Extracto
Antecedentes y propósito
Ashwagandha es una hierba ayurvédica popular usado en la medicina tradicional de la India el hogar . Se le ha asignado una variedad de efectos que promueven la salud de los cuales los mecanismos siguen siendo desconocidos. Hemos informado anteriormente de la destrucción selectiva de las células cancerosas por el extracto de hoja de Ashwagandha (i-Extract) y su componente purificado Withanone. En el presente estudio, se investigó su mecanismo de detección de pérdida de función (abrogación del inducido i-Extracto de eliminación de células cancerosas) de las dianas celulares y vías genéticas.
Metodología /Principales conclusiones
biblioteca ribozima aleatorios se introdujo en células de cáncer antes del tratamiento con i-Extraer. Las ribozimas se recuperaron de las células que sobrevivieron al tratamiento i-Extraer. objetivos de genes de las ribozimas específicos (como se predijo por búsqueda de base de datos) se analizaron mediante análisis de la bioinformática y la vía. Los objetivos fueron validados por su papel en i-Extracto inducida por la destrucción selectiva de las células cancerosas mediante ensayos bioquímicos y moleculares. Se identificaron quince genes de los objetivos y fueron investigados por su papel en la actividad de destrucción de células cancerosas específicas de i-Extraer y sus dos componentes principales (A y witaferina Withanone) por llevar a cabo el método de silenciamiento génico mediado por shRNA. Bioinformática en los genes de los objetivos seleccionados revelaron la implicación de p53, la apoptosis y la insulina /IGF vías vinculados a la señalización ROS señalización. Examinamos la participación de los componentes de señalización ROS (niveles de ROS, daño en el ADN, la estructura y el potencial de membrana mitocondrial) y demostramos que la destrucción selectiva de las células cancerosas es mediada por la inducción de estrés oxidativo.
Conclusión
Ashwagandha extracto de hoja y Withanone causan la destrucción selectiva de las células cancerosas mediante la inducción de ROS señalización y por lo tanto son potenciales reactivos que podrían ser reclutados para la quimioterapia del cáncer mediada por ROS
Visto:. Widodo N, Priyandoko D, Shah N, R Wadhwa, Kaul SC (2010) la destrucción selectiva de las células cancerosas mediante Ashwagandha Extracto de hoja y su Withanone componente incluye ROS señalización. PLoS ONE 5 (10): e13536. doi: 10.1371 /journal.pone.0013536
Editor: Vladimir N. Uversky, Universidad de Indiana, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Julio, 2010; Aceptado: September 23, 2010; Publicado: 21 Octubre 2010
Derechos de Autor © 2010 Widodo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Nueva Energía y Tecnología Industrial Development Organization (Japón). N. S. es un beneficiario de la beca MEXT, Japón. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
indio sistema de medicina tradicional casa, el Ayurveda es conocido por su historia más antigua del mundo. Ashwagandha (
Withania somnifera
; Solanaceae) y la hierba, orgullosamente llamada Reina de Ayurveda, es una de las plantas más utilizadas en Ayurveda para una variedad de efectos que van desde analgésico, astringente, adaptógeno, anti-inflamatorios, anti -estrés, antiespasmódico, anti-diabetes, inmuno-estimulantes y cardioprotector [1] - [4]. Los extractos de diferentes partes de la planta, incluyendo la raíz, brote, semillas y bayas han estado en uso en varias recetas de remedio casero; raíz siendo particularmente una fuente común para alcaloides, withanólidos y antioxidantes que promueven la salud. Los principales componentes activos de las hojas de Ashwagandha son alcaloides y lactonas esteroides (comúnmente conocido como withanólidos) [5] - [7]. Habíamos investigado previamente la actividad biológica en un extracto alcohólico de extracto de hoja de Ashwagandha (i-Extract) y demostrado que tiene una fuerte actividad anti-cáncer. Por fraccionamiento químico, se le asignó la actividad a su Withanone constituyente (i-Factor) que se mostró para producir la activación de la proteína p53 supresora de tumores en células cancerosas sólo [8], [9]. fibroblastos humanos normales mostraron baja regulación de la función de p53 y el retraso en la senescencia [10].
En el presente estudio, se prevé que el efecto selectivo que mata las células del cáncer de i-extracto o Withanone es probable que sea mediada por más de una genes /vías y por lo tanto llevó a cabo un enfoque imparcial pérdida de función en genes desmontables se logró mediante ribozimas cabeza de martillo. población ribozima rescatado de las células del cáncer de mama humanos infectados por el ribozima biblioteca aleatorio que sobrevivieron al tratamiento i-extracto se caracteriza. Bioinformática, se emplearon ensayos bioquímicos y visuales para investigar los objetivos de genes identificados y revelar su implicación en la muerte de células de cáncer i-Extract-inducida. Se demuestra que la destrucción selectiva de las células cancerosas por i-Extraer y su componente Withanone implica la señalización ROS.
Resultados y Discusión
ribozimas cabeza de martillo (HH-RZ) son los pequeños RNAs catalíticos que poseen martillo conservada como la estructura secundaria. Se pliegan en la conformación activa al unirse a los iones metálicos y se hidrolizan los enlaces fosfodiéster de cadenas de ARN en sitios específicos (NUX, donde N puede ser cualquier nucleótido y X puede ser A, C o T) y por lo tanto se conocen como "tijeras de ARN" [ ,,,0],11], [12]. HH-Rz han estado en uso como herramientas de silenciamiento génicas debido a sus características, tales como, alta especificidad de unión al sustrato, la actividad autocatalítica que no requiere otras enzimas, la estructura flexible que permite manipulaciones y la falta de respuesta de interferón en células de mamífero [13], [ ,,,0],14]. Con el fin de generar una ribozima específica de genes, sus brazos de reconocimiento (7-9 nucleótidos que flanquean el sitio objetivo) están diseñados para incluir la secuencia complementaria al ARNm diana. La aleatorización de estos 7-9 nucleótidos en cada brazo produce una gran variedad de ribozima capaz de dirigir múltiples sustratos de ARNm [11]. Tal grupo de ribozimas degenerados expresa a partir de un promotor exógeno se ha utilizado como una herramienta para la identificación de genes implicados en la apoptosis, migración, invasión, la diferenciación y enfermedades [15] - [20]. Con el fin de identificar los objetivos celulares implicados en la citotoxicidad de células de cáncer de extracto de hoja de Ashwagandha (i-Extract), se infectaron las células MCF7 con biblioteca ribozima aleatorizado retrovirus conducido antes del tratamiento. Como se muestra en la Figura 1, cuando las células de vectores infectados (control) tratados con i-Extracto resultaron en la muerte celular, cultivo infectado biblioteca ribozima mostró la supervivencia celular. Las ribozimas fueron rescatados de estos población de células supervivientes y se caracterizan por la clonación y análisis de secuencias. objetivos de genes para las secuencias de ribozimas aisladas se determinaron mediante la búsqueda de bases de datos (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Los objetivos de genes potenciales de las secuencias de ribozima que se aislaron varias veces se enumeran en la Figura 1C. Con el fin de validar la participación de estos genes en inducida i-Extracto de eliminación de células cancerosas, se realizaron análisis de dos vías (i) gen específico mediada por silenciamiento shRNA y (ii) la investigación vía de la bioinformática y la biología de sistemas dirigida. Preparamos 7 gen (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 y ING1) shRNAs específicos y se investigó su implicación en i-Extraer y sus componentes (Withanone y witaferina A) inducida por la muerte de células MCF7. Incluso en la eficiencia de transfección que van desde 40 hasta 60%, como se determina mediante transfección de un plásmido que expresa GFP, silenciando de cuatro genes (Grupo 1 - TPX2, ING1, TFAP2A y LHX3) se asoció con significativa (20-40%) aumento de la supervivencia celular posterior al tratamiento i-extracto (Figura 2). Los otros tres genes (Grupo 2 - Igf2r, SREBF2 y AKAP11) sólo mostraron aumento menor (2-8%) en la supervivencia. Además, las células comprometidas para la expresión de cuatro genes del grupo 1 escaparon el efecto citotóxico tanto de Withanone y witaferina A. Estos datos sugirieron que estos cuatro genes median la citotoxicidad de i-Extract. Sin embargo, no pueden ser críticamente involucradas en la toxicidad selectiva de i-Extraer y Withanone a las células cancerosas como se describe en nuestros estudios anteriores que demuestran la participación de la vía de p53 supresor de tumores en este fenómeno [8]. Estos datos indicaron que la muerte de células de cáncer por i-extracto se mediada, al menos en parte, por TPX2, ING1, TFAP2A y LHX3. TPX2 es una proteína asociada a microtúbulos que funciona como un regulador alostérico de la Aurora-A, un oncogén con papel esencial en la maduración del centrosoma y la segregación de cromosomas durante la mitosis requiere montaje y mantenimiento de un huso bipolar [21] - [23]. Se sobreexpresa en varios cánceres humanos y se ha propuesto como un objetivo anti-cáncer atractivo [24]. TFAP2A desempeña un papel crucial en el crecimiento tumoral y la progresión, la regulación de la E-cadherina, MMP-2, c-kit, p21
WAF-1, HER-2, Bcl-2, la insulina factor de crecimiento similar al receptor de la 1 y la señalización Smad [25]. LHX3 es un factor de transcripción del homeodominio y juega un papel positivo en el desarrollo embrionario, la determinación del destino celular y la oncogénesis [26], [27]. Por otro lado, ING1, una proteína de la familia ING, está implicada en la senescencia celular humana, la supresión de tumores y la apoptosis [28], [29]. ING1 se ha demostrado que modulan la actividad de p53 y de sus efectores aguas abajo, p21
WAF1 y Bax por acetilación y la estabilización [30]. Tomados en conjunto, los datos sugieren que la eliminación de células cancerosas por i-Extracto podría implicar la represión de TPX2, TFAP2A y LHX3, y la activación de las funciones ING1; el mecanismo y la selectividad para las células cancerosas todavía remian claro.
Presentación esquemática de la pérdida de la función de selección usando biblioteca ribozima aleatorizado. Control de las células tratadas con i-extracto mostró citotoxicidad (
Un
). tratados con células supervivientes i-Extract se recogieron (
B Opiniones). Las ribozimas fueron rescatados de las células supervivientes por la clonación y se caracterizaron por análisis de secuencias (
B Opiniones). objetivos de genes candidatos se muestran en (
C
).
Las células fueron transfectadas con vectores de expresión de shRNA de genes indicados. El efecto de la i-extracto se evaluó mediante el ensayo de la viabilidad celular. Los resultados representan la media de tres experimentos. La significación estadística se calculó mediante análisis de varianza (ANOVA).
Con el fin de identificar dianas celulares cruciales, el próximo emprendimos la bioinformática y la biología de sistemas de enfoque y examinamos la red /vías de los objetivos de genes identificados descritos anteriormente (Figura 3). Los análisis revelaron la implicación de los objetivos de genes aislados en varios tipos de procesos biológicos, tales como, la oncogénesis, ciclo celular, reparación del ADN y el metabolismo del ácido nucleico (Figura 3A). Las dos principales vías identificadas eran supresor de tumores p53 (gen objetivos - DDB2, CDKN1A, CDKN2B) y la apoptosis (objetivos de genes - Igf2r y HSPA9). Es de destacar que los análisis indicaron que el 33% de los genes implicados en la ruta de p53 y su regulación, y el 7% de los genes implicados en la apoptosis se identificaron lo que sugiere que la muerte celular por i-Extracto implica la detención del crecimiento o apoptosis, mediada por la activación de vía supresor p53 tumor. Además, Ras, también se identificaron de insulina /IGF, la angiogénesis y regulación del citoesqueleto de las vías que están estrechamente vinculados con la apoptosis y el desarrollo de tumores. Estos resultados demostraron que el silenciamiento de los genes diana mediada por abroga la i-Extracto de la muerte celular mediante la protección de las células del daño de ADN, la detención del ciclo celular y la apoptosis. análisis de la interacción de red de los genes diana concebido cuatro grupos de genes - CDK4, TFAP2A, CDKN1A-p21 y ING1 vinculado por p53 y PCNA. La participación de estos grupos de genes durante inducida i-Extracto de citotoxicidad sugiere que podría ser caracterizado como las respuestas celulares, incluyendo la respuesta al estrés (HSPA9, CDKN1A) y el daño del ADN y la respuesta de reparación (ING1, DDB2 y TFAP2A), culminando en cualquiera de detención del ciclo celular o apoptosis (Figura 3D). Sobre la base de estos parámetros identificados por el análisis de la bioinformática, que predijo que el i-Extracto podría causar una activación de celulares de señalización de estrés por rutas mediadas por ROS iniciados a dos niveles (i) el estrés mitocondrial que conduce a cambios en el potencial de membrana y (ii) el daño del ADN el estrés conduce a la activación de los daños en el ADN y la maquinaria de reparación (Figura 3E). Es de destacar que la mayor parte de los objetivos de genes identificados parecía encajar en las vías de señalización predichos (Figura 3E). Con el fin de probar esta hipótesis, se investigó si CDKNIA-p21 es el regulador crítico de la mediada i-Extracto de la muerte de células de cáncer. Como se muestra en la Figura 4, mediada i-Extracto de la detención del crecimiento en las células MCF7 (Figura 4A) se asoció con una activación de CDKN1A-p21 (Figura 4B). También se investigó para examinar si CDKN1A-p21 era un mediador crítico de la inducida i-Extracto de eliminación de células cancerosas selectiva. Como se muestra en las figuras 4B y 4C, mientras que CDKN1A-p21 se incrementó en las células MCF7, se mantuvo inalterado en las células normales (TIG-3) en respuesta a cualquiera i-extracto o tratamiento Withanone. Por el contrario, witaferina A causa citotoxicidad para el cáncer y normal de las células y se observó para activar CDKN1A-p21 (Figura 4C). A continuación se investigó la activación de CDKN1A-p21 en el control y la i-extracto de células MCF7 tratados siguiendo las transfecciones de cuatro shRNAs abrogando i-Extracto de matar células MCF7 inducida, al menos en parte (figura 2). Como se muestra en las figuras 4D y 4E, se encontró que el aumento inducido i-extracto en expresión CDKN1A-p21 ha sido abrogada por desmontables de cada uno de estos cuatro genes diana. Estos datos demostraron que el CDKN1A-p21 es un mediador crítico de la inducida i-Extracto de la detención del crecimiento selectivo en células de cáncer. Finalmente a prueba esta hipótesis mediante el empleo de p53 isogénica
+ /+, p53
- /-, p21
+ /+ y p21
- /- HCT116 células de cáncer de colon. Se encontró que mientras que p53
+ /+ y p53
- /- células mostraron una sensibilidad comparable a la i-extracto (datos no mostrados), el p21
- /- las células eran dos y tres veces más tolerante a tratamiento i-Extracto en comparación con el p21
+ células /+ (Figura 4F) que avalan que CDKN1A-p21 es de hecho un mediador esencial de la detención del crecimiento inducido por i-Extracto de las células cancerosas. Los datos fueron consistentes con nuestro modelo propuesto en la figura 3E.
Los procesos biológicos que estuvieron involucrados en mediada i-Extracto de la muerte celular se prevé que incluya la oncogénesis, la proliferación celular y el ciclo celular (
Un
) y p53 implicado, la apoptosis y la insulina /IGF vías de señalización (
B Opiniones). Más predominante entre estas vías eran p53 y la apoptosis (
C
). Los genes diana aparecieron como cuatro grupos (CDK4, p21, y ING1 TFAP2A) que estaban conectados por p53 y PCNA, que participan en el ciclo celular, la respuesta al daño del ADN y genes de reparación del ADN (
D
). Sobre la base de los objetivos de genes seleccionados, se predijo que la célula cancerosa mediado i-Extracto de matar ROS mediada por daños involucrados en el ADN mitocondrial y el nivel con CDKN1A como un mediador crítico (
E
).
inducida i-Extracto de la detención del crecimiento de las células MCF7 se debió a su detención en la fase G2 del ciclo celular (
Un
). Un aumento en la expresión de p21-CDKN1A se observó en las células MCF7 cuando son tratados con i-Extraer y Withanone. No hay un aumento en la expresión de p21-CDKN1A se observó en las células normales en presencia de cualquiera de i-extracto o Withanone (
B Opiniones y
C
). Desmontables de cada uno de los cuatro genes indicados que comprometieron inducida i-Extracto de citotoxicidad también revirtió el i-Extracto de la regulación positiva inducida CDKN1A-p21 (
D
y
E
). HCT116 p21
- /- células fueron menos sensibles a la i-Extracto en comparación con su isogénica p21
+ /+ células. La viabilidad celular en respuesta a las concentraciones crecientes de serie i-extracto (
F
).
Como se predijo por la vía de análisis (Figura 3E), el próximo investigó la implicación de los daños en el ADN y reparación-vía de señalización inducida en i-Extracto de eliminación de células cancerosas. Como se muestra, las células MCF7 mostraron inducción de γH2AX (un marcador temprano de respuesta al daño de ADN) en respuesta al tratamiento con i-Extract, witaferina A y Withanone (Figuras 5A y 5B). También se examinó la fosforilación de γH2AX por inmunotinción con un anticuerpo específico de fosforilación y encontramos que el número de células que contienen fosforilada γH2AX era 70% mayor en las células i-extracto tratado en comparación con el control (Figura 5B). Considerando que el witaferina Un tratamiento indujo γH2AX tanto en las células normales y cancerosas, i-Extraer y Withanone inducida γH2AX sólo en las células de cáncer (Figuras 5A y 5C). En conjunto, estos datos demuestran que la muerte de células de cáncer selectiva por i-Extraer y Withanone estaba mediada por la inducción de daño del ADN y CDKN1A-p21, como se predice en la Figura 3E.
daño en el ADN focos (
A
), la inducción y la fosforilación γH2AX (
B Opiniones) -assessed por tinción con fosfato de anticuerpos específicos (se contaron 100-200 células por diapositiva) se detectaron en las células MCF7 tratados con i-Extract, witaferina Un y Withanone. Las células normales mostraron respuesta al daño del ADN en el tratamiento sólo con witaferina A (
Un
y
C
).
A continuación se investigó la participación de la respuesta al estrés iniciado en mitocondrias inducida en i-Extracto de la muerte de células MCF7. Como se muestra en las figuras 6A y 6B, la inducción de ROS en presencia de i-extracto se detecta, por tanto los métodos de fluorescencia de la sonda (HPF) y la inmunotinción. En consonancia con la citotoxicidad de los dos componentes (A y witaferina Withanone) de i-Extract, inducción ROS se detectó por tanto los componentes en las células MCF7 y sólo por witaferina A en TIG-3 células. Estos datos demostraron que el tratamiento con extracto de i-y plomo Withanone a la inducción de ROS, de forma selectiva en las células cancerosas, por lo tanto, podría ser responsable de la muerte de células de cáncer selectiva. A continuación analizaron el potencial de membrana mitocondrial que se ve muy afectada por los niveles de ROS. Como se muestra en las Figuras 6C y 6D, hubo una disminución en el potencial de membrana mitocondrial en las células MCF7 como se ve por tanto JC-1 tinción y ensayo de exclusión de Rho-123. Tras el tratamiento con i-Extract, las células MCF7 mostraron cambio en JC-1 tinción de rojo a verde (Figura 6C) y negativo para la tinción de Rho-123. Es de destacar que (TIG-3) las células normales eran refractarios a estos cambios cuando son tratados con cualquiera de i-extracto o Withanone (Figura 6C). Estos datos nos hace creer que el i-extracto indujo la destrucción selectiva de las células cancerosas que participan estrés ROS y el daño mitocondrial. Con el fin de obtener evidencia más clara, se analizó la ultraestructura de control y i-extracto tratado células MCF7 a nivel de una sola célula. Como se muestra en la Figura 6E, el control de las células MCF7 mostraron la morfología mitocondrial típica, que se caracteriza por una membrana doble que contiene una matriz homogénea y un sistema de crestas paralelas. células tratadas mostraron Withanone mitocondrias hinchadas con una morfología alterada de las cuales el acortamiento y la reducción en el número de crestas eran evidentes (Figura 6E).
células
MCF7 mostraron la inducción de ROS cuando se tratan con i-Extract, witaferina A o Withanone (
Un
y
B Opiniones). Las células normales mostraron la inducción de ROS sólo en la presencia de witaferina A (
Un
). Se detectó pérdida de potencial de membrana mitocondrial en las células cancerosas MCF7, como se ve por JC-1 tinción con i-Extracto solamente (
C
). inducción preferencial de pérdida de potencial transmembrana mitocondrial en células MCF7 detectadas por citometría de flujo utilizando RHO-123 aumentó de 0,2% de la población en el control al 44% de la población tratada con i-Extract (
D
). daño mitocondrial se detectó en las células MCF7 tratados con Withanone. (
E
), Electrónica de Transmisión imágenes microscópicas de control y células MCF7 tratados con Withanone. Las células de control mostraron mitocondrial alargada normal (M) con crestas paralelas (a) (ampliada la imagen en caja,
b
), Withanone-tratadas las células que muestran las mitocondrias hinchadas con reducido número de las crestas (c) (imagen ampliada en caja,
d
). N, núcleo.
ROS son químicamente moléculas reactivas que tienen papel esencial en la transducción de señales, crecimiento celular y la diferenciación, la regulación de las actividades de la enzima y la respuesta inmune, incluyendo la inflamación y la producción de citoquinas. Considerando que un aumento moderado en ROS promueve la proliferación celular y la diferenciación, su cantidad excesiva causa daño oxidativo irreversible al ADN, proteínas y lípidos conducen a la muerte celular. Las células cancerosas a menudo exhiben alto estrés oxidativo y el aumento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en comparación con los homólogos normales. Este mayor nivel de ROS sirve como una diana terapéutica selectiva por las células del cáncer vulnerables a los reactivos ROS-productores, propuestos como reactivos quimioterapéuticos [31]. Un pequeño número de estudios han presentado pruebas a la matanza selectiva mediada por ROS de las células cancerosas. Estos incluyen, apoptosis selectiva en las células cancerosas por el extracto de aguacate [32], isotiocianato de beta-feniletilo (PEITC) [33], análogos de la talidomida [34] y MKT077 [35] - [36]. Curiosamente, la mayoría de estos reactivos han demostrado causar disfunción mitocondrial [31] - [39]. Hemos demostrado, por primera vez, que el extracto de Ashwagandha hoja (i-Extract) y su componente, Withanone actúan como agentes ROS productoras causando ADN y daño mitocondrial discriminada a las células cancerosas, y por lo tanto son buenos candidatos para la terapia del cáncer seguro.
Materiales y Métodos
células y aleatorizado biblioteca martillo ribozima detección
fibroblastos normales humanos (TIG-3), carcinoma de mama (MCF7), carcinoma de colon (p53 HCT116-
+ /+, p53
- /-, p21
+ /+ y p21
- /-) y envasado del ratón las células, PLAT-e se obtuvieron de la colección japonesa de Recursos Biológicos de investigación (JCRB) Cell Banco y se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) como se describe anteriormente [8] - [10]. Las células fueron tratadas con i-Extract, Withanone y witaferina A para 48 a 72 h para la viabilidad, bioquímicos y análisis visuales. biblioteca ribozima aleatorio (PMX-puro /Rz) se preparó y se infectó en células MCF7 como se describe anteriormente [15]. Se seleccionaron las células infectadas en puromicina (2 mg /ml) medio -supplemented de 24 a 48 h y luego se trataron con i-Extract. Se preparó ARN, utilizando Isogen (Invitrogen), a partir de las células supervivientes después de 4-5 días cuando habían muerto todas las células en el plato de control. Se utilizó el ARN total (2 mg) para la RT-PCR. La transcripción inversa se realizó con el cebador inferior (5 'TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG GTA C-3') y la transcriptasa MMLV (42 ° C, 90 minutos) y el producto de RT fue sometido a amplificación por PCR usando superior (5 ' -tcc CCG CGA GTT AAC CGG GCA-3 ') y cebadores más bajas (94 ° -52 ° -72 ° /30 seg cada uno, 20 ciclos). El producto de PCR amplificado (~ 150 pb) se clonó en un vector de clonación TA (Promega) y se secuenció usando el cebador T7.
Gene específica shRNA-vector de clonación
shRNA vectores de expresión para genes 7 (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 y ING1) se prepararon como se describe [15]. Se seleccionaron dos sitios diana para cada uno de los genes. Las secuencias diana seleccionados para ING1 eran ATATGAAGTTTAAATTCTA y GCCAAGACCTCCAAGAAGA, por TPX2 eran GCAAGAAGGATGATATTAA y GGGGAAGAATGGAACTGGA, por TFAP2A eran GGAGGAAGATCTTTAAGAG y GATCAAACTGTAATTAAGA, por AKAP11 eran GAGTGAAGCTTTATCAAAT y GCACAAACATGGAAAGTCA, por SREBF2 eran GCCTCAACCTCAAACTCAG y ATGCAAAGGTCAAAGATGA, por LHX3 eran GCGACGAGTTCTACCTCAT y GGGAGAGCGTTTACTGCAA, y por IGF2R eran GGCAGAAACCCAAACTGAA y GGAGGAAATACTACATTAA.
(MCF-7) células
viabilidad de las células de ensayo
cáncer de mama humano se transfectaron con 50 ng del ADN plásmido indicado. Después de 24 h, las células se trataron con i-Extract (6 g /ml), witaferina A (1 M), Withanone (25 mg /ml) durante 48 h. Vacío vector shRNA se utilizó como control. La viabilidad de las células se controló por ensayo de proliferación celular basado en WST (Roche). Se seleccionaron las dosis para i-Extraer y Withanone basado en la destrucción selectiva de las células cancerosas como se describió anteriormente (8-10). Se observaron las dosis más bajas de la i-Extraer y Withanone para inducir la diferenciación de las células de glioblastoma y neuroblastoma [40, y datos no mostrados].
Western Blot
El conjunto lisado celular (10-20 g) en tampón de lisis NP40 obtenido por centrifugación a 10.000 rpm durante 20 min a 4 ° C se utilizó para inmunotransferencia como se describe [8]. Los anticuerpos utilizados fueron p53 (DO-1; Santa Cruz Biotechnology), anti-mortalin [8], p21 (C-19; Santa Cruz Biotechnology) y anti-γH2AX-fosforilada (Ser139) anticuerpo (Biolegend)
inmunotinción
Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se fijaron con metanol: acetona (01:01), se permeabilizaron en 0,2% PBST, se bloquearon con 2% de BSA (albúmina de suero bovino) /PBS y se incubaron con primero y segundo anticuerpo diluido en 2% BSA /PBS [8]. Para la tinción γH2AX, las células se fijaron con formaldehído al 4% y se permeabilizaron con una solución de KCM (KCl 120 mM, NaCl 20 mM, 10 mM Tris pH 7,5, 0,1% de Triton). El bloqueo y el anticuerpo preparación se realizaron en solución Abdil (2% de BSA, 0,2% de gelatina, NaCl 150 mM, 0,1% de Triton X-100, 20 mM Tris pH 7,5, 0,1% de azida de sodio en agua MilliQ).
la detección de especies reactivas del oxígeno
las especies reactivas del oxígeno se detectaron mediante tinción fluorescente usando la imagen-iT ™ VIVO especies reactivas del oxígeno verdes (ROS) Kit de detección (Molecular Probes Inc, EE.UU.). Las células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio colocados en placas de 12 pocillos y se trataron con reactivos indicados durante 48 h y se tiñeron para ROS siguiendo el procedimiento recomendado por los fabricantes. Cuantificación de la producción de ROS con el análisis de FACS se basó en HPF (2- [6- (4 'hidroxi) fenoxi-3H-xanten-9-il-3-0n] benzoico) de fluorescencia. Brevemente, se cultivaron células MCF-7 en el plato de 6 cm hasta 50% de confluencia, se trató con i-Extracto durante 12 h seguido de la adición de HPF (10 mM). Después de 4 h, las células se lavaron con PBS, se recogieron con rascador de células. fluorescencia celular se midió por Coulter de Epic XL citómetro de flujo (Beckman).
potencial de membrana mitocondrial
potencial de membrana mitocondrial para el control y las células tratadas fue examinado por JC-1 y RHO-123 [35] ensayos de células de tinción con base. Para JC-1 tinción, las células MCF7 cultivadas en placas de 24 pocillos (50 a 60% de confluencia) se trataron con i-Extracto durante 48 h seguido por incubación con JC-1 mancha (10 mg /ml) durante 15 min a 37 ° C en CO
2 incubadora. Las células se lavaron con PBS y se procesaron para microscopía. Para el ensayo RHO-123, células MCF-7 se cultivaron en placa de 6 cm hasta 50% de confluencia, se trató con i-Extracto de 48 h. Las células tratadas se incubaron con rho123 (1 mM) medio -supplemented por 1 h. Las células se lavaron con PBS y se recogieron con la célula-rascador. Los cambios en el potencial de membrana mitocondrial se controlaron mediante Coulter de Epic XL citómetro de flujo (Beckman).
Análisis ultraestructural de células individuales
MCF7 células se sembraron en cubreobjetos de vidrio. Al 60% de confluencia, las células se trataron con Withanone para 24 h. Control y las células tratadas se lavaron con PBS y después se fijaron con 1,2% glutarldehyde en 4 ° C durante 1 h. Después de post-fijación con 1% OSO
4 a 4 ° C durante 1 h, las células se lavaron en PBS y se deshidratan a través de concentraciones graduales de etanol con incubación final en n-butil éter glycidyel para 15 min. Las muestras se incluyeron en resina epoxi (TAAB) y se cortaron en secciones ultrafinas con un ultramicrotomo Reichert (Leica). Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y se examinaron con un microscopio electrónico Hitachi H-7000. Para evaluar las alteraciones mitocondriales, se observaron aproximadamente 50 células por muestra a partir de dos experimentos independientes.
Bioinformática y análisis estadísticos
Pathway análisis y asociación proceso biológico fueron asignadas mediante el análisis de datos PANTHER-expresión [41] , [42], un conceptualmente simple prueba binomial para comparar las clasificaciones de varios clústeres de lista seleccionada con una lista de referencias (NCBI:
Homo sapiens
genes) para determinar estadísticamente excesiva o escasa representación de las categorías de clasificación PANTHER. consecuencia proceso biológico se selecciona en función de valor sobre-representación y el valor P inferior a 0,5. interacciones proteína-proteína de los genes diana se realizaron con Osprey basado en el Repositorio General de la interacción de datos (la red) y la ontología de genes (GO) [43].