Extracto
cáncer colorrectal esporádico (CCR) es una enfermedad común y también una de las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo. La expresión aberrante de la Sox2 factor de transcripción se ha observado recientemente en varios tipos de cáncer, pero su papel en el CRC no ha sido completamente aclarada. A continuación se estudió la expresión de Sox2 en 441 pacientes con CCR mediante técnicas de inmunohistoquímica y relacionamos la expresión de las variables clínico-patológicas y moleculares y el pronóstico del paciente. Sox2 se expresó en el 11% de los tumores y se asoció significativamente a
BRAF
V600E
mutación, pero no a
KRAS mutaciones
(codón 12 y 13). positividad Sox2 se correlacionó con la supervivencia pobre paciente, especialmente en
BRAF
V600E
casos mutados.
in vitro
estudios mostraron que las células que expresan el constitutivamente activa
BRAF
V600E
había aumentado la expresión de Sox2, un hallazgo que no se encuentran en las células que expresan
KRAS
G12V
. Por otra parte, el bloqueo de la señalización de BRAF aguas abajo usando un inhibidor de MEK-dio lugar a una disminución de expresión de Sox2. Ya que la sobreexpresión Sox2 se ha correlacionado con el aumento de la migración y la invasión, se determinó la expresión de Sox2 en metástasis hepáticas CRC humana y se encontró que un Sox2 positivo primaria CRC también tenía la expresión de Sox2 en metástasis hepáticas correspondiente. Finalmente, encontramos que las células que sobreexpresan SOX2
in vitro
mostraron una mayor expresión de FGFR1, que se ha informado que se correlaciona con la metástasis de hígado en CRC. Nuestros nuevos hallazgos sugieren que la expresión de Sox2 está regulada en parte por la señalización de BRAF, y un aumento de la expresión de Sox2 puede promover la metástasis CRC y mediar un mal pronóstico del paciente
Visto:. Lundberg IV, Löfgren Burström A, Edin S, V Eklöf , Öberg Å, Stenling R, et al. (2014) la expresión de Sox2 está regulada por BRAF y contribuye al pronóstico de los pacientes pobres en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (7): e101957. doi: 10.1371 /journal.pone.0101957
Editor: Andreas-Claudio Hoffmann, del Centro del Cáncer de Alemania Occidental, Alemania |
Recibido: 31 Enero, 2014; Aceptado: June 12, 2014; Publicado: 10 de julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Lundberg et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación de Investigación del cáncer en el norte de Suecia, la OE y Edla Johanssons fundación, Petrus y la Fundación Augusta Hedlunds, Fundación Magn Bergvall, La Sociedad de cáncer de Suecia, el Consejo Sueco de Investigación y la Universidad de Umeå. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer colorrectal esporádico (CCR) es una enfermedad común en el mundo occidental y una de las principales causas de muerte por cáncer. La alta tasa de mortalidad, debido a la enfermedad diseminada oculta o clínicamente identificado ya el momento del diagnóstico, hace hincapié en la importancia de una mayor comprensión de los eventos biológicos que conducen a un cáncer invasivo. Este conocimiento es importante para predecir el pronóstico del paciente y crear nuevas terapias potentes. El adenoma a carcinoma secuencia depicture los eventos genéticos necesarios para un epitelio de colon normal a ser transformado en un fenotipo maligno en la mayoría de los casos de CCR esporádicos [1]. Dado que el proceso metastásico en CRC no se entiende como totalmente, es difícil dilucidar por qué algunos tumores se hacen más agresivos y metastatizan más fácilmente que otros. Por lo tanto, la identificación de marcadores moleculares expresados en los tumores invasivos que pueden predecir un mal pronóstico del paciente es un importante tema de investigación.
SRY (región determinante del sexo Y) -box 2 (Sox2) es un miembro de la gran
SOX familia de genes
, que comprende factores de transcripción conocidos por ser importantes en la regulación de procesos de desarrollo y especificación de tipo de células [2]. El SOX2 miembro clave desempeña funciones esenciales en el mantenimiento de la pluripotencia de células y la auto-renovación tanto en células madre embrionarias [3] y en células madre pluripotentes inducidas [4]. Recientemente se ha informado también de que la auto-renovación de las células madre de cáncer se mantiene por SOX2 [5], lo que sugiere un papel de ongogenic SOX2. La sobreexpresión de SOX2 se puede ver en CRC [6] - [8], así como en varios otros tumores malignos como el de mama, de páncreas y cáncer gástrico [9] - [11], lo que demuestra su participación en la carcinogénesis. Además, SOX2 se ha sugerido que participan en el CCR la migración celular, invasión y metástasis, donde la metaloproteinasa de matriz 2 (MMP2) se ha propuesto como un mediador potencial para el efecto SOX2 [6], pero todavía tienen que ser descubierto los mecanismos exactos .
en el presente estudio se evaluó la expresión de Sox2 en el CCR primaria, así como en las muestras correspondientes de metástasis hepáticas, y correlacionaron los hallazgos con el pronóstico del paciente y las características del tumor moleculares. Nuestros resultados sugieren que la expresión de Sox2 es, al menos en parte, regulado por el BRAF, y que la expresión de BRAF
V600E en una forma dependiente de la etapa se correlaciona con un mal pronóstico del paciente.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
en el presente estudio, el manejo de las muestras de tejido y datos de los pacientes fue aprobado por el comité de ética de investigación en el hospital de la Universidad de Umea (regional de Ética Junta de Revisión en Umeå, Suecia). Esto incluye el procedimiento por el cual los pacientes verbalmente dieron su consentimiento informado, que fue documentado en cada historia clínica del paciente y considerado por el Comité de Ética de ser suficiente. Cada muestra de tejido se registró como un número de caso y el año en la base de datos utilizada para el análisis, y los nombres de identificación personal o no se indica.
Las muestras clínicas
Las muestras de tejido CRC incluidos en el estudio eran del cáncer colorrectal en el Estudio de Umeå (Crums), que consiste en pacientes que han sido extirpados quirúrgicamente por CRC primaria entre 1995 y 2003 en el hospital de la Universidad de Umea, Suecia. clasificaciones histopatológicas de todos los casos fueron realizados por un patólogo mediante la revisión de las secciones del tumor de tinción rutinaria. Los datos clínicos se obtuvieron mediante la revisión de los registros de los pacientes, y se recogieron los datos de supervivencia durante el otoño de 2012.
13 pacientes con archivo de tejidos, tanto desde el adenocarcinoma colorrectal primario y metástasis hepática correspondiente distante que fueron diagnosticados en el mismo intervalo de tiempo Crums se incluyeron en el presente estudio. Estos fueron identificados usando la base de datos de registro de pacientes computarizado en el Departamento de Patología Clínica, Hospital de la Universidad de Umea, Suecia. Los tumores se clasificaron y diagnosticados por los patólogos en el momento de la cirugía o biopsia.
Inmunohistoquímica
especímenes de CRC se fijado con formalina y embebidos en parafina de acuerdo con protocolos de rutina en el Departamento de Patología Clínica, Umeå hospital de la Universidad, Suecia. Ellos se redujeron a 4 micras y después se secan, deparaffinized y rehidratada. anticuerpo policlonal anti-SOX2 [12] - [14] (Abcam, Cambridge, Reino Unido) se utilizó a una concentración de 1:500 en una máquina de tinción semiautomática (Bench marca Ultra, Ventana Inc) y se visualizaron mediante el kit de detección de iVIEW DAB (Ventana Cª)). Las diapositivas se counterstained con hematoxilina.
Para Crums, 449 casos fueron teñidas inmunohistoquímicamente, pero debido a la falta de material tumoral (n = 7) o la pérdida de tejido repetida durante la etapa de recuperación de antígeno (n = 1), ocho de ellos no pudieron analizarse para la tinción SOX2. Todos los 13 pacientes con metástasis correspondiente se tiñeron con éxito, y todos podrían ser analizados para las células SOX2-positivo. Las muestras fueron examinadas bajo microscopio de luz, y cada muestra se evaluó dos veces por el mismo observador y en los casos con puntuación discrepante, se hizo una tercera evaluación final. tinción nuclear se evaluó como negativo o positivo. De vez en cuando tinción citoplasmática o estroma no se analizó.
Los análisis estadísticos
Las asociaciones entre la expresión de Sox2 y diferentes variables clínico se analizaron mediante χ de Pearson
2 pruebas. Para estimar la supervivencia específica del cáncer, se utilizó el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y las comparaciones entre grupos se realizaron mediante la prueba de log-rank. Los pacientes en la cohorte Crums que murieron dentro de un mes a partir de la cirugía debido a complicaciones postoperatorias (n = 37) fueron excluidos del análisis de la supervivencia. Modelos de riesgos proporcionales de Cox se utilizaron para los análisis multivariados. eventos específicos del cáncer se define como la muerte con la enfermedad diseminada conocido o recurrente, y los casos fueron censurados al final del seguimiento o en el momento de la muerte por otras causas. SPSS /PASW versión de software estadístico 20 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EE.UU.) se utilizó para el análisis estadístico. los niveles de expresión génica se compararon mediante
t
prueba de Student de dos colas. Cada barra representa una media de tres experimentos independientes y las barras de error muestran la desviación estándar.
p
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo para todos los análisis
Líneas celulares y cultivo celular
En el presente estudio, la línea celular de cáncer de colon Caco2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE.UU.) se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con glutamax complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco, Life Technologies, Estocolmo, Suecia) y se mantuvo a 37 ° C y 5% de CO
2. Generación de los transfectantes estables que expresan Sox2 (Caco2-Sox2), BRAF mutante (Caco2-BRAF
V600E) o KRAS mutantes (Caco2-KRAS
G12V) se llevó a cabo mediante la transfección de células Caco2 con pcDNA3.3-Sox2 ( Derrick Rossi, el hospital infantil de Boston, EE.UU., a través de Addgene), pMCEF-BRAFV
600E (proporcionado amablemente por el Prof. R. Marais) o pcDNA3-KRAS
G12V (especie de regalo del Dr. N. Ignatenko) utilizando células Caco-2 el reactivo de transfección (Altogen Biosystems, las Vegas, NV, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Entre 48 y 72 horas después de la exposición al ADN, se seleccionaron las células transfectadas con G418 800 mg /ml (Gibco, Life Technologies, Estocolmo, Suecia). Medio que contiene G418 se cambió dos veces a la semana.
Para bloquear la señalización de BRAF en Caco2 y Caco2-BRAF
células V600E, 20 mM inhibidor de MEK PD98059 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), o DMSO como control, se añadió a las células después de la incubación durante 24 o 48 h.
RT-PCR
ARN total fue aislado de las células utilizando el kit NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel, Duren , Alemania), y se sintetizó ADNc con la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, Life Technologies, Estocolmo, Suecia) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los cebadores utilizados en el estudio fueron de ADN Technology A /S (Aarhus, Dinamarca) y sus secuencias fueron los siguientes: GAPDH hacia adelante: 5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 ', inversa: 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'. Sox2 hacia adelante: 5'-AACCCCAAGATGCACAACTC-3 ', inversa: 5'-CGGGGCCGGTATTTATAATC-3'. FGFR1 hacia adelante: 5'-AGGCTACAAGGTCCGTTATGC-3 ', inversa: 5'-TGCCGTACTCATTCTCCACAA-3'. FGFR2 hacia adelante: 5'-TTAAGCAGGAGCATCGCATTG-3 ', inversa: 5'-GGGACCACACTTTCCATAATGAG-3'. FGFR3 hacia adelante: 5'-CCTCGGGAGATGACGAAGAC-3 ', inversa: 5'-CGGGCCGTGTCCAGTAAGG-3'. FGFR4 hacia adelante: 5'-TGCAGAATCTCACCTTGATTACA-3 ', inversa: 5'-GGGGTAACTGTGCCTATTCG-3'. Cada reacción de PCR contenía 25 ng de cDNA y cada muestra se llevó a cabo por duplicado. Los experimentos se repitieron tres veces. Las desviaciones estándar se calcularon de la media de las reacciones por triplicado. El RT-PCR reacciones se realizaron en Taqman 7900HT (Applied Biosystems, Life Technologies, Estocolmo, Suecia) y siguientes parámetros de ciclación fueron utilizados: 50 ° C durante 2 min y luego una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60ºC durante 60 s. expresiones de genes se normalizaron a GAPDH.
Western blot
Para analizar la expresión de Sox2 en el establo transfectante Caco2-Sox2, las células se lisaron en tampón de lisis (100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA pH 8,0, MgCl 15 mM
2, inhibidores de la proteína) antes de proteínas se separaron mediante SDS PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). La transferencia se incubó con el anticuerpo primario SOX2 (1:1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.) y el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) según las instrucciones del fabricante. La transferencia se reveló con reactivo ECL Seleccionar Western Blot Detección (GE Healthcare, Uppsala, Suecia).
gotita Digital PCR
ADN genómico se aisló de las células utilizando el kit de tejido Nucleospin (MACHEREY Nagel, Düren, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
digital gotita de PCR (ddPCR, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) se utilizó para verificar la Caco2 transfectantes que expresan mutante
BRAF
V600E gratis (Caco2-BRAF
V600E) y
KRAS
G12V gratis (Caco2-KRAS
G12V). El ddPCR-método se ha presentado a fondo en otra parte [15], [16]. Brevemente, el ddPCR permite la detección y cuantificación tanto de la mutación y de tipo salvaje en la misma reacción utilizando el FAM HEX fluoróforos y conjugado con sondas específicas de secuencia. En el ddPCR-método, una muestra de PCR de 20 l se divide en 20 000 nanolitros gotitas que proporciona cerca de 20 000 lecturas.
Para verificar una transfección con éxito de
V600E BRAF-Caco2, los cebadores y sondas fueron de la siguiente manera: hacia adelante: 5'-GCACAGGGCATGGATTACTTACA-3 ', inversa: 5'-ATCCAGACAACTGTTCAAACTGATG-3', salvaje sonda, del tipo: 5'-56-FAM /TTGGTCTAGCTACAGTGAAAT /3BHQ_1-3 ', sonda de mutación: 5'-5HEX /TTGGTCTAGCTACAGAGAAAT /3BHQ_1-3 '(DNA Technology A /S, ADN Tecnología A /S) [17], [18]. La PCR se realizó en un ciclador térmico T100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.), utilizando el programa: 95 ° C durante 10 min; 40x ciclos de 95 ° C durante 15 s y 56 ° C durante 1 min (velocidad de rampa 2 ° C /seg); y 98 ° C durante 10 min. Se utilizaron 900 nM de los cebadores, y 250 nM de la sonda respectiva
Para la detección de la transfección con éxito de Caco2-KRAS
G12V, se utilizaron ensayos para ddPCR (PrimePCR ddPCR ensayo de mutación:. KRAS p.G12V ensayo, humano; PrimePCR ddPCR ensayo de mutación: KRAS de tipo salvaje para el ensayo p.G12V, Humanos, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) con las condiciones de PCR según el manual proporcionado por la empresa: 95 ° C durante 10 minutos; 40x ciclos de 94 ° C durante 30 s y 55 ° C durante 1 min (velocidad de rampa 2 ° C /seg); y 98 ° C durante 10 minutos.
Cada reacción de PCR contenía 50 ng de ADN y las gotitas se prepararon en un generador de gotas QX100 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.). El producto de PCR final se detectó en un lector de QX200 gotita (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.) y el resultado se analizaron con software QuantaSoft, Versión 1.4 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EE.UU.).
CpG fenotipo isla methylator (CIMP) estado
tumor estado CIMP se determinó por el método MethyLight con secuencias de cebadores y sondas que se describe anteriormente [19], [20]. A los ocho genes en el panel CIMP (
CDKN2A
,
MLH1
,
CACNA1G
,
Neurog1
,
RUNX3
,
SOCS1
,
IGF2
y
CRABP1
) [20] el porcentaje de referencia metilado (PMR) se calculó, donde PMR & gt; 10 fueron considerados como positivos [19]. Los tumores se clasifican como CIMP negativo (sin promotor hipermetilación), CIMP baja (de uno a cinco genes metilados) o altas (CIMP seis a ocho genes metilados) [20].
inestabilidad de microsatélites (MSI) de estado de detección
proteínas de reparación de genes se analizaron por inmunohistoquímica, como se describe anteriormente [20]. En pocas palabras, fijado en formol e incluidas en parafina de tejido CRC se examinó la expresión de cuatro proteínas de reparación de genes (MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2). Una muestra considerada que tiene un estado positivo de cribado MSI carecía de tinción nuclear en las células tumorales para al menos una de las proteínas y se refiere como MSI. Un estado negativo de detección de MSI tenía expresión de los cuatro genes y se remitió a estable como microsatélites (MSS).
BRAF
V600E mutacional estado
El ensayo de discriminación alélica TaqMan, se describe en detalle en otra parte [17], se utilizó para la detección de la
BRAF
V600E
mutación (reactivos de Applied Biosystems, Life Technologies, Estocolmo, Suecia).
secuenciación del gen KRAS
El análisis mutacional de
KRAS
se ha explicado en otra parte [21]. . La secuenciación se realizó utilizando Big Dye v 3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies, Estocolmo, Suecia) y cebadores utilizados fueron: hacia adelante: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGG-3 'y revertir: 5'-CAGGAAACAGCTATGACCTCTGTATCAAAGAATGGTCCT-3'.
resultados
expresión de Sox2 en el CCR se correlaciona con el grado del tumor, el estadio TNM y
BRAF mutación
la expresión de Sox2 nuclear en las células tumorales se evaluó en 441 muestras de pacientes de CRC por inmunohistoquímica, donde la expresión se evaluó como positiva o negativa (Figura 1). En los casos positivos, la expresión de Sox2 nunca fue visto en todo el tumor, pero los núcleos positivos se encuentra en partes limitadas. No se evaluó estromal ocasional o tinción citoplasmática. 47 (10.7%) de las muestras de CRC muestran células tumorales que expresan Sox2 y la expresión en relación con diferentes características clinicopatológicas se muestran en la Tabla 1. En nuestra cohorte de pacientes, se encontró que la expresión de Sox2 que se asociaron significativamente con un alto grado tumoral (
p
= 0,004) y el estadio TNM (
p = 0,034
). la expresión de Sox2 también fue altamente correlacionada con
BRAF mutación
(
p Hotel & lt; 0,001), pero, sorprendentemente, ninguna correlación con
KRAS
mutaciones podría ser visto (
p
= 0,928).
(a) negativo tinción Sox2 nuclear en un CRC moderadamente diferenciado. (B) tinción positiva Sox2 nuclear en un CRC poco diferenciado.
expresión Sox2 se correlaciona con una pobre supervivencia del paciente
supervivencia específica del cáncer análisis reveló que los pacientes con Sox2 tumores positivos tenían un peor pronóstico que los pacientes con tumores negativos SOX2 (Figura 2a). Esta asociación fue aún más fuerte cuando sólo el
BRAF
tumores mutados fueron analizados (Figura 2b), mientras que no hay diferencia de la expresión de Sox2 en la supervivencia se observó en
BRAF
tumores de tipo salvaje (Figura 3c). la expresión de Sox2 no tiene ningún efecto sobre el pronóstico del paciente en
KRAS
tumores mutados (
p = 0,676
). En un modelo multivariado de riesgos proporcionales de Cox, incluyendo la edad, el sexo,
BRAF
mutación, y la expresión de Sox2, el mal pronóstico para los pacientes con la expresión de Sox2 versus ninguna expresión de Sox2 mantuvieron la significación estadística (razón de riesgo (HR) = 1,64, 95 % IC 1,04 a 2,58,
p = 0,032
). Al ajustar aún más para la etapa en el análisis multivariado, el impacto pronóstico de la expresión de Sox2 se perdió (IC HR = 1,04, 95% 0,65 a 1,67,
p = 0,878
), haciendo hincapié en la dependencia etapa.
se muestran los gráficos de Kaplan-Meier de la supervivencia específica del cáncer en (A) todos los pacientes con CRC, (B)
BRAF
V600E
CRC pacientes mutados o (C)
BRAF
tipo salvaje pacientes con CCR.
células Caco2 (A), las células que expresan establemente Caco2
BRAF mutación
(Caco2-BRAF
V600E) y células que expresan establemente Caco2
KRAS
mutación (Caco2-KRAS
G12V). la expresión de Sox2 en Caco2 se establece como 1. Caco2 (B) después del cultivo con MEK-inhibidor, 24 o 48 h, o DMSO durante 48 h como control. la expresión de Sox2 en Caco2 tratados con DMSO se establece como 1. Caco2 BRAF-
V600E (C) después del cultivo con MEK-inhibidor, 24 o 48 h, o DMSO durante 48 h como control. la expresión de Sox2 en Caco2-BRAF
V600E tratados con DMSO se establece como 1. PD: PD98059 (inhibidor de MEK-), *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p Hotel & lt; 0,001, ns: no significativo
p-valor
expresión Sox2 está regulada por BRAF
In. vitro
a medida que la expresión de Sox2 correlacionado con mutado
BRAF
en nuestra cohorte de pacientes, se continuó analizando su relación molecular
in vitro
. La línea celular Caco2 CRC, con BRAF endógeno y KRAS no mutado, se transfectadas ya sea con BRAF
V600E o KRAS
G12V con el fin de establecer líneas celulares que expresan de forma estable mutante
BRAF gratis (Caco2-BRAF
V600E, Figura S1a) o mutante
KRAS gratis (Caco2-KRAS
G12V, figura S1b). Por análisis de RT-PCR, se encontró que Caco2-BRAF
V600E expresó aproximadamente el doble que SOX2-niveles en comparación con Caco2 (
p = 0,013
), un aumento que no se observó en Caco2-KRAS
G12V (Figura 3a). Estos resultados, en concordancia con nuestros datos de la cohorte de pacientes (Tabla 1), sugieren que la expresión de Sox2 está regulada por BRAF mutado. El
BRAF
V600E
mutación BRAF hace en un estado constitutivamente activa, la estimulación de la cascada de señalización en ausencia de estímulos extracelulares [22] MEK /ERK. De hecho, el bloqueo de BRAF señalización corriente abajo en BRAF Caco2-
células V600E utilizando el PD98059 MEK-inhibidor, dio como resultado una disminución en la expresión de Sox2 (Figura 3c), lo que sugiere que se trata principalmente de la bien caracterizada MEK activación de la actividad de BRAF que regula Sox2 . Además, los bajos niveles endógenos de SOX2 en células Caco2 también se redujeron por el MEK-inhibidor (Figura 3b), lo que implica que BRAF responder a las señales de activación endógenos también regula la expresión de Sox2. En conjunto, estos resultados apoyan el papel de BRAF como un regulador de aguas arriba de la expresión de Sox2.
Sox2 primaria CRC positivo tiene Sox2 metástasis hepáticas correspondiente positivo
Teniendo en cuenta el hecho de que la expresión de Sox2 se correlaciona con un paciente peor pronóstico, hemos querido estudiar la expresión de Sox2 en tumores primarios, así como metástasis a distancia correspondiente. Para ello, 13 pacientes con tejido archival tanto desde un adenocarcinoma colorrectal primario y metástasis hepática distante se incluyeron en el estudio y la expresión SOX2 nuclear se evaluó en las células epiteliales. Dos de los 13 tumores primarios eran Sox2 positivo, mientras que los otros once tumores fueron negativos Sox2. Curiosamente, SOX2 tumores primarios positivos también fueron positivos en SOX2 correspondiente metástasis hepática, mientras que los tumores negativos SOX2 tenían SOX2 metástasis hepática negativa (Tabla 2). Digno de mención, estas metástasis positiva Sox2 eran morfológicamente más parecidos de los compartimientos tumorales que tienen SOX2 núcleos positivos que el resto del tumor primario (datos no mostrados).
Sox2 mejorar la expresión de FGFR1
La desregulación de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) se ve en CRC, así como en otros tipos de cáncer [23], [24]. Dado que se ha sugerido que Sox2 regula la expresión de FGFR3 [7], hemos querido estudiar si Sox2 altera la expresión de los FGFR en nuestro
sistema in vitro
.
Una línea de células que sobreexpresan Sox2 se estableció mediante la transfección de la línea celular CRC Caco2 con Sox2 (Caco2-Sox2, la figura S2). La expresión de FGFR1-4 se analizó por RT-PCR en las células Caco2 y células Caco2-SOX2. Se encontró FGFR1 expresión que ser dos veces mayor en Caco2-Sox2 como en Caco2 (
p = 0,036
), mientras que no se observaron diferencias significativas en cuanto a FGFR2, FGFR3 o FGFR4 (Figura 4).
Expresión de FGFR1, FGFR2, FGFR3 y FGFR4 por análisis de RT-PCR en las células Caco2 y células Caco2 de forma estable sobreexpresan SOX2 (Caco2-SOX2). La expresión en Caco2 se establece como 1. *
p Hotel & lt; 0,05, ns:. No significativa
p-valor
Discusión
en este estudio se investigó la expresión de Sox2 en el CCR en correlación con diversas variables clínico-patológicas y moleculares y su efecto sobre el pronóstico del paciente. 11% de los tumores fueron positivos Sox2, y la expresión correlaciona con el grado del tumor, el estadio TNM y
BRAF
mutación. Adicionalmente, se encontró que la expresión de Sox2 predice un pronóstico más pobre paciente de una manera dependiente etapa, en particular, en
BRAF
casos mutados. Por último, se introduce Sox2 posible regulador de la expresión FGFR1.
Debido a la participación de Sox2 afirmado en el documento CRC tumorigénesis [25] hemos querido estudiar la expresión de Sox2 en nuestros Crums cohorte de pacientes. Se encontró que el 11% de los tumores expresó Sox2 y mediante la comparación de la expresión de diferentes características clinicopatológicas pudimos ver que la expresión de Sox2 se correlacionó con tumores poco diferenciados (alto grado). Esto encaja con el conocimiento de que SOX2 es un conocido marcador de células madre, y se ha sugerido que se expresa en las células madre de cáncer [5], [26]. Como SOX2 menudo se expresaron en una parte limitada del tumor, se especula que estas células podrían estar representando el nicho de células madre de cáncer en estos tumores particulares. Hemos encontrado además que la expresión de Sox2 se correlacionó con mal pronóstico del paciente en una forma dependiente de la etapa, que es coherente con algunos estudios anteriores [6], [27], [28].
SOX2 ha sido descrito por otros para mejorar el efecto migratorio e invasivo de las células de CRC [6], [7] como también, de otros tipos de células del cáncer [29] - [31], lo que implica que las células que expresan SOX2 podrían albergar una capacidad metastásica superior. En CRC también se ha sugerido que la expresión de Sox2 puede predecir la metástasis tumoral [6]. Sin embargo, no hay estudios existen en la actualidad de la expresión de Sox2 en las metástasis tumorales. Aquí hemos demostrado que las metástasis de hígado que corresponde a SOX2 tumores primarios positivos también albergan células tumorales SOX2 positivo. Aunque estas muestras de tejido de pacientes eran muy pocos, todavía indica que las células SOX2 positivos son más propensos a migrar. Sería, por supuesto, ser interesante y necesario estudiar esto en un material del paciente más grande para su verificación. El hecho de que las células positivas SOX2 solamente formados por una pequeña proporción de todo el tumor, sugiere que estas células pueden mostrar un fenotipo más invasiva que las células tumorales circundantes. Otra evidencia de apoyo para un comportamiento más invasivo de las células tumorales positivas SOX2 es que las metástasis eran morfológicamente más similares a las partes del tumor con núcleos positivos SOX2. A pesar de que la comparación morfológica entre los tumores primarios y metástasis sólo podía ser estudiada en dos casos, nos encontramos con que es probable que refleje las células específicas que hayan dado lugar a metástasis distantes.
la expresión de Sox2 se correlacionó con
BRAF
mutación en nuestra cohorte de tejido, pero no hay correlación se podían ver entre la expresión de Sox2 y
KRAS
mutaciones. Nuestro
in vitro
encontrar que un aumento de la expresión de Sox2 se observó en las células que expresan BRAF
mutación V600E pero no KRAS
mutación G12V, confirma esta correlación. El /RAF /MAP quinasa en cascada RAS es una vía que está implicado en muchas funciones celulares importantes tales como el crecimiento celular, división y diferenciación [32], y sus proteínas incluidas son frecuentemente mutado en el CCR. De todos los CRC, el 30-40% se encuentra mutado en el
KRAS
gen y 5-15% en el
BRAF
de genes [21], [33]. Estas dos mutaciones se cree que son mutuamente excluyentes en el CCR [21], [34], y ambos están asociados con un mal pronóstico de los pacientes [21], [35] - [37]. A pesar de que están involucrados en la misma vía, podemos ver que
KRAS
y
BRAF mutado
CRC tener diferentes apariencias morfológicas. Es interesante especular que la asociación de
BRAF mutación
con la expresión de Sox2 podría explicar parte de esa diferencia morfológica. Continuamos para analizar la correlación de BRAF y la expresión de Sox2 en nuestro
in vitro
sistema de cultivo celular in. De hecho, se encontró que la expresión de Sox2 que se upregulated en las células que expresan el BRAF
V600E constitutivamente activa. Además, mediante el bloqueo de BRAF señalización corriente abajo, SOX2 endógeno así como la expresión de Sox2 inducida por BRAF
V600E se disminuyó, lo que demuestra que la expresión de Sox2 se regula al menos en parte, por la vía de BRAF /MEK bien caracterizado. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que muestra que la expresión de Sox2 está regulada por la señalización de BRAF. Otro hallazgo interesante fue que el efecto negativo en el pronóstico de la expresión de Sox2 se restringió a
BRAF
pacientes mutados, lo que indica que es la expresión de Sox2 en combinación con
BRAF
mutación que contribuye principalmente al mal pronóstico .
es bien sabido que la expresión aberrante de los receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) puede conducir la progresión del tumor [23], [24]. La familia FGFR se compone de cuatro genes, y se ha demostrado que al menos el elemento
FGFR3
gen está regulada por SOX2 en CRC [7]. Nuestra línea de células que sobreexpresan Sox2, Caco2-Sox2, tenía la expresión de dos veces más alta FGFR1 como células Caco2, lo que implica que FGFR1 expresión puede ser regulada por Sox2. Otros han demostrado que la sobreexpresión de FGFR1 se encuentra en CRC [38] y que se correlaciona con la metástasis hepática [39]. Un estudio reciente también ha sugerido que la expresión elevada de ambos Sox2 y FGFR1 se correlaciona con mal pronóstico en el cáncer de pulmón de células pequeñas [40]. En conjunto, estos hallazgos sugieren que SOX2 en parte a través de la regulación positiva de FGFR1 podría mejorar distante propagación de las células tumorales en el hígado, lo que provoca una supervivencia del paciente más pobre. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para revelar el papel y el mecanismo de Sox2 y FGFR1 en el CCR.
En conclusión, este estudio muestra que la expresión de Sox2 se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes con CRC y se identifica por primera vez que la expresión de Sox2 en parte, está regulada por BRAF. Estos resultados, en combinación con la correlación observada entre la positividad de Sox2 en tanto tumor primario y la metástasis correspondiente, sugieren que las células tumorales positivas SOX2 tienen una mayor capacidad para producir metástasis.
Apoyo a la Información
Figura S1. .
Transfección con éxito de
V600E BRAF-pMCEF o pcDNA3-KRAS
G12V en la línea celular de cáncer de colon Caco2
doi: 10.1371 /journal.pone.0101957.s001 gratis (PDF)
Figura S2.
células Caco2-SOX2 tienen una expresión Sox2 aumento tanto en ARNm y proteínas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0101957.s002 gratis (PDF)
Reconocimientos
los autores agradecen a la Sra Kerstin Näslund, Departamento de Biociencias médicos, Patología, Universidad de Umeå, por su habilidad de asistencia técnica y Anna Dahlin para la realización de la condición n CIMP analiza.