investigación Científica de subvención PRIN 2008KTRN38 "clínica, implicaciones diagnósticas y terapéuticas de los estudios sobre células madre de cáncer de mama" a MT y MB; Caja de Ahorros en Fundación de Bolonia "Ruolo della Regolazione della Síntesis proteica nelle cellule staminali del cancro" (n. 135 /2.010 a 0.102) para LM y MB. los fondos de las ORP ex 60%, Cornelia y la Fundación Roberto Pallotti (n. 2011-110.512) a MB. Los autores agradecen a la Fundación Caja de Ahorros de Bolonia y la Fondazione Banca del Monte e Rávena para soportar el Centro de Investigación Biomédica Aplicada. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células madre se albergaron en nichos especializados en baja tensión de oxígeno (hipoxia) contribuye a la regulación de la auto-renovación y diferenciación [1-3]. De hecho, la hipoxia mantiene el estado indiferenciado de embrionario, hematopoyético, mesenquimal y las células madre /progenitoras neuronales [2]. La hipoxia en los tumores se asocia con un mal pronóstico [4]. Las células en regiones tumorales hipóxicas estabilizan inducibles por hipoxia-factores (HIF) y activan la expresión de genes de adaptación que conduce a la agresividad del cáncer a través de la supervivencia celular y la desdiferenciación [1,5]. Por otra parte, la actividad de HIF en un raro subconjunto de las células tumorales hipóxicas confiere madre propiedades de células [1-3].
El beta-catenina es un regulador crucial de la célula normal y madre de cáncer de auto-renovación [6,7 ]. En respuesta a diversos estímulos, beta-catenina induce la expresión de genes diana por shuttling en el núcleo, donde interactúa con factores TCF /LEF de transcripción de la familia [6].
La interacción física entre HIF-1 alfa, el actor principal en respuesta a la hipoxia, y beta-catenina se ha descrito [8]. Por otra parte, la beta-catenina y HIF-1 alfa facilitan la supervivencia de forma sinérgica la hipoxia en las células de cáncer de colon y la auto-renovación de las células madre neurales [8,9].
La hipoxia es una condición restrictiva de energía, lo que disminuye notablemente total de
novo
transcripción y promueve la regulación post-transcripcional de ahorro de energía de los ARNm preexistentes [10-12]. Estudios recientes indican que la beta-catenina modula la vida media de los ARNm citoplásmicos [13-17]. Estos datos llevan a nosotros suponemos que la actividad post-transcripcional de beta-catenina desempeña un papel importante en la adaptación de las células cancerosas a la hipoxia. Aquí hemos analizado el papel de la beta-catenina en la producción y la estabilización de dos genes reguladores de células madre de cáncer de mama importantes, es decir, la anhidrasa carbónica 9 (CA9) y SNAI2 mRNAs. La expresión de genes CA9 y SNAI2 es inducida por la hipoxia, a través de HIF1-alfa-mediada por la transcripción de la regulación [18-20]. expresión CA9 regula el pH en el microambiente hipóxico para promover la supervivencia y proliferación de células madre de cáncer [21,22]. Por lo tanto CA9 se ha sugerido como un objetivo de la terapia contra el cáncer [23,24]. SNAI2, también conocido como SLUG, es un supresor funcional importante del compromiso humano progenitor de mama linaje celular y la diferenciación, promoviendo normal y tumor de la glándula mamaria de vástago /estado células progenitoras [25,26].
Estamos aquí informe que la acumulación citoplasmática de la beta-catenina en respuesta a la hipoxia activa un programa de des-diferenciación y la supervivencia post-transcripcional, lo que mejora las características de células en células de cáncer de mama madre. El fenómeno se basa en la capacidad de citoplásmico beta-catenina para unirse y estabilizar SNAI2 y CA9 mRNAs. También proporcionamos evidencia de que la actividad post-transcripcional de beta-catenina citoplasmática opera bajo la normoxia en células de cáncer de mama triple negativo /basal, al igual. El cáncer de mama /triple negativo de tipo basal es un subtipo de cáncer de mama poco diferenciado y agresivo, que se caracteriza por la expresión de un gen perfil de células madre similares [27,28], por la localización citoplasmática de la beta-catenina [29-31 ] y por CA9 y SNAI2 gen sobreexpresión [32,33]. En tales células, desmontables beta-catenina disminuye drásticamente la estabilidad y la expresión de los ARNm CA9 y SNAI2 y embota el fenotipo de células madre
in vitro
y el xenoinjerto-establecer la capacidad de
in vivo
. Por otra parte, beta-catenina beta-catenina fue capaz de regular la estabilidad del mRNA de varios mRNAs inducida por EGF, entre los que la citoquina pro-inflamatoria interleuquina 6 (IL6), un factor de crecimiento reconocido madre de cáncer [21,34]. Los datos aquí reportados destacan el papel de los mecanismos post-transcripcional en la regulación de las características de células madre de cáncer, e identificar la beta-catenina como un jugador de post-transcripcional fundamental en el fenotipo de las células madre del cáncer de mama. Proponemos que el impedimento de la actividad post-transcripcional de beta-catenina aquí descrito representa una estrategia aún no explorado para dirigir las células madre del cáncer de mama de tipo basal /.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares, productos químicos y exposición a la hipoxia
Se utilizaron células MCF7 como un modelo de carcinoma bien diferenciado luminal de mama y MDA-MB-468 y las células MDA-MB-231 como un modelo de carcinoma de mama de tipo basal pobremente diferenciado [35 ]. Todas las líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). MCF7, MDA-MB-468 y MDA-MB-231 se cultivaron en medio RPMI-1640, DMEM /F12 y DMEM respectivamente. Todos los medios se complementaron con 10% de FBS, 1% de penicilina y estreptomicina y 1% de glutamina Euroclone (Milan-Italia). Todos los cultivos de células de normoxia se mantuvieron a 37 ° C en un 5% CO
2-atmósfera humidificada. Hipoxia (1% de pedido
2, 5% pCO
2, el 94% PN
2) se obtuvo en un
in vivo
armario 300 hipoxia (Ruskinn Tecnología, Bridgend, Reino Unido) durante 48 marido. La muerte celular se evaluó mediante tinción con azul tripán.
Generación de SM de tejidos de cáncer de mama primarios y líneas celulares
MS de los tejidos de las glándulas mamarias humanas se obtuvieron como se describe anteriormente [21]. Brevemente, las muestras de tejido se colocaron en medios Epicult estéril (StemCell Technologies, Vancouver, Canadá), picada con escalpelos estériles, y se incubaron durante 6-12 horas en presencia de 1000 U de mezcla de enzimas de colagenasa /hialuronidasa (StemCell Technologies) y se filtraron a través de una 40 de malla de nylon micras (Becton Dickinson), volvió a suspenderse en completa MEGM y se sembró en 1cm
2 placas de fijación bajas. generación MS secundaria se obtuvo mediante la incubación de MS primaria o consecutivo en 1 × solución de tripsina-EDTA (Cambrex) durante 3 minutos, la filtración a través de un nylon 40-m de malla y de una sola célula re-suspensión en MEGM completa. MS fueron anotados en el día 7. Se obtuvo la autorización del comité ético-S.Orsola Malpighi Hospital de la Universidad de Bolonia (Prot. N. 75/2011 de LM y MB y MT). escrito el consentimiento informado se obtuvo de los pacientes cuyos tejidos se utilizaron en el estudio. MCF7-MS fueron generados por la siembra de 5.000 células MCF7 en baja de fijación 24 bien y anotó en el día 5.
células
estable en forma beta-catenina y la caída en SNAI2 MCF7, MDA-MB-468 y MDA-MB-231
Stable caída beta-catenina en MCF7, MDA-MB-468 y las células MDA-MB-231 se consiguió mediante la transducción del vector retroviral pCtoGMB-GFP que transporta beta-catenina humana 19nt específica secuencia de codificación (GAGCCTCTATACCACCCAC) por una PCR estrategia de clonación con base, como se describe previamente para shSNAI2 vector [20]. shBeta y células infectadas por shSNAI2 fueron seleccionados por GFP clasificación cytofluorimetric, como se describe anteriormente [20].
inmunofluorescencia y microscopía confocal análisis
Las células cultivadas se sembraron sobre cubreobjetos de vidrio a 60% de confluencia, mientras que la EM se cultivaron en BD Matrigel reducido
TM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) . Las células fueron fijadas con paraformaldehído al 2% y se permeabilizaron con 0,2% Triton X-100. Las células fueron incubadas con anticuerpos anti-beta-catenina anticuerpo primario (clon E5, Santa Cruz Biotecnología, Santa Cruz, CA) y el anticuerpo secundario conjugado anti-ratón FITC (Dako Cytomation, Glostrup, DK). Los núcleos fueron contra el teñidas con yoduro de propidio y se monta en el Pro-montaje largo medio reactivo anti-fade (Molecular Probes Inc, Eugene, Oregon, EE.UU.). Las imágenes fueron capturadas utilizando un Zeiss LSM 710 en un Observador Z1 Zeiss o un microscopio Leica DMI 6000B invertido (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania).
La transfección transitoria de siARN y vectores de expresión
CA9-, canes, y siRNAs y (TM tecnología de sigilo
) siRNA control no específica (siSCR) oligonucleótidos con una SNAI2-específica GC contenido emparejado se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.). Los plásmidos que codifican tipo salvaje beta-catenina (Beta-WT; pCI-neo), dominante negativo pcDNA4-TCF4DN (TCF4DN), y PTER + shBeta-catenina (shBeta) vector de codificación se obtuvieron del Dr. Marc Van de Wetering (Hubrecht Instituto, Utrecht, Países Bajos) y Bert Vogelstein (Universidad Johns Hopkins, MD, EE.UU.). Plásmido que codifica HIF1-alfa se obtuvo de Eric Huang (Departamento de Neurocirugía de la Universidad de Utah, Salt Lake City, Utah). EGFR de tipo salvaje vector de codificación se obtuvo de Pier Paolo di Fiore (Instituto Europeo de Oncología, Milán, Italia); siRNAs o plásmidos se transfectaron a las células MCF7 (10
5 células en un 3 cm
2 pocillo) a una concentración de 1 g /pocillo durante 72 h o 24 h, respectivamente, utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Gran Island, NY ), o Jet-Pei (Polyplus, Illkirch, Francia) en el caso de la EM. células MCF7 de forma estable transducidas con un vector retroviral que codifica una p53 dominante de inactivación mini-proteína (p53D) se describe anteriormente [36].
promotor del gen y los ensayos de reportero de luciferasa mRNA 3'UTR
La anhidrasa carbónica -9 plásmido de luciferasa (CA9-Luc, que abarca la región de -170 a 34 de promotor CA9), fue proporcionado amablemente por el Dott. Jaromir Pastorek; HIF1alpha responder plásmido de luciferasa, HRE-Luc, fue proporcionado amablemente por el Dr. Giovanni Melillo (laboratorio del tumor hipoxia, Instituto Nacional del Cáncer, Frederick, MD, EE.UU.). SNAI2-Luc plásmido fue proporcionado amablemente por el Dr. Togo Ikuta (Centro de Cáncer de Saitama, Saitama, Japón); TopFlash, fue un regalo del Dr. Rolf Kemler (Instituto Max Planck, Heidelberg, Alemania); Elemento de Respuesta de los estrógenos (ERE-Luc) reportero fue proporcionado por Rakesh Kumar (Departamento de Oncología Molecular y Celular, MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas); La timidina quinasa Renilla indicador de luciferasa del plásmido (Promega, Madison, WI) se utilizó como control en el ensayo de luciferasa después de 24 horas usando el sistema de doble Luciferase® reportero de ensayo (Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se expresan como cambios de plegado de luciérnaga más de la actividad de luciferasa de Renilla. CA9 y SNAI2 3'UTR construcciones de ensayo de la luciferasa se obtuvieron de Genecopoeia (Rockwell, Maryland, EE.UU.). Cada línea celular se transfectó con 3'UTR-CA9 /SNAI2 vector o con el control pEZX-MT01 vector vacío. Los datos se presentan como relación de 3'UTR-CA9 /SNAI2 más de vector de control, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
extracción de RNA y cDNA de amplificación
ARN total fue extraído a partir de células utilizando el reactivo TRIzol® según con el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los cebadores y las condiciones de PCR se presentan en la Tabla S1.
análisis de PCR en tiempo real
análisis de PCR en tiempo real se realizó mediante el método TaqMan en aiCycler iQ ™ Real-Time PCR DetectionSystem (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, EE.UU.). Cada muestra se analizó por triplicado. Los conjuntos de cebadores y sondas fluorogénicos específicos para CA9, SNAI2, ESR1, IL6 y CD44 mRNAs se compraron de Applied Biosystems. Las reacciones se incubaron a 50 ° durante 2 min; 95 ° C durante 15 min seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. La cantidad relativa de ARNm diana se calculó igual a 2
- (Δ
C
t objetivo mRNA- Δ
C
t control), utilizando ARNm de beta-glucuronidasa humana como control, excepto para el ensayo de ARNm inmunoprecipitación, ensayo de estabilidad del ARNm, y el ensayo de fraccionamiento citoplasmática.
Alto rendimiento de gene Expresión de medida con PCR en tiempo real en una matriz de microfluidos dinámico (Fluidigm® real-Time PCR)
ARN se aisló utilizando el kit de la célula cultivada PerfectPure ARN con DNasa-1 digestión (5 Prime, Hamburgo, Alemania). Se sintetizó ADNc utilizando el kit de síntesis de primera cadena SuperScriptII (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para qPCR de pre-ARNm y ARNm, respectivamente, cebadores directos fueron colocados en el segundo intrón y exón, y un cebador inverso común (aquí llamado universal) se posicionó en el tercer exón constitutiva. Para los genes en los que las secuencias de los cebadores universales no estaban disponibles, 2 parejas de cebadores fueron diseñados para amplificar secuencias intrónicas, respectivamente, y exonic. Cada muestra de ADNc se mezcla con el grupo de cebadores para una reacción de pre-amplificación de 14 ciclos con el Reactivo (Fluidigm PN 85000735) y TaqMan PreAmp Master Mix, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cDNA Preamplificado se diluyó 1: 100. La mezcla maestra TaqMan universal de 2x modificada se añadió al ADNc diluida con el fin de obtener una concentración final de 1x Master Mix en las muestras. El chip se cebó en el controlador NanoFlexTM 4-CFI antes de cargar las muestras y los reactivos de ensayo en las entradas. Los datos se analizaron mediante el uso de los valores de Ct y valores ΔΔCt. Cada muestra fue por triplicado y normalizada ya sea en GAPDH, B2M y TBP. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla S2.
Western Blot y co-inmunoprecipitación ensayo
Las proteínas totales se extrajeron con tampón RIPA (25 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 145 mM, 1% NP -40, SDS 0,1%, Na-deoxicolato 0,5%) añadido con inhibidor de la proteasa Cocktail (Roche, Basilea, Suiza). El análisis de transferencia Western se realizó utilizando los siguientes anticuerpos: laminina, Beta-tubulina, anti-beta-catenina (E5), anti-actina (C4) adquiridos a Santa Cruz Biotechnology, (Santa Cruz, CA); anti-Hur (Molecular Probes, Invitrogen) adquiridos de Molecular Probes; anti-CA9 (AF2188) comprado de amplificador de I + D; D (Minneapolis, MN) y el clon M75 proporcionado amablemente por el Prof. J. Pastorek (Academia Eslovaca de Ciencias (Bratislava, República Checa) ensayo de co-inmunoprecipitación se realizó en tampón CO-IP (. 50 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 1% de NP40) añadido con inhibidores de la proteasa (Roche).
ensayo de inmunoprecipitación mRNA
ensayo de mRNA inmunoprecipitación se realizó siguiendo el protocolo estándar que preserva interacción ARNm /proteína usando el tampón de polisomas de lisis [37]. en las células breves, cultivadas se suspendieron en tampón de lisis (100 mM KCl, 5 mM MgCl
2, 10 mM de Hepes, pH 7,0, 0,5% Nonidet P-40), complementado con RNasa e inhibidores de la proteasa. Las proteínas se inmunoprecipitaron usando perlas de proteína A (Santa Cruz) y, o bien anti-beta-catenina (E5, Santa Cruz) o anti-Hur (Molecular Probes) o IgG normal (sc-2025, Santa Cruz) mouse anticuerpos, en tampón de NT-2 (50 mM de Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgCl
2, 0,05% de Nonidet P-40), suplementado con inhibidor de la ARNasa (40 U /ul), DTT (1 mM). Los inmunoprecipitados fueron lisadas en el reactivo Trizol® (Life Technologies). Los ADNc se analizaron por RT-PCR (células MCF7, MDA-MB-468 y las células 231 MDA-MB-) o mediante PCR en tiempo real (T-MS). Los datos se presentan como aumento de pliegue de cada ARNm unido al anticuerpo específico sobre la IgG control [37].
actinomicina D mRNA estabilidad ensayo
ensayo de estabilidad para mRNA se llevó a cabo mediante la exposición de células a la actinomicina D a 100 ng /ml y evaluar el nivel de cada ARNm específico en diferentes puntos de tiempo (0-6 h) : nivel de ARNm en la primera hora después de la exposición actinomicina se tomó como punto de referencia (tiempo 0)
citoplasmática pre-ribosoma 40S y procedimiento de fraccionamiento ribosoma
Para aislamientos de fracciones ribosomales dos placas de 10 cm. de 80% se lisaron células confluentes en tampón de lisis (NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, Tris-HCl 20 pH 7,5). citoplasma sin Orgánulos se obtuvo por el ahorro de los sobrenadantes después de centrifugación a 14.000 xg durante 5 min a 4 ° C. fracciones ribosomales A continuación se separaron por centrifugación de lisado citoplásmico a 100.000 g (36.000 rpm) en un rotor SW41Ti (Beckman) en un gradiente de sacarosa 15 a 50% añadido con inhibidor de RNasa y cicloheximida. Las fracciones correspondientes a la subunidad 40S del ribosoma o de baja densidad citoplasma pre-ribosomal RNA se utilizaron para la extracción de proteínas y (material S1A-B). La extracción de RNA fue realizada por TRI-reactivo (Ambion). Las proteínas se extrajeron con TCA a 4 ° C, se secó a 95 ° C, y se resuspendieron en tampón 1X Laemli. mRNA fueron evaluados por PCR en tiempo real. Los datos se presentan como aumento de pliegue de cada ARNm en desmontables células beta-catenina sobre los controles.
análisis citofluorimétrico
Las células se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se recogieron con disociación celular 1x solución no enzimáticos (Sigma). Independiente células se lavaron con PBS que contiene 5% de FCS y azida de sodio al 0,1% (tampón de lavado) y se resuspendieron a una concentración de 0,5 * 10
6 células /100 pl de tampón de lavado. Las combinaciones de anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo obtenidos de BD Bioscience Pharmigen (San Diego, CA, EE.UU.), contra CD44 humano (G44-26, APC;. Cat#560890) y CD24 (PE-Cy7;. Cat#561646) o sus respectivos controles de isotipo se añadieron a la suspensión celular a concentraciones recomendadas por el fabricante y se incubaron a 4 ° C en la oscuridad durante 30 min. Las células marcadas se lavaron en el tampón de lavado y luego se analizaron en un citómetro de flujo LSR II (BD Biosciences).
Foci-ensayo de formación de
Para probar la capacidad de las líneas celulares seleccionadas para formar focos , las células se sembraron en seis pocillos de placas, mantenida a confluencia, reemplazando el medio cada 3-4 días. Los focos se anotó a los 14 días
ª.
ensayo y el tejido de xenoinjerto inmunohistoquímica
2 * 10
6 MDA-M6B-468 células se inyectaron en la almohadilla adiposa mamaria de ratones desnudos femeninos. El crecimiento tumoral se controló semanalmente y luego se retira después de 10 semanas (Instituto Weizmann Cuidado de Animales y el empleo Comisión aprobó la experimentación animal, CICUAL n. 01990412-2). 1 * 10
6 MDA-MB-231 células se inyectaron por vía subcutánea en el flanco de ratones desnudos. El crecimiento tumoral se controló semanalmente y luego se retira después de 4 semanas. (Comité de Ética Animal de la Universidad de Bolonia aprobó el experimento con animales, Prot. N. 8134-X /10). Fijado en formol e parafina embebido tejidos /fueron teñidas con hematoxilina-eosina, y fue evaluado por immunonistochemistry, con los siguientes anticuerpos: anti-ESR1 (clon ID5, Dako, Glostrub, Dinamarca); anti-CDH1 (clon NCH38, Dako Cytomation), anti-SNAI2 (L40C6, Señalización Celular, Beverly, MA), anti-CA9 (clon M-75, proporcionado amablemente por J. Pastorek, Academia de Ciencias de Eslovaquia, Bratislava).
Estadísticas y bioinformática
bioinformática análisis de la UA-Rich mRNA se realizó consulta a la base de datos en línea que contiene el elemento-AREsite [38] (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi -bin /AREsite.cgi). El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS. Los datos se presentan como media +/- S.D. .; los valores de p se hace referencia al
t
prueba se exponen, a menos que se especifique lo contrario (n = 3).
Resultados
La hipoxia provoca cáncer de mama desdiferenciación celular y la supervivencia /proliferación mediante la activación de CA9 y SNAI2 expresión
in vitro
, madre del cáncer de mama /progenitoras características están sobre-representados en mammospheres (MS) [39]. Nuestra investigación fue motivada por la observación de que la exposición o la exposición previa a la hipoxia (1% de pedido
2) aumentó la capacidad de formación de MS de las células MCF7 (Figura 1A), y de carcinoma ductal de mama tejidos derivados de células (T-EM , la Figura 1B). a continuación, se observó que en las células MCF7, así como en T-MS, la hipoxia aumenta la expresión de mRNA de dos genes reguladores de células madre de cáncer de mama cruciales, a saber, la anhidrasa carbónica 9 (CA9) y SNAI2 (Figura 1C), a través de
de novo
producción de ARNm (Figura S1 A). Es importante destacar que, SNAI2 shRNA desmontables reduce normoxia MS capacidad de formación, así como la hipoxia embotado expansión MS (Figura 1D). Consistentemente, siRNA mediada desmontables SNAI2 hipóxico manipulado formación t-MS (Figura S1B). Por otra parte, mediada por shRNA desmontables SNAI2 detuvo la hipoxia inducida por la baja regulación de los marcadores de diferenciación del epitelio estrógeno receptor alfa (ESR1), queratina 18 (KRT18) y e-cadherina (CDH1) (Figura 1 y la Figura S1C) y la hipoxia inducida sobre regulación de la expresión de CD44 (Figura 1F), un marcador de células madre /progenitoras de cáncer de mama [21,40]. Finalmente, en línea con el favor de la supervivencia /función proliferativa de CA9 [21,22], siRNA mediada por silenciamiento CA9 aumentó la muerte celular y obstaculizado la formación de MS en las células hipóxicas MCF7 (Figura 1G). Estos datos muestran que la hipoxia induce un programa de-diferenciación SNAI2-dependiente y un programa de supervivencia /proliferación CA9 dependiente, lo que lleva a un aumento de las células madre /progenitoras sub-población (Figura 1H).
A, mammosphere (MS) ensayo de formación en las células MCF7 en respuesta a la exposición a la hipoxia (1% pO
2) o después de la pre-exposición de las células adherentes a 1% pO
2 (pre-1% pO
2) ; MS capacidad de formación de las células MCF7 en normoxia (NOR) se informa como valor basal; B, MS ensayo de formación de tumor (T-MS) en Nor /1% de las células pO
2 ductal carcinoma de mama tejidos que derivan, n = 5; representativos incluyen imágenes; C, CA9 y ARNm SNAI2 en Nor /1% de pedido
2 células MCF7 y T-MS; D, ensayo de formación de MS Ctrl /SNAI2 específicos shRNA vector retroviral (shSNAI2) transfectadas las células MCF7 expuestos al Nor /1% de pedido
2; E, análisis de PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de ESR1 y KRT18 en las células Ctrl /shSNAI2 MCF7 expuestos al Nor /1% de pedido
2; M, análisis de PCR en tiempo real de los niveles de ARNm de CD44 en las células Ctrl /shSNAI2 MCF7 expuestos al Nor /1% de pedido
2; G ensayo, la muerte de la célula y MS en scramble (Ctrl) y CA9 siRNA (siCA9) transfectadas las células MCF7 expuestos al Nor /1% de pedido
2; H, la representación esquemática de la función de la CA9 y SNAI2 en la regulación de las características de células madre de cáncer en respuesta a la microambiente hipóxico. Los datos se presentan como media +/- S.D. .; valores de p se refiere a la prueba t. n = 3, a menos que se especifique lo contrario.
Beta-catenina aumenta el fenotipo de células madre del cáncer de mama en respuesta a la hipoxia con independencia de su actividad transcripcional nuclear
A continuación se investigó el papel de la beta catenina en la regulación de la CA9 y el cáncer de mama fenotipo de células madre SNAI2-dependiente. células MCF7 que llevan beta-catenina específica vector retroviral shRNA (shBeta) muestran una reducción dramática de la expresión de la proteína SNAI2 y CA9 (Figura 2A), junto con la reducción de la formación de normoxia MS y deficientes hipóxico expansión MS (Figura 2B). Las células madre /progenitoras de cáncer de mama también son sobre-representados en el CD44
alta /CD24
bajo subpoblación [40]. En consonancia con los datos sobre las células MS, MCF7-shBeta dadas a conocer proporción de CD44
alta /CD24
baja células en normoxia reducirse y, así, y romos CD44
expansión de la población de alto /CD24
bajo condiciones de hipoxia (Figura 2C ). En las células MCF7-shBeta hipoxia expuesto a largo plazo, también se observó disminución de la capacidad para formar focos (Figura S2A). Por otra parte shRNA mediada por beta-catenina caída redujo notablemente suave capacidad de formación de colonias en agar (Figura S3 A), siendo este último un estricto
in vitro
ensayo para detectar células transformación maligna. Estos datos nos llevan a pensar que la precipitación beta-catenina dificulta madre /progenitoras de células auto-renovación. Curiosamente, desmontables beta-catenina también impidió la hipoxia inducida por la baja regulación de ESR1 (Figura 2D), que revela la capacidad de beta-catenina a desempeñar un papel fundamental en el programa de diferenciación inducida por hipoxia que es paralelo a la ganancia de células madre características en las células del cáncer de mama. a continuación, se observó que la hipoxia provocada deslocalización sustancial de beta-catenina de la membrana celular hasta el citoplasma, este hecho está en paralelo con una reducción en los contactos de célula a célula (Figura 2E). Curiosamente, la hipoxia provocada ni localización nuclear beta-catenina ni beta-catenina /TCF transcripcional actividad en las células MCF7 y en T-MS (Figura 2F, G). Estos datos nos llevaron a concebir que el beta-catenina facilita la expresión CA9 y SNAI2 y el fenotipo de células madre resultante en células de cáncer de mama hipoxia expuesto, independientemente de su actividad transcripcional nuclear.
A, análisis de Western (WB) de beta-catenina, SNAI2 y CA9 niveles de proteína en las células Ctrl /shBeta MCF7 sobre NOR /1% de pedido
2 condiciones; B, MS ensayo de formación de estable en forma beta-catenina silenciados células (shBeta) MCF7 al Nor /1% de pedido
2 condiciones; C, el análisis cytofluorimetric de CD44
altos /CD24
vástago de la población de bajos /progenitoras en las células /shBeta MCF7 ctrl sobre Ni /1% de pedido
2 condiciones; D, análisis de PCR en tiempo real del nivel de ARNm en células ESR1 Ctrl /shBeta MCF7 sobre NOR /1% de pedido
2 condiciones; E, inmunofluorescencia (IF) análisis de la beta-catenina en Nor /1% de las células pO
2 MCF7; F, WB análisis de la beta-catenina en Nor /1% Po (se utilizaron lamina B y beta-tubulina como control de fraccionamiento)
2 células MCF7 fracciones citoplasmáticas y nucleares; G, la beta-catenina /TCF reportero transcripcional (TOPFLASH) de ensayo en células MCF7 y T-MS bajo NOR /1% de pedido
2. Los datos se presentan como media +/- S.D. .; valores de p se refiere a la prueba t. n = 3, a menos que se especifique lo contrario.
La hipoxia induce CA9 y expresión a través de SNAI2 HIF1-alfa dependiente de la transcripción del ARNm y la beta-catenina ARNm depende de estabilización
CA9 y SNAI2 son inducible por hipoxia -factor-1-alfa (HIF-1 alfa) transcripcional objetivos [8,20]. Recientemente, se ha sugerido que el beta-catenina promueve la expresión CA9, actuando como HIF-1 alfa transcripcional co-factor en las células de cáncer de colon [8]. Impulsada por estos datos, hemos tratado de investigar el efecto de beta-catenina en la transcripción HIF-1 alfa-dependientes, así como en CA9 y la actividad del promotor SNAI2. Sorprendentemente, el ensayo de indicador de luciferasa dirigido sensible demostró que el beta-catenina sobre-expresión dificulta HIF1-alfa actividad transcripcional tras la exposición hipoxia o después de HIF1-alfa sobreexpresión transitoria (Figura 3A). Consistentemente, desmontables beta-catenina activa HIF1-alfa actividad transcripcional (Figura 3B). Del mismo modo, beta-catenina suprimió la CA9 inducida por hipoxia y genes promotor SNAI2 actividad (Figura 3C). Estos resultados apuntan a la aparición de la actividad antagónica entre beta-catenina y la transcripción mediada HIF1-alfa en células de cáncer de mama hipoxia expuesto. De acuerdo con estos resultados, la transfección de la isoforma dominante negativa de TCF4 (TCF4-DN), que detiene la beta-catenina actividad transcripcional [6], no fue capaz de disminuir CA9 y expresión SNAI2 mRNA en las células MCF7 hipoxia expuesto (Figura S3B). La evidencia de que la beta-catenina reduce paradójicamente actividad CA9 y SNAI2 promotor, pero aumenta los niveles de expresión de ARNm cognado, nos llevó a investigar la estabilidad del mRNA como una nueva capa de función beta-catenina-dependiente. Para probar esta hipótesis, se utilizó actinomicina D, un inhibidor de la polimerasa 2 (Pol2) que limita total
de novo
la transcripción del mRNA. De acuerdo con nuestra hipótesis, la beta-catenina silenciamiento acortada CA9 estable y SNAI2 mRNA vida media en hipoxia expuesto células MCF7 (Figura 3D). Estos datos sugieren que el programa celular en células de cáncer de mama se basa en la producción HIF1alpha dependiente de CA9 y mRNA SNAI2, seguido de la estabilización dependiente de beta-catenina de estos mRNAs (Figura 3E) la hipoxia inducida por la desdiferenciación /vástago.
A, HIF-1 alfa reportero transcripcional (HRE-Luc) de ensayo en células MCF7 transfectadas con el tipo salvaje beta-catenina (Beta-peso) bajo NOR /1% de pedido
2 condiciones o en combinación con HIF1 alfa (HIF1A) vector de codificación; B, HRE-Luc ensayo en el 1% de pedido
células MCF7 shBeta ctrl /2-expuesta; C, CA9-Luc y SNAI2-Luc ensayo in ctrl /Beta-peso transfectadas y en células /shBeta MCF7 ctrl bajo NOR /1% de pedido
2 condiciones; D, CA9 y ensayo de estabilidad SNAI2 mRNA después de la inhibición de la polimerasa 2 actividad transcripcional de actinomicina D (100 ng /ml) en células Ctrl /shBeta MCF7 expuesto a 1% pO
2; E, la representación esquemática de la interacción HIF1-alfa /beta-catenina en células de cáncer de mama en respuesta a la hipoxia: HIF1-alfa promueve la transcripción y citoplásmico beta-catenina mejora la estabilización de SNAI2 y CA9 mRNAs; el efecto negativo de beta-catenina en la transcripción HIF-1 alfa inducida también se representa. Los datos se presentan como media +/- S.D. .; valores de p se refiere a la prueba t. n = 3, a menos que se especifique lo contrario.
actividad post-transcripcional de beta-catenina constitutivamente activa en células de tipo basal /triple negativo cáncer de mama
Cuando comparamos MCF7 deriva de MS las células adherentes afines para CA9 y expresión SNAI2, se encontraron un mayor CA9 y la actividad del promotor SNAI2 y la expresión de ARNm que se detuvo en shBeta normoxia MS (Figura 4A-B). Aunque el fenómeno fue acompañado por el aumento de la beta-catenina localización citoplasmática (Figura 4C), niveles similares de proteína total beta-catenina y la actividad transcripcional estaban presentes en adherente y MCF7 derivan MS (Figura 4D). Estos datos señalan que la actividad post-transcripcional de beta-catenina podría estar implicado en el mantenimiento de la condición de células madre /progenitoras, incluso en normoxia.