Extracto
Fondo
Debido a que las vías de señalización celular y del metabolismo celular se ejecutan a través de proteínas, las firmas de proteína en tumores primarios son útiles para identificar nodos clave en las redes cuya alteración está asociada con la malignidad de señalización y /o los resultados clínicos. Este estudio tuvo como objetivo determinar las firmas de proteínas en tejidos de cáncer de pulmón primario.
Metodología /Principales conclusiones
Se analizaron 126 proteínas y /o sitios de fosforilación de proteínas en muestras normales y tumorales de casos de concordancia de 101 de pulmón pacientes con cáncer con matriz de proteínas de fase inversa de ensayo (RPPA). Los resultados mostraron que 18 moléculas fueron significativamente diferentes (
p
& lt; 0,05) en al menos un 30% entre los tejidos normales y tumorales. La mayoría de estas moléculas juegan un papel en la proliferación celular, la reparación del ADN, la transducción de señales y el metabolismo de los lípidos, o función como proteínas de la superficie celular /matriz. También validados RPPA resultados por transferencia y /o inmunohistoquímica análisis Western para algunas de esas moléculas. Los análisis estadísticos demostraron que los niveles Ku80 fueron significativamente mayores en los tumores de los no fumadores que en los de los fumadores. los niveles de ciclina B1 se sobreexpresa significativamente en los tumores pobremente diferenciados, mientras que los niveles de Cox2 se sobreexpresa significativamente en los tumores neuroendocrinos. Un alto nivel de STAT5 se asocia con el resultado de supervivencia favorable para los pacientes tratados con cirugía.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados revelaron que algunas moléculas implicadas en el daño del ADN /reparación, transducción de señales, el metabolismo lipídico y la proliferación celular aberrante fueron drásticamente en tejidos de cáncer de pulmón, y STAT5 puede servir un marcador molecular para el pronóstico de los cánceres de pulmón
Visto:. Él y, Z Zhou, Hofstetter WL, Zhou y, Hu W, Guo C , et al. (2012) la expresión aberrante de las proteínas implicadas en la transducción de señales y vías de reparación del ADN en el cáncer de pulmón y su asociación con los parámetros clínicos. PLoS ONE 7 (2): e31087. doi: 10.1371 /journal.pone.0031087
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 21 de julio de 2011; Aceptado: 2 Enero 2012; Publicado: 10 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 He et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo de subvenciones del Instituto Nacional del cáncer: R01CA-092487 (otorgada a BF), RO1CA-124951 (otorgada a BF), Institutos nacionales de Salud de subvención Core 3P30CA-016672-32S3, la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center de programa de subsidios para CA- 016672 - Programa de pulmón y la proteómica funcional de fase inversa facilidad de la base de proteínas de matriz, el Fondo Homero Flor gene Therapy Research, el Fondo Rogers Terapia génica Charles, la flora y fondo de investigación de Stuart Mason cáncer de pulmón, el Fondo Memorial Charles B. Swank para el cáncer de esófago la investigación, el Fondo O. George Sweeney para la investigación de cáncer de esófago, el Fondo Torácica Terapia génica Phalan, y el Fondo dotado MW Elkins Torácica Surgical Oncology, Fundación Chapman, la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81172113, 81071912) y "1510 del proyecto "de la Tercera Universidad médica Militar de China (adjudicado a YH). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las características moleculares de cáncer de pulmón a través de ensayos de matriz génica para mRNA y microRNA ha llevado a la identificación de las firmas moleculares que son potencialmente útiles para la predicción de la supervivencia y la enfermedad del paciente recaída y /o la respuesta a los fármacos quimioterapéuticos individuales basado en jerárquica y clustering probabilística de los niveles de microARN mRNA [1] y [2]. Además, los estudios de polimorfismos de un solo nucleótido de ADN genómico han conducido a la identificación de posibles loci de genes en la región cromosómica 15q25 [3] que codifican genes de la subunidad de los receptores de acetilcolina nicotínicos que están muy asociadas con la susceptibilidad al cáncer de pulmón. Sin embargo, para la mayoría de los genes, no existe una correlación significativa entre el ARNm y los niveles de proteína [4]. Por lo tanto, las vías de señalización clave que reflejan los procesos que transforma la enfermedad aún no se han identificado. Debido a que la transducción de la mayoría de señales y regulación vía se llevan a cabo por las proteínas se someten a modificación postranscripcional, tales como la fosforilación, que no pueden ser detectados por el ADN, ARNm, o miARN análisis, se necesita caracterización de los niveles de proteína y el estado de fosforilación de proteínas para obtener las firmas de proteínas que reflejan funcional y /o cambios metabólicos en el cáncer de pulmón y /o la respuesta a los agentes terapéuticos, tales como inhibidores de la quinasa.
se han hecho esfuerzos para determinar las firmas de proteínas en el cáncer de pulmón mediante electroforesis en gel de dos dimensiones y la posterior identificación de proteínas en masa espectrometría de ensayo o mediante el uso de análisis de espectrometría de masas directa [5]. Si bien esta tecnología es útil para la identificación de proteínas expresadas diferencialmente en los tejidos tumorales, es probable que no adaptable a la rápida rendimiento ensayos necesarios para la aplicación clínica debido a los procesos que requieren mucho tiempo implicados, la posibilidad de contaminación de la señal debido a miles de puntos de datos involucrados en el análisis, y la posible corrupción de los conjuntos de datos debido a problemas de diseño experimental [6].
el reciente advenimiento de la tecnología de microarrays de proteínas puede permitir la identificación de los nodos críticos o las interacciones dentro de la red de rutas de señalización celular . La ventaja del método RPPA es que una sola sonda de prueba (anticuerpo) se utiliza para cada matriz, por lo que la condición de prueba es consistente para cada anticuerpo, proporcionando de este modo una mejor reproducibilidad y sensibilidad que otras técnicas de matriz de proteínas. Con anticuerpos evaluados y validados a fondo, un RPPA se puede utilizar para detectar diferencias de señal en unos pocos miles de moléculas en el análisis de muestras [7]. Por lo tanto, esta tecnología es útil para el seguimiento de los cambios en los niveles de proteína y la fosforilación de proteínas en el tiempo, antes y después del tratamiento, entre los tejidos tumorales y normales, y entre los respondedores y no respondedores. Una vez que se identifican los objetivos diferenciales, es posible utilizar métodos convencionales para probar un pequeño subconjunto de biomarcadores moleculares para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento. Con este fin, se recogieron muestras de tejido pulmonar normales y malignas de casos de concordancia de 101 pacientes y se determinaron sus niveles de proteína y los estados de fosforilación de proteínas utilizando el método RPPA y 126 anticuerpos. En este caso, nos informan de que varios nodos moleculares que son fundamentales en la unión celular, reparación del ADN, la proliferación celular y la transducción de señales son expresados diferencialmente entre los tejidos normales y cancerosas, algunos de ellos se asociaron con parámetros clínicos, incluyendo los resultados de supervivencia.
Resultados
paciente y del tumor Características
Hemos recogido casos de concordancia muestras normales y malignos tejido pulmonar de 101 pacientes. Las características de los pacientes y los tumores se resumen en la Tabla 1. Los pacientes tenían entre 42 a 86 y, con una edad media de 65 años y, y el 55% eran mujeres. La mayoría de los pacientes (93%) eran de raza caucásica. El adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas representaron el 56% y el 31% de los tipos histológicos, respectivamente. La mayoría de los pacientes (66%) tenían enfermedad en estadio I. Alrededor del 50% de los tumores fueron pobremente diferenciado, y el 40% era moderadamente diferenciado. Noventa pacientes (89%) tenían antecedentes de consumo de tabaco /fumar. Veinticuatro pacientes tenían la quimioterapia neoadyuvante, y uno tenía la radioterapia neoadyuvante.
Expresión diferencial entre el tumor y los tejidos normales revelado por RPPA
Para cada muestra y cada anticuerpo, la señal en el ensayos RPPA se comparó entre los tejidos normales y tumorales. La diferencia de señal entre los tejidos normales y tumorales se calculó como sigue: [(media de tumor tejidos-media de los tejidos normales) /(media de los tejidos normales × 100%)]. De 126 proteínas o sitios de fosforilación analizados, 18 tenían diferencias de señal que eran mayores que 30% y fueron estadísticamente significativas (
p
& lt; 0,05) en todas las muestras normales y tumorales analizadas (Tabla 2). Estos 18 moléculas se pueden categorizar como moléculas asociadas con la proliferación celular (ciclina B1), moléculas adaptadoras en la transducción de señales (14-3-3zeta, IRS1-PS307, y IGFBP2), las moléculas en el metabolismo lipídico (COX2 y ACC-pS79), moléculas involucrados en las respuestas al daño del ADN (Ku80, CHK2, y ATM), superficie de la célula o moléculas de la matriz (caveolina-1, CD31, y el colágeno tipo VI), y moléculas de señalización de vías (vía PI3K /AKT: PI3K-p85, mTOR, y S6K ; vía Src /Stat: STAT5 y Src; y vía de la MAP quinasa: p38-PT180). Las intensidades de señal para la ciclina B1, IGFBP2, y caveolina 1 en muestras de tejido de cada caso se muestran como ejemplos en la Fig. 1. La mayoría de estas moléculas se ha informado que desempeñan papeles críticos en varios tipos de cáncer o de tener la expresión alterada en varios tipos de cáncer. Por ejemplo, la pérdida de caveolina 1 de expresión [8], [9] y la sobreexpresión de ciclina B1 [10], [11] en el pulmón han sido previamente informado de tejido de cáncer en estudios con arrays de cDNA y análisis inmunohistoquímicos.
a) la intensidad de la señal (eje y) para cada caso (eje X) para las moléculas de ciclina B1, IGFBP2, y caveolina 1. B) la distribución de señales se posó en tejidos normales y tumorales.
Debido a que 88 de los 101 casos de este estudio eran o adenocarcinoma o carcinoma de células escamosas, analizamos si estas 18 moléculas fueron significativamente diferentes entre las muestras normales y tumorales de tejido para los dos subtipos principales de no pequeñas de cáncer de pulmón de células. Los resultados mostraron que 13 de las 18 moléculas fueron significativamente diferentes entre el tejido normal y tumoral, tanto para el adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas (p = 0.05, Tabla S2), un hallazgo similar a la observada cuando se analizaron en conjunto todas las muestras. Dos moléculas (COX2 y S6) no fueron significativamente diferentes cuando adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas se analizaron por separado, mientras que PI3K-p85, Src, y mTOR permaneció significativamente diferentes entre los tejidos normales y tumorales en adenocarcinoma pero no en el carcinoma de células escamosas. Si las vías PI3K /mTOR /S6 y Src son más críticos en el adenocarcinoma que en el carcinoma de células escamosas o si este resultado se debió a un menor número de muestras de carcinoma de células escamosas en el estudio no está claro.
Validación de RPPA datos
se realizó análisis de transferencia de Western en moléculas cuyas expresiones se cambiaron en relativamente un gran número de tejidos tumorales, incluyendo la ciclina B1, caveolina 1, colágeno VI, ACC1 /pS79, CHK2, y IGFBP2. Los resultados mostraron que los datos obtenidos de análisis de transferencia de Western coincidían con las de ensayo RPPA (Fig. 2, Fig. S1), lo que demuestra que los datos obtenidos de ensayo RPPA eran fiables y pueden ser validados por análisis de transferencia Western.
ciclina B1, caveolina 1, colágeno de tipo VI, ACC-pS79, CHK2, y IGFBP2 en tejidos normales y tumorales primarias de pulmón se analizaron por transferencia de Western en al menos cuatro casos en los que RPPA mostró diferencia de señal en tejidos normales y tumorales. Los resultados de Western blot fueron consistentes con los generados por RPPA.
Ni ensayo RPPA ni Western blot proporcionan información sobre qué tipos de células, tumor o estroma, contribuyeron a las diferencias observadas. Para determinar los tipos de células en las que se expresan diferencialmente las proteínas, se realizó un análisis inmunohistoquímico de cinco moléculas (ACC-pS79, CHK2, IGFBP2, ciclina B1 y caveolina 1) sobre muestras que mostraron diferencias entre los tejidos normales y tumorales. Los resultados mostraron que las diferencias en la expresión de los cinco moléculas se derivaron de la expresión alterada en las células cancerosas pero no en células estromales (Fig. 3). Se observó una heterogeneidad notable en la expresión de proteínas en las células tumorales de la ciclina B1. Sólo una parte de las células tumorales se tiñeron fuertemente con anticuerpo ciclina B1 mientras que otras células tumorales en el mismo tumor mostraron muy bajo o negativo para la tinción de ciclina B1, posiblemente debido a la diferente condición de los ciclos celulares. la expresión de ciclina B1 es conocido por ser dependiente del ciclo celular y alcanzó su punto máximo en G2 /M [12]. La sobreexpresión o pérdida de la expresión de otras moléculas era mucho menos heterogénea.
El aumento de expresión de ACC-pS79, CHK2, IGFBP2, ciclina B1, STAT5, ATM y Ku80, y la disminución de la expresión de caveolina-1 en los tejidos tumorales fueron comparados con los tejidos normales de los mismos casos que se muestran withconsistent con los resultados producidos por RPPA y análisis de Western blot. 40 aumentos.
Nanjundan
et al.
Informó recientemente de un RPPA perfiles de análisis de los casos de cáncer de pulmón 46 con 63 proteínas o de los sitios de fosforilación de proteínas e identificó varias proteínas se expresaron diferencialmente en primaria tejidos de cáncer de pulmón [13]. Por lo tanto, se compararon los resultados del estudio actual con la del estudio de Nanjundan. Los dos estudios utilizaron grupos de muestras completamente separadas. Todas las muestras utilizadas en el estudio de Nanjundan se recogieron antes de 2000, mientras que las muestras utilizadas en este estudio fueron recolectados después de los sitios phosphoryaltaion 2006. Cuarenta y ocho proteínas /proteína fueron probados en los estudios de ambos. Ocho de once (72,7%) los marcadores que fueron significativamente diferentes entre los tejidos normales y cancerosas en el estudio de Nanjundan tienen diferencias significativas similares en los estudios actuales. Tres moléculas (27,3%) (FAK, β-catenina y AKT) que fueron significativamente diferentes (p = 0,002 a 0,003) en el estudio de Nanjundan no fueron significativos en este estudio. Este resultado indica que la validación de los resultados de los estudios separados RPPA será importante, aunque la mayoría de las moléculas expresadas de forma diferente son consistentes en los dos estudios.
Tres (caveolina-1, ciclina B1 y Src pY527) de cuatro firma marcador que diferencia NSCLC de pulmón normal en el estudio de Nanjundan también fueron significativamente diferentes entre los tejidos normales y tumorales de los estudios actuales. Por ello, utilizó conjunto de entrenamiento de Nanjundan (25 casos) para probar si estos tres firma marcador podría ser utilizada para diferenciar todo el conjunto de datos (101 casos) del presente estudio. El resultado mostró que estos tres marcadores, ya sea solos o en combinación, podrían distinguir tumor de la normal de este estudio con diferentes precisiones, sensibilidades y especificidades (Tabla 3). En general, una combinación de dos o tres marcadores mejoró ya sea la precisión, sensibilidad o especificidad.
Asociación con los datos clínicos
Se analizó si la expresión de las moléculas 18 aparece en la Tabla 2 en tejidos tumorales se asoció con ningún parámetro clínico. El análisis estadístico reveló que los niveles de estas moléculas en los tejidos tumorales no se asociaron significativamente con el estadio clínico o de género. Sin embargo, la expresión de Ku80 fue significativamente mayor en las muestras de pacientes sin historia de tabaquismo que aquellos con historia de tabaquismo (
p
= 0,004). La expresión de ciclina B1 fue significativamente mayor en los tejidos tumorales pobremente diferenciados que en moderada o tejidos tumorales bien diferenciadas (
p
& lt; 0,025). Por otro lado, la expresión de ATM, Ku80, y S6 fue significativamente mayor en los tejidos tumorales bien diferenciadas que en los tejidos tumorales mal o moderadamente diferenciados (Fig. 4). Cuando se comparó la expresión en diferentes tipos histológicos, las expresiones de ATM, Ku80, IGFBP2, IRS1-PS307, y S6 fueron significativamente mayores en carcinoma neuroendocrino que en adenocarcinoma o carcinoma de células escamosas (
p
& lt; 0,05). Este resultado sugiere que la expresión de ciertas moléculas eran dramáticamente diferente en los tumores neuroendocrinos, en comparación con los de adenocarcinoma o cáncer de células escamosas, mientras que los niveles de las proteínas expresadas diferencialmente listados en la Tabla 1 fueron más o menos similares entre adenocarcinoma y cáncer de células escamosas. Sin embargo, debido a los números relativamente bajos de tumores neuroendocrinos utilizados en este estudio, no es claro si existe una firma molecular específica para este tipo de cáncer.
Los niveles de proteína en los tejidos tumorales detectadas en el ensayo se analizaron para RPPA asociaciones con parámetros clínicos de los pacientes. La molécula que fue significativamente diferente en los tumores basados en parámetros clínicos analizados se muestra en la parte superior de cada gráfico. Los parámetros clínicos se muestran en la parte inferior de cada gráfica. Los diagnósticos histológicos y la diferenciación se basa en los informes patológicos en la base de datos clínicos. * Indica que la diferencia fue significativa cuando se compara con otros grupos en el mismo gráfico (
p Hotel & lt; 0,05).
Asociación con los resultados de supervivencia
Para determinar si los niveles de estas proteínas se asocian con los resultados clínicos, se realizó un análisis de supervivencia de los marcadores proteicos expresados diferencialmente se muestran en la Tabla 1, utilizando el método de Kaplan-Meier. En pocas palabras, separamos los pacientes en dos grupos en función del valor medio de expresión de cada marcador individual, grupos designados como de alta y baja expresión, y luego usando el algoritmo de Kaplan-Meier para calcular las curvas de supervivencia de los dos grupos definidos de cada marcador. El resultado mostró que los niveles de STAT5 se asociaron significativamente con la supervivencia cuando se analizaron los resultados tanto con los pacientes en estadio I-III (p = 0,032) y con los pacientes en estadio I solamente (p = 0,014) (Fig. 5). Los pacientes con un alto nivel de STAT5 en sus tejidos tumorales tenían una supervivencia favorables resultados en comparación con los que tienen un menor nivel de STAT5, lo que sugiere que STAT5 podría ser un marcador útil para el pronóstico de los cánceres de pulmón
. Análisis
de Kaplan-Meier en la asociación de los niveles STAT5 y los resultados de supervivencia para la etapa I-III (a) (n = 50 para cada grupo), y la fase I solamente (B) de los pacientes (n = 33 para STAT5 grupo alto, 34 para STAT5 grupo bajo).
Discusión
Se analizaron las diferencias moleculares en los niveles de proteína o de fosforilación de proteínas entre los tejidos normales y el cáncer de pulmón en 101 muestras de ensayo de RPPA. De 126 moléculas analizadas, se identificaron 18 moléculas que estaban drásticamente (& gt; 30%) y estadísticamente significativa (
p
& lt; 0,05) diferente entre las muestras normales y tumorales. El análisis de transferencia Western y /o ensayos de inmunohistopatológico de varias moléculas validaron los resultados obtenidos a partir de matrices de RPPA, lo que demuestra que los resultados del análisis RPPA son fiables. Por otra parte, una comparación con un estudio realizado en otro RPPA de muestras de pacientes mostró que los resultados de perfiles RPPA eran altamente repetible y consistente en estudios separados con conjunto separado de muestras de pacientes. Nuestros resultados también indican que la expresión de varias moléculas en los tejidos tumorales se asoció con antecedentes de tabaquismo, la diferenciación y tipos histológicos de cáncer de pulmón
.
Una serie de biomarcadores identificados aquí son consistentes con los reportados en la literatura en términos de sus expresiones de genes alterados en los tejidos tumorales, incluyendo caveolina 1 [8], [9], la ciclina B1 [10], [11], 14-3-3zeta [14], Stat5 [15], p38 activado [16], y IGFBP2 [17]. Sin embargo, para algunas moléculas, algunos resultados contradictorios fueron reportados por otros previamente. Por ejemplo, se encontró expresión CHK2 o su activación a disminuir en los tejidos tumorales de cáncer de pulmón no de células pequeñas de una matriz de tejido disponible comercialmente [18], o se incrementaron en un 50% de las muestras de pulmón y tumores de mama resecado quirúrgicamente de pacientes no tratados [ ,,,0],19]. Se encontró que la expresión CHK2 se incrementó tanto en adenocarcima y tejidos pulmonares de carcinoma de células escamosas, que consta con lo reportado por DiTullio et al [19]. El aumento de expresión de COX2 fue encontrado en nuestro estudio, pero era menos frecuente que lo reportado por Hida et. al en pacientes japoneses, donde se observó un aumento significativo en la expresión de COX2 en 70% de los casos de adenocarcinoma invasivo [20]. Nuestro resultado fue consistente con lo reportado por Khuri et al, quienes observaron que sólo unos pocos casos tenían COX2 expresión fuerte en los tejidos tumorales [21].
Curiosamente, nuestros resultados mostraron que varias moléculas implicadas en el daño del ADN /reparación (ATM, CHK2 y Ku80) se incrementaron en los tejidos tumorales. El aumento de los niveles de mRNA de ATM y DNA-PKcs, pero no de Ku80, fueron detectados en los tejidos tumorales en comparación con tejidos normales adyacentes [22]. Sin embargo, poco se sabe acerca de la expresión de proteínas de cajeros automáticos en los tejidos de cáncer de pulmón primario. ATM, CHK2, y /o Ku80 son considerados como genes supresores de tumores que están implicados en la respuesta al daño de ADN [23], [24]. Curiosamente, se encontró que la activación constitutiva de la vía /CHK2 ATM en células de cáncer de p53 mutante [19]. El aumento de los respuesta al daño de ADN /reparación de moléculas en los tejidos tumorales puede reflejar la presencia de inestabilidad del genoma en células de cáncer, una característica común que distinguen los cánceres de los tejidos normales [25]. Es de destacar que la sobreexpresión de Ku80 fue encontrado en el cáncer de cabeza y cuello y cáncer de piel en [26], [27], y puede ser causada por la activación de NFkB y COX2 [28]. Alternativamente, el aumento de expresión de Ku80 en pacientes no fumadores o tumores neuroendocrinos puede reflejar una gran demanda de reparación de doble filamento se rompe por unión de extremos en los tejidos de cáncer no homóloga porque Ku80 es crítica en esta vía de reparación del ADN. Esas moléculas pueden servir como un marcador para la terapia del cáncer dirigidas a la vía de reparación del DNA [29]. Debido a veinticinco pacientes incluidos en este estudio tenían varias quimioterapias o radioterapia neoadyuvante, hemos analizado si el aumento de expresión de estas moléculas se asoció con quimio y radioterapia. El análisis estadístico mostró que el aumento de expresión de ATM, CHK2, y Ku80 no se asoció con la quimioterapia o la radioterapia neoadjuvent. Por lo tanto, el aumento de la expresión de estas moléculas de daño en el DNA /reparación se indujo poco probable por el tratamiento, sino más bien una característica intrínseca de los tumores primarios.
Varias proteínas desreguladas identificadas aquí se han investigado como dianas terapéuticas para el tratamiento del cáncer. Las moléculas pequeñas o inhibidores de quinasas dirigidas a los receptores del factor de crecimiento y la vía PI3K /Akt /mTOR, Src /Stat, p38, y las vías /CHK2 ATM se investigaron ampliamente para el tratamiento del cáncer, tanto preclínica y clínica, incluido el tratamiento de los cánceres de pulmón [29] - [ ,,,0],31]. Un estudio reciente demostró que la inhibición de ATM o CHK2 es suficiente para sensibilizar a las células tumorales deficientes en p53, pero no de p53 de tipo salvaje células, a genotóxico cisplatino como agente quimioterapéutico o doxorrubicina [32], lo que sugiere que la combinación de cisplatino o doxorubin con cajero automático o CHK2 los inhibidores podrían beneficiar a los pacientes portadores de tumores p53 mutante. Nuestros resultados también mostraron que el aumento de expresión de STAT5 puede servir como biomarcador pronóstico favorable para los pacientes con cáncer de pulmón tratados con cirugía. Aunque los mecanismos subyacentes siguen siendo de mayor investigación, STAT5 como marcador tumoral de pronóstico favorable se ha informado de cáncer de mama [33] - [35] y el cáncer nasofaríngeo [36]. Las pruebas demostraron que STAT5 promueve la adhesión homotípica e inhibe características invasivas de las células de cáncer de mama humano [34]. Ya sea que lo mismo ocurre con el cáncer de pulmón de células aún no se han investigado más a fondo. Sin embargo, la asociación significativa de STAT5 con los resultados clínicos, en particular en el cáncer de pulmón en estadio I, sugirió que STAT5 podría ser un biomarcador pronóstico útil para el cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
tejido pulmonar humano las muestras
normal y muestras de tejidos malignos de pulmón fueron recogidos entre 2006 y 2009 a partir de especímenes extirpados quirúrgicamente en virtud de un protocolo de investigación del Laboratorio-90-020 con el consentimiento informado de los pacientes. El estudio fue aprobado por el comité de ética local (la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center). Los tejidos normales fueron al menos 5 cm de distancia desde el borde de los tumores correspondiente en las mismas muestras. Tanto los tejidos normales y tumorales se obtuvieron de la sala de operaciones inmediatamente después de especímenes fueron retirados de los pacientes. En todos los casos, el control de calidad histología fue realizada por un patólogo torácica en secciones de tejido. Las muestras tumorales fueron incluidos en el análisis de si el porcentaje de células malignas presentes en la muestra eran ≥70%. muestras de pulmón normal de los mismos pacientes fueron revisados para confirmar que no contenían células malignas. Todas las muestras se dividieron en dos porciones: una porción era instantáneamente congelados y almacenados en nitrógeno líquido para la extracción de proteínas; Por otra parte se fijó en formalina y embebidos en parafina para exámenes histológicos o inmunohistoquímicos de rutina. Se recogieron las parejas de diferentes muestras, se procesan y analizan al mismo tiempo, en virtud de los mismos protocolos.
RPPA Ensayo
ensayo RPPA se realizó en las instalaciones de núcleo de la proteína de matriz proteómica funcional en fase inversa en nuestra institución como hemos descrito anteriormente [37]. Brevemente, las muestras de tejido se lavaron dos veces en PBS enfriado con hielo y después se homogeneizaron en tampón RPPA de lisis [1% de Triton X-100, 50 mmol /L de HEPES (pH 7,4), 150 mmol /L de NaCl, 1,5 mmol /L MgCl
2, 1 mmol /l de EGTA, 100 mmol /l de NaF, 10 mmol /L Nappi, 10% de glicerol, 1 mmol /L de Na
3Vo
4, 1 mmol /l de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y 10 mg /ml de aprotinina]. Después de la centrifugación, se recogió el sobrenadante, y la concentración de proteína se determinó por la rutina (
, Bradford
por ejemplo.) Los ensayos y luego se ajustó a 1-1,5 mg /ml por adición de tampón de lisis. Los lisados de tejido se mezclaron con 1/4 volumen de 4 x tampón de muestra de SDS que contiene 40% de glicerol, 8% de SDS, 0,25 M Tris-HCl (pH 6,8), y 10% (v /v) 2-mercaptoetanol (recién añadido) . Dos veces lisados de tejidos diluidas en serie (de no diluido a la dilución 1:16) se imprimieron en portaobjetos de nitrocelulosa recubierto (Whatman, Inc.) mediante el uso de un arrayer GeneTAC G3 (Genomic Solutions), junto con sus correspondientes controles positivos y negativos preparados a partir de la tampón de dilución. Un total de 126 anticuerpos validados específicos para las proteínas o sus sitios fosforilados que están involucrados en diferentes vías de señalización estaban disponibles y utilizados en la RPPA (ver Tabla S1 para los anticuerpos utilizados en este estudio). Cada portaobjetos se sondeó con un anticuerpo primario validado más un anticuerpo secundario conjugado con biotina. La señal se amplificó utilizando un sistema de DakoCytomation (Dako) catalizada y se visualizó por 3,3'-diaminobenzidina tetrahidrocloruro reacción colorimétrica. Las diapositivas fueron escaneados, analizados y cuantificados usando software personalizado, Microvigene (VigeneTech, Inc.), para generar intensidad in situ. Las señales procedentes de cada dilución fueron equipados con el modelo no paramétrico desarrollado por el Departamento de Bioinformática y Biología Computacional en el MD Anderson [38]. Las concentraciones de proteína de cada conjunto de diapositivas fueron normalizado y corregido a través de muestras de los valores de expresión lineales, utilizando la mediana de los niveles de expresión de todos los experimentos de anticuerpos para calcular un factor de corrección de carga para cada muestra, como se describe anteriormente [13], [37] .
análisis Western blot
para validar los resultados de los ensayos RPPA, se realizó un análisis de Western blot para un subconjunto de moléculas que mostraron diferencias significativas entre los tejidos normales y cancerosas. Alrededor de 40 mg de cada muestra de tejido congelado se lavó dos veces en PBS frío y se homogeneizó en 0,5 ml de tampón de lisis enfriado en hielo. Extractos equivalentes a 50 a 60 g de la proteína total se separaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 10%, después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Se realizó el análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [37]. Los anticuerpos para IGFBP2, caveolina-1, CHK2 (1C12), y fosfo-acetil-CoA carboxilasa (ACC-pS79) fueron adquiridos de la señalización celular, anticuerpo para la ciclina B1 era de Epitomics, y colágeno de tipo VI de Santa Cruz Biotechnology.
tinción inmunohistoquímica y Evaluación
Los mismos anticuerpos utilizados para el análisis de Western blot se utiliza para la tinción inmunohistoquímica. secciones fijadas en formalina e incluido en parafina de tejido (5 m de espesor) se deparaffinized, hidratados, y se calienta en un vapor para la recuperación de antígenos. Las diapositivas fueron teñidas con diversos anticuerpos como se describe anteriormente. Los tejidos no incubadas con un anticuerpo de control IgG a los ratones en lugar de un anticuerpo primario se utilizaron como control negativo.
Análisis estadístico
El análisis de varianza se realizó utilizando el software STATISTICA (StatSoft, Inc. ) para las comparaciones entre los grupos. Se utilizó
t
de Student para la comparación entre los dos grupos. Se utilizó el análisis discriminante lineal diagonal (DLDA) para la clasificación y predicción de los tejidos normales y tumorales. Los datos de supervivencia se analizaron mediante el método de Kaplan-Meier y el modelo de regresión de Cox. Un
p-valor de & lt
; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Apoyo a la Información
Figura S1.. Los niveles de proteína
detectados por Western blot en 6 casos adicionales para IGFBP2 y CHK2. tejidos tumor de pulmón primario (T) IGFBP2 y CHK2 en normal (N) y se analizaron por Western blot en 6 casos adicionales en los que RPPA mostró diferencia de señal en tejidos normales y tumorales. β-actina se utilizó como control de carga
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031087.s001 gratis (TIF)
Tabla S1.
expresión diferencia en el adenocarcinoma y el cáncer escamoso *
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031087.s002 gratis (DOC) sobre Table S2.
Las proteínas y los sitios de fosforilación utilizados en los estudios RPPA.
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031087.s003 gratis (DOC)
Reconocimientos
Agradecemos Markeda Wade para su revisión editorial