Extracto
Las células madre del cáncer de células madre (CSC) han levantado una gran expectación en la última década y son blancos prometedores para una tratamiento eficaz de tumores sin recaídas y metástasis. Entre los diversos métodos que permiten enriquecer líneas celulares de cáncer en CSC, tumorspheres cultura se ha utilizado predominantemente. En este informe, se intentó generar tumorspheres de varias líneas celulares de cáncer murinos y humanos: B16-F10, HT-29, MCF-7 y MDA-MB-231 células. Tumorspheres se obtuvieron con eficiencias variables de todas las líneas celulares, excepto a partir de células MDA-MB-231. A continuación, se estudiaron varias características CSC en ambos tumorspheres y cultivos adherentes de la B16-F10, HT-29 y células MCF-7. Inesperadamente, tumorspheres la conformación de las células eran menos clonogénico y, en el caso de B16-F10, menos proliferativa de células unidas. Además, no observamos ningún enriquecimiento en la población que expresa marcadores de superficie de CSC en tumorspheres a partir de células (CD133, CD44 y CD24 marcadores) o MCF-7 (CD24 y CD44 marcadores) B16-F10. Por el contrario, tumorspheres cultivo de células HT-29 apareció para enriquecer en células que expresan marcadores de colon CSC,
es decir.
CD133 y CD44 proteínas. Para la línea de células B16-F10, cuando se inyectaron 1 000 células en ratones C57BL /6 singénicos, tumorspheres la conformación de las células muestran un potencial significativamente menor tumorigénico de las células adherentes. Por último, tumorspheres cultivo de células B16-F10 indujo una baja regulación de la vimentina que podría explicar, al menos parcialmente, la tumorigenicidad menor de células tumorspheres la conformación. Todos estos resultados, junto con la literatura, indican que tumorspheres cultura de líneas celulares de cáncer puede inducir un enriquecimiento en CSC pero de una manera dependiente de la línea celular. En conclusión, la amplia caracterización de las propiedades de CSC en tumorspheres derivados de cualquier línea celular de cáncer o tejido de cáncer debe ser realizado con el fin de asegurar que los tumorspheres generados en realidad están enriquecidos en CSC
Visto:. Calvet CY, André FM, Mir LM (2014), el cultivo de líneas celulares del cáncer como Tumorspheres no sistemáticamente resultar en cáncer de enriquecimiento de células madre. PLoS ONE 9 (2): e89644. doi: 10.1371 /journal.pone.0089644
Editor: Anita B. Hjelmeland, Clínica de Cleveland, Estados Unidos de América
Recibido: April 2, 2013; Aceptado: 24 Enero 2014; Publicado: 24 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Calvet et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación fue llevado a cabo en el ámbito de aplicación del Laboratorio Asociado Europeo EBAM. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Agence Nationale de la Recherche (IPSIOAT) y del departamento de Val-de-Marne a través del proyecto TELVAC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las células madre del cáncer (CSC), una subpoblación de células cancerosas, han planteado un gran interés en la comunidad científica de las últimas dos décadas. De hecho, son sospechosos de ser responsables del crecimiento tumoral y la metástasis, resistencia a la terapia y por lo tanto las recaídas [1].
compartir CSC muchas características con las células madre normales tales como la capacidad de diferenciación, la auto-renovación y la relativa inactividad lo que sugiere que que posiblemente podrían producirse por sus homólogos normales a través de una acumulación de mutaciones de transformación, ya sea genética o epigenética [2] - [4]. CSC son células madre que pueden auto-renovación o diferenciarse en linajes heterogéneos que van a formar la masa tumoral. A diferencia del modelo de evolución clonal de la propagación del cáncer, el modelo CSC establece que todas las células cancerosas no son igualmente tumorigénico cuando se inyecta
in vivo
[1], [5]. Hace quince años, el capó y Dick demostraron por primera vez que CD34
+ CD38
- CSC aislado de la leucemia mieloide aguda fueron capaces de recapitular la heterogeneidad del tumor original a través de trasplantes de serie en modelos de xenoinjertos, al contrario de CD34
-CD38
+ células [6]. Desde entonces, se utilizó el modelo CSC para explicar no sólo la propagación de la leucemia, sino también de los cánceres sólidos tales como cáncer de mama, gástrico, de colon, de próstata, de ovario, hígado, páncreas, pulmón, cerebro y de la tiroides carcinomas, melanoma, osteosarcoma y el sarcoma de Ewing [7].
pantalla
CSC una resistencia a la quimioterapia y la radioterapia. Su capacidad para escapar de la citotoxicidad de las terapias contra el cáncer convencionales y para regenerar el tumor al final de los tratamientos es debido a varios mecanismos: la latencia, la expresión de proteínas anti-apoptóticas, bombas de eflujo de drogas, alta capacidad de metabolismo y un bajo nivel de oxígeno reactivo especies [1], [8], [9].
Además, como para las células madre normales, el nicho CSC se ha demostrado que desempeñan un papel activo en el mantenimiento de las propiedades stemness así como en la desdiferenciación de no CSC a través de una transición epitelio-mesenquimal (EMT) [10]. Este fenómeno, conocido por estar involucrado en el proceso de metástasis, también puede explicar el origen de CSC ya que estas células comparten la mayoría de sus propiedades con las células post-EMT, incluyendo alta invasión y capacidad de migración, y el aumento de la expresión de marcadores mesenquimales (
por ejemplo,
vimentina). Por otra parte, las células cancerosas obligados a someterse a EMT poseen un potencial y expresar tumorigénicas aumento de los niveles más altos de marcadores CSC [8], [10] - [12]
pocos métodos están disponibles actualmente para aislar CSC.. El cultivo de células de una manera independiente de anclaje, en un medio libre de suero enriquecido en factores de crecimiento, se utilizó primero para propagar las células epiteliales mamarias humanas en un estado indiferenciado [13]. Ponti y colaboradores demostraron que este método también era eficaz en el mantenimiento de mama CSC en cultivo [14]. En tales condiciones, las células crecieron como clones tridimensionales multicelulares llamados "tumorspheres". Esta técnica ha demostrado su eficacia en el enriquecimiento y el mantenimiento de CSC de varias líneas celulares [15].
En el presente trabajo, hemos tratado de evaluar la capacidad de la técnica tumorspheres cultura para enriquecer varias líneas celulares de cáncer en el CSC. De hecho, es de gran interés práctico para el descubrimiento de fármacos y para la evaluación de la eficacia de los tratamientos para trabajar con líneas celulares de cáncer enriquecidas en CSC, ya que estos son considerados como la que debe dirigirse para tratar tumores en el largo plazo sin recurrencia.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los experimentos con animales se realizaron en estricto cumplimiento de las normas éticas emitidas por el Comité Europeo (Directiva 86/609 /CCE). El Comité de Ética Animal Université Paris-Sud 26, registrada por el Departamento de Investigación de Francia, específicamente aprobado este protocolo (protocolo número de registro#2012_007).
Cultivo celular adherente
murino B16-F10 melanoma, HT-29 adenocarcinoma de colon humano, MCF-7 y MDA-MB-231 líneas celulares de adenocarcinoma de mama humano se cultivaron en DMEM, 5A de McCoy, MEM o medio RPMI 1640, respectivamente. Todos los medios se complementaron con 1% glutamax, 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (PS), todo comprado a Life Technologies (Cergy Pontoise, Francia). solución de insulina (Sigma, St Quentin Fallavier, Francia) a una /ml concentración final 10 mg se utilizó específicamente para MCF-7 de cultivo celular. Las células se propagan a 37 ° C en una atmósfera de humedad 95% que contiene 5% de CO
2 y se pasaron a confluencia (a una dilución 1:08 1:10,, 01:06 o 01:04, respectivamente) usando un TrypLE solución (Life Technologies). Las células estaban libres de micoplasma y rutinariamente comprueban con la una gema Paso kit de detección de Mycoplasma Venor comprado a Biovalley (Marne-la-Vallée, Francia).
Tumorspheres Cultura y
10 000 células viables eran transferida en una ultra-bajo matraz de adhesión T75 (Corning, Avon, Francia) en 10 ml de medio de CSC que consiste en DMEM /F12 medio más glutamax (Life Technologies), 4 mg /ml de heparina (Sigma), 2% de suplemento B27 (vida tecnologías), 20 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF, Peprotech, Neuilly-sur-Seine, Francia), 20 ng /ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-b, Peprotech) y 1% de PS. EGF fresca, FGF-b y la heparina se añadieron al medio cada 3 días. Tumorspheres se dejaron crecer durante 4 días (B16-F10) o 7 días (HT-29 y MCF-7). Para la disociación, tumorspheres se centrifugaron primero durante 5 minutos a 200 g, el sedimento se resuspendió suavemente a continuación en 500 l de Accutase (Life Technologies) antes de ser incubadas durante 5 minutos a 37 ° C. Después de la adición de 2 ml de DMEM /F12, tumorspheres se disociaron mediante pipeteo suave y directamente transferidos de nuevo en condiciones de cultivo tumorspheres como se ha descrito anteriormente.
Eficiencia Tumorsphere formador de Ensayo
ARIAIII clasificador de células (BD Biosciences , EE.UU.) se utilizó para transferir con precisión 1 individual de células viables (
es decir
yoduro de propidio-negativos células) en cada pocillo de un ultra-baja adherencia placa de 96 pocillos (Corning) que contiene 100 l de medio de CSC. EGF fresca, se añadieron FGF-b y heparina cada 3 días. Este experimento se realizó con el fin de evaluar la capacidad de formación de tumorsphere de células procedentes de cultivos adherentes o de tumorspheres primarios o secundarios previamente formados. Después de 10 días de cultivo, el número de pozos que contiene un tumorsphere mayor de 50 micras, se determinó utilizando un microscopio de contraste de fase.
clonogénico Ensayo
Clasificador células ARIAIII se utiliza para transferir con precisión 200 células viables (
es decir
propidio células yoduro-negativa), disociado de tumorspheres de una semana de edad, o de cultivos de monocapas adherentes, en cada pocillo de una normal de la adherencia de 6 pocillos placa que contiene DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% PD. Después de 5 días de cultivo para B16-F10 y 10 días para HT-29 y MCF-7, se descartó medio, las células se lavaron con tampón fosfato salino (PBS) y se fijaron y se tiñeron utilizando una solución acuosa que contiene 20% de etanol, 3,7% formaldehído y 0,2% de cristal violeta. Clonogenicidad se calculó como el número de colonias formadas con respecto al número de colonias formadas a partir de células adherentes.
Ensayo de proliferación de
Clasificador células ARIAIII se utiliza para transferir 1 000 células viables B16-F10 (
es decir
propidio células de yoduro-negativa), disociada de tumorspheres de una semana de edad o de monocapas adherentes, en cada pocillo de una placa que contiene DMEM adhesión de 96 pocillos normales suplementado con 10% de FBS y 1% de PS. La placa se colocó en un sistema de imagen IncuCyte ™ FLR (Essen Biosciences, Welwyn Garden City, Reino Unido) dentro de un incubador de cultivo de células normal (37 ° C, 95% de humedad, 5% de CO
2). Se controlaron cuatro zonas diferentes por pocillo (aumento de 10x, contraste de fase) con el IncuCyte ™ cada 4 horas durante una semana. La proliferación se midió con el software IncuCyte ™ y se determinó el tiempo de duplicación utilizando un modelo de regresión lineal.
Inmunoticción Ensayo
50 000 células B16-F10 viables (ensayo de exclusión de azul de tripano) disociarse de una tumorspheres -Semana de edad o de monocapas adherentes tratadas con tripsina se incubaron durante 30 minutos a 4 ° C en la oscuridad con 0,5 g de rata anti-ratón monoclonal CD133-APC, anticuerpos CD44-FITC o CD24-PE (eBiosciences, París, Francia) en 100 l de una solución tampón que consiste en PBS que contenía 3% de albúmina de suero bovino (Sigma). La inmunotinción se realizó también para HT-29, MCF-7 y líneas de células MDA-MB-231 utilizando monoclonal de ratón anti-humano CD133-APC, CD44-PE, CD44-APC o anticuerpos CD24-FITC (Miltenyi Biotec, Paris, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después, las células se lavaron y se analizaron con un citómetro de flujo Accuri C6 (BD Biosciences, EE.UU.).
Side Población Ensayo
Una suspensión de células individuales de 1,10
6 células B16-F10 /ml en un medio DMEM /F12 libre de suero se preparó usando disociadas tumorspheres de una semana de edad o monocapas adherentes. Esta suspensión de células se incubó con 5 mg /ml de Hoechst 33342 (Sigma) durante 90 minutos a 37 ° C en la oscuridad. Una suspensión de células de control negativo se expone a Hoescht 33342 y 50 mM verapamil (Sigma) se incubó en paralelo. Después, las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en una solución de DMEM /F12 libre de suero que contiene 5 mg /ml de yoduro de propidio (Sigma) para excluir las células muertas. El análisis se realizó utilizando un citómetro de flujo LSR II (BD Biosciences).
se utilizó cuantitativa con transcripción inversa reacción de polimerasa en cadena (RT-qPCR): perfil
TRIzol® reactivo (Life Technologies) para extraer el ARN total a partir de células o tumorspheres adherentes B16-F10 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 1 g de ARN fue transcrito de forma inversa utilizando M-MLV transcriptasa inversa (Life Technologies). La amplificación y detección por SYBR Green se realizó utilizando el Sistema Paso Uno más en tiempo real PCR (Applied Biosystems, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. limpieza de genes 18S se utilizó como estándar interno. Los siguientes cebadores se utilizaron a 10 mM cada uno:
E-cadherina:
adelante 5'-GAGCCTGAGTCCTGCAGTCC-3 ', inversa: 5'-TGTATTGCTGCTTGGCCTCA-3'
vimentina:
adelante 5'-CACCCTGCAGTCATTCAGACA-3 ', inversa: 5'-GATTCCACTTTCCGTTCAAGGT-3'
Snai1:
adelante 5'-GGAAGCCCAACTATAGCGAGC-3 ', inversa : 5'-CAGTTGAAGATCTTCCGCGAC-3 '
18S:
adelante 5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3', inversa: 5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3 '
tumorigenicidad Ensayo
100 l de DMEM /F12 que contenía 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 ó 100 000 células viables (tripano ensayo de exclusión de azul) de disociadas tumorspheres B16-F10 se inyectaron en ambos flancos de 6 a -8 semanas de edad C57BL /6 ratones (Harlan, Gannat, Francia) en dos lugares diferentes. El grupo 1 000 ratones células inyectadas compuesto 6 ratones y los otros grupos compuesto 3 ratones cada uno. Los grupos de control fueron inyectados con el mismo número de células procedentes de cultivos adherentes B16-F10 y se resuspendieron en 100 l de DMEM. Los ratones se comprueban de dos a tres veces a la semana durante 50 días. Los ratones fueron sacrificados tan pronto como los tumores alcanzaron 2 000 mm
3 o necrótico se convirtieron con el fin de minimizar el sufrimiento de los animales.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como medias y desviaciones estándar.
Los datos fueron analizados utilizando no paramétrica de Mann-Whitney-Wilcoxon, prueba de Kruskall-Wallis con corrección de Dunn o la prueba de χ2 y p. & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
resultados
B16-F10, HT-29 y MCF-7 células son capaces de formar Tumorspheres
B16-F10, HT-29, MCF-7 y MDA-MB-231 líneas de células se cultivaron de una manera independiente de anclaje , lo que significa sobre un sustrato no adherente en un medio libre de suero que contiene factores de crecimiento con el objetivo de mantener la pluripotencia (
es decir
FGF-b y EGF). Después de 4 días de cultivo de células B16-F10 y 7 días para HT-29 y las células MCF-7, tumorspheres de aproximadamente 100 micras de diámetro se observó (Figura 1) y se disociaron para el subcultivo. Por el contrario, MDA-MB-231 células no lograron formar tumorspheres, incluso después de más de 10 días.
(A) B16-F10, (B) HT-29 y (C) MCF-7 tumorspheres. Tumorspheres se formaron después de 4 a 7 días de cultivo en medio libre de suero que contenía FGF-b y EGF sobre el sustrato adherencia ultra baja. Las barras de escala representan 100 micras.
tumorspheres
B16-F10 pudieron cultivarse como tumorspheres para pasajes prolongados (más de 20 pases). Alrededor del 20% de las células B16-F10 fueron capaces de formar un tumorsphere y esta tasa se mantuvo relativamente constante al menos durante los tres primeros pasajes (Figura 2). Tasas similares se obtuvieron para la eficiencia MCF-7 tumorspheres formación. En cuanto a la línea de células HT-29, 80% de las células adherentes fueron capaces de formar tumorspheres primaria, mientras que se observó una disminución a alrededor de 50% de las células para la formación de tumorspheres secundarias o terciarias. Sin embargo, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas.
Eficacias de formación
Tumorspheres eran altamente dependiente de la línea celular. T1: primaria, T2: secundaria, T3:. Terciaria
La capacidad de formar colonias adherentes se disminuye después de una semana de cultivo como Tumorspheres
Uno tumorspheres semanas de edad derivados de B16-F10, HT-29 o células MCF-7 se disociaron, transferido de nuevo a las condiciones adherentes y sus eficiencias de formación de colonias en comparación con la de las células adherentes. Clonogenicidad de tumorspheres la conformación de las células derivadas de las tres líneas celulares se redujo significativamente, es decir, una caída de 20 a 30% en comparación con las células adherentes (Figura 3, panel A). Por otra parte, 30% a 80% de las colonias adherentes derivadas de células tumorspheres la conformación de B16-F10 eran visiblemente menos denso que los resultantes de las células adherentes (Figura 3, paneles B y C). Esto sugiere que las células que forman tumorspheres-sometieron a una adaptación o una selección al cultivo en suspensión, lo que resulta en una menor capacidad para unir al sustrato. No se observó tal cambio en la morfología de las colonias en el caso de las líneas celulares HT-29 y MCF-7
.
(A) células generaron aproximadamente 20 a 30% Tumorspheres de formación de colonias menos que las células adherentes, en función de la línea celular considerado (*** de p & lt; 0,001 para B16-F10 y células HT-29, ** P & lt; 0,01 para células MCF-7). (B) Las células adherentes B16-F10 siempre formadas de forma redonda y colonias embalados mientras que tumorspheres de formación de (C) B16-F10 células también forman un número variable de colonias mal densos, que van desde 30% hasta 80% del número total de colonias. Las barras de escala representan 200 micras.
Tumorspheres formador
B16-F10 células crecen más lentamente en condiciones adherentes que sus contrapartes adherentes
B16-F10-adherente y tumorspheres forman células (tanto desde tumorspheres primaria y secundaria) se cultivaron en condiciones adherentes durante una semana y su proliferación se cuantificó utilizando el algoritmo de confluencia Incucyte ™. El tiempo de duplicación de las células B16-F10 de tumorspheres secundarios fue significativamente mayor que la de sus homólogos celulares adherentes (Figura 4), sugiriendo de nuevo que las células tumorspheres la conformación se sometieron a una adaptación al cultivo en suspensión, lo que resulta en una proliferación más débil en condiciones adherentes.
tiempo de las células B16-F10 de tumorspheres secundarias de duplicación fue significativamente mayor que la de las células adherentes. Ns: no significativo estadísticamente, * para p & lt; 0,05
Tumorspheres cultura afecta a la expresión de marcadores de CSC en una línea celular dependiente de Manner
La inmunotinción también es un método clásico de identificar. CSC [1], [15]. Por lo tanto, las células de tumorspheres o monocapas adherentes se inmunotiñeron utilizando anticuerpos que reconocen los marcadores más comunes de la superficie de CSC,
es decir.
CD133, CD44 y las proteínas CD24 (Tabla 1). De acuerdo con la literatura, CD133, CD44 y CD24 se utilizan para identificar la población CSC en la línea celular B16-F10 [16] mientras que sólo el CD133 y CD44 son identificados como marcadores fiables para HT-29 CSC [17]. En cuanto a las líneas celulares de cáncer de mama, como las células MCF-7 y MDA-MB-231, un CD44
+ CD24
-. Fue descrita por el perfil CSC [18], [19]
en monocapas adherentes, casi se encontró que todas las células B16-F10 expresadas CD44 mientras que las proteínas CD133 y CD24 en menos de 1% de las células. Sin embargo, estas tasas se mantuvieron sin cambios después de cultivar las células como tumorspheres para un máximo de 23 pasajes. Aunque CSC también puede ser identificado como una población lado capaz de flujo de salida Hoechst 33342 gracias a la membrana transportadores ABC [15], [20], no se detectó población lado, ya sea en B16-F10 adherente o células tumorspheres la conformación (datos no mostrados).
en cuanto a la línea celular HT-29, un aumento del 15% de CD133
+ CD44
+ células se detectó en tumorspheres (49,6% de las células) en comparación con las células adherentes (34,3% de las células) , haciendo alusión a un enriquecimiento en el CSC. Sin embargo, esta diferencia no fue estadísticamente significativa debido a desviaciones estándar altas
El células contenidas alrededor del 50% CD44
+ CD24
7 MCF--. Células en la población adherente. Esta tasa se redujo a 33,1% cuando las células se cultivan como tumorspheres, aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa. En el caso de las células MDA-MB-231, que no eran eficaces en absoluto en la formación de tumorspheres, más de 99% de la población de células adherentes era CD44
+ CD24
-.
Tumorspheres cultura de B16-F10 disminuye la expresión de vimentina y e-cadherina
Como se mencionó anteriormente, varios autores informaron que poseen características CSC células después de la EMT, incluyendo la baja regulación de marcadores epiteliales (
por ejemplo
e-cadherina) y la sobre regulación de marcadores mesenquimales (
por ejemplo
vimentina y Snai1) [8], [11]. Un análisis de RT-qPCR se realizó con el fin de comparar la expresión de E-cadherina, vimentina y Snai1 tanto en las células y tumorspheres adherentes B16-F10. Tanto la expresión de E-cadherina y vimentina gen se redujo significativamente cuando las células se cultivaron como tumorspheres. Detectamos 50% menos de mRNA E-cadherina mRNA (Figura 5, panel A) y 80% menos de vimentina en tumorspheres que en las células adherentes (Figura 5, panel B). Snai1 ARNm no se detectó en condiciones ya sea de cultivos celulares.
Tanto vimentina (A) y E-cadherina (B) se redujeron regulado en tumorspheres. *** Para p. & Lt; 0,001
B16-F10-Tumorspheres células formadoras son menos Tumorígeno de células adherentes en un modelo de ratón singénico
El método estándar de oro para evaluar la presencia de CSC consiste en inyectar una población CSC enriquecido en ratones y la observación de mayor tumor tomar las tasas en comparación con los ratones inyectados con no CSC enriquecido células [1], [15]. ratones C57BL /6 fueron inyectados por vía subcutánea, ya sea con 300, 1 000, 3 000, 10 000, 30 000 o 100 000 células B16-F10 que eran células adherentes para un grupo y células formadoras de tumorspheres para el segundo grupo. Se detectaron tumores cuando habían sido inyectados al menos 1 000 células. Cuando se inyectó este número de células, las células que forman tumorspheres-fueron significativamente menos tumorigénicas que sus contrapartes adherentes (Figura 6, panel B). Sin embargo, en cualquiera de las cantidades más altas de células inyectadas, no se observó diferencia significativa entre los dos grupos (Figura 6, panel A y B).
(A) La inyección de 300, 3 000 000 ó 30 células . (B) La inyección de 1 000, 10 000 ó 100 000 células. Cuando se inyectaron 1 000 células en ratones, las células que forman tumorspheres-fueron significativamente menos tumorigénicas que sus contrapartes adherentes. Adh: células adherentes, Sph: tumorspheres la conformación de las células. Ns:. No significativa, * para p & lt; 0,05
Discusión
Las células madre del cáncer (CSC) actualmente están ampliamente estudiados, ya que se supone que deben iniciar y sostener el crecimiento del tumor y, además, son cree que es responsable de la recurrencia del tumor [1].
cultura Tumorspheres ha informado de enriquecer varias líneas celulares de cáncer como el de mama, hígado, colon y líneas celulares de cáncer de ovario en CSC [15]. En el presente trabajo, hemos probado el enriquecimiento de CSC por tumorspheres cultivo de células de melanoma murino B16-F10, 29 HT-células de adenocarcinoma de colon humano, y MCF-7 y MDA-MB 231 células de adenocarcinoma de mama humano
.
a diferencia de lo Zhong
et al.
observado [21], nuestro experimento mostró que las células B16-F10 proliferaron fácilmente en suspensión como tumorspheres durante 3 meses por lo menos. Las tasas de tumorspheres formadores de células B16-F10 y MCF-7 se mantuvieron constantes durante los tres primeros pasos, lo cual es una característica aceptada de CSC auto-renovación. células HT-29 también generan tumorspheres aunque la tasa de formación tiende a disminuir después del primer paso. Por el contrario, la cultura tumorspheres de células MDA-MB-231 se mantuvo sin éxito. Esta observación fue consistente con lo que informaron algunos autores [22], [23], aunque otros mostraron esta línea celular era realmente capaz de formar tumorspheres [24], [25]. La hipótesis de que la extinción de la capacidad de formación de tumorspheres de nuestras células MDA-MB-231 podría resultar del hecho de que estas células se habían passaged muchas veces antes de nuestros experimentos. En efecto, esta consecuencia del paso de células en tumorspheres tasas de formación se ha demostrado anteriormente [26]. Así pues, otros caracterizaciones se realizaron con el fin de concluir sobre las propiedades de stemness B16-F10, HT-29 y MCF-7 tumorspheres.
El concepto de CSC afirma que el crecimiento del tumor es impulsado por las células cancerosas con características stemness cuales han adquirido un potencial proliferativo y una clonogenicidad mediada por una capacidad de auto-renovación. De acuerdo con esta hipótesis, varios informes mencionan que putativo CSC poseen una mayor clonogenicidad [27] - [31] y proliferan más rápidamente [29] - [31] que los no-CSC. Sin embargo, nuestro estudio mostró que las células B16-F10-tumorspheres forman eran menos proliferativa de las células adherentes en condiciones adherentes. Además, B16-F10, HT-29 y células MCF-7 muestra un potencial clonogénico inferior cuando se cultivan como tumorspheres. La hipótesis de que tumorspheres la conformación de las células adaptadas al cultivo en suspensión, lo que resulta en una menor capacidad para unirse a (y creciendo) en un sustrato adherente regular. Esto de alguna manera descarta la descripción de un enriquecimiento en el CSC en los tumorspheres.
Además, investigó las características stemness utilizando marcadores biológicos clásicos reportados para la identificación CSC [1], [15]. Dou y colaboradores demostraron que B16-F10 CD133
+ CD44
+ CD24
+ células se enriquecen en CSC [16]. Por lo tanto, se comparó el porcentaje de CD133
+, CD44
+ y CD24
+ en las células tumorspheres B16-F10 y las células adherentes, pero no se observó ninguna diferencia. En consecuencia, a pesar de que Hoechst 33342 células de eflujo-competente también se han demostrado en la literatura para ser enriquecido en putativo CSC [15], [20], no se detectó tal población de células en ambos tumorspheres y células B16-F10 adherentes. Esto sugiere que el ensayo de lado la población no es relevante para la detección de CSC en todos los tipos de células.
En cuanto a la línea HT-29 células, un tercio de la población tenía el perfil de CSC de colon,
es decir,
. fueron CD133
+ CD44
+ células [17], [32], y esta tasa aumentó hasta el 50% cuando las células se cultivaron como tumorspheres. Sin embargo, debido a las altas desviaciones estándar en este ensayo, junto con las observaciones de un clonogenicidad disminuido y una disminución de la eficiencia en la formación tumorspheres después del primer paso, pero no hemos podido concluir en un enriquecimiento de CSC.
También cuantificado la CD44
+ CD24
- mama población CSC [33], tanto en células MDA-MB-231 y MCF-7. La antigua línea celular muestra una disminución del 17% en CD44
+ CD24
- población de células en tumorspheres, consistente con el potencial clonogénico más baja se observó cuando las células fueron cultivadas como tal. Sorprendentemente, casi todas las células MDA-MB-231 células adherentes fueron CD44
+ CD24
-, a pesar de que no obtuvo ningún tumorsphere de esta línea celular
Todos estos datos sugieren que la formación de tumorspheres. no siempre se correlaciona con un enriquecimiento en los marcadores de CSC descritos anteriormente y también que la proporción de células que expresan estos marcadores CSC no predice la capacidad de formación de tumorspheres, al menos en el marco de las líneas celulares de cáncer estudiados en este informe.
Más sorprendentemente, el potencial tumorigénico de las células B16-F10-tumorspheres forman era inferior a la de las células adherentes B16-F10, lo que confirma todos los
in vitro
datos que obtuvieron. hallazgos similares Muy recientemente, Collura y compañeros de trabajo publicado [34]. Sin embargo, desde tumorspheres también se encontraron para ser más eficiente en la iniciación de tumores que monocapas adherentes en el caso de varias otras líneas celulares de cáncer [35] - [38], esto sugiere que el efecto de la cultura tumorspheres en tumorigenicidad depende fuertemente de la célula estudiada .
línea
Un número creciente de autores informan que las características de las células presentes después de la EMT CSC [8], [10] - [12]. La expresión de tres genes relacionados EMT-(que codifican para E-cadherina, Snai1 y vimentina) se evaluó en tumorspheres B16-F10 utilizando análisis de RT-qPCR. E-cadherina está implicada en las interacciones entre las células epiteliales y-como es el regulado por Snai1. La vimentina es un filamento intermedio expresado en células mesenquimales. Las dos principales características de la EMT son una baja regulación de la expresión de E-cadherina y una sobre regulación de la expresión de vimentina [39] - [42]. En los ensayos de tumorigenicidad, esto conduce a un aumento de la toma tumor. En nuestro estudio sobre las células B16-F10, el nivel de ARNm de vimentina se redujo dramáticamente en tumorspheres, apoyando el hecho de que presentan una tumorigenicidad menor en comparación con las células adherentes. Sin embargo, el nivel de ARNm E-cadherina también fue menor en tumorspheres y, sorprendentemente, no detectamos Snai1 ARNm que provoca la baja regulación de la E-cadherina durante la EMT [8]. Esto muestra que otra vía puede estar implicado en células tumorspheres formador con el fin de prevenir la expresión de E-cadherina. La combinación de la disminución de expresión de E-cadherina, promoviendo así la EMT, junto con la disminución de expresión de vimentina, promover una transición-mesenquimal a epitelial (MET), puede explicar la pequeña diferencia de tumorigenicidad entre tumorspheres y las células adherentes. Nuestros resultados muestran que tumorspheres cultivo de células B16-F10 de hecho afecta a la expresión de los genes relacionados con la EMT pero aún no se ha dilucidado si las células en tumorspheres presentan las características de la EMT o MET
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En primer lugar, llegamos a la conclusión de que fuerte expresión de marcadores de superficie CSC no es predictiva de la formación tumorspheres, como se muestra para las células MDA-MB-231.
en segundo lugar, nuestros resultados nos llevan a la conclusión de que tumorspheres la cultura no es un método eficaz para enriquecer B16-F10 melanoma murino y MCF-7 líneas celulares de adenocarcinoma de mama humanos en CSC. En cuanto a la línea celular HT-29, los resultados fueron menos claros y no se pudieron obtener conclusiones. Teniendo en cuenta nuestro estudio y los otros informes una mejora de características CSC en cultivos tumorspheres, llegamos a la conclusión de que este método parece enriquecer en CSC de una manera dependiente de la línea celular, independientemente de la especie o de los tipos de cáncer considerados. A pesar de que nuestras conclusiones se extraen sólo de líneas celulares de cáncer, tumorspheres generada a partir de tumores humanos primarios (gliomas) también se han notificado a ser difícil de subcultivo con una mayor diferenciación y apoptosis en comparación con la cultura CSC adherente sobre matraces recubiertos de laminina [43].
para resumir, la formación de tumorspheres no siempre predicen un enriquecimiento en CSC y por lo tanto no puede considerarse como un método universal para CSC enriquecimiento en líneas celulares de cáncer. Una caracterización más amplia de CSC firma en tumorspheres de formación de las células es más importante obligatoria antes de concluir en el logro del enriquecimiento CSC.
Fuera del marco de la CSC de enriquecimiento, la generación de tumorspheres sigue siendo una técnica interesante y útil.