Extracto
La incidencia y mortalidad del cáncer colorrectal (CCR) es más alta en los afroamericanos (AA) que otros grupos étnicos Dentro de los EE.UU, pero razones de las disparidades son desconocidos. Se realizó perfiles de expresión génica de los CCR esporádicos de los AA vs estadounidenses de origen europeo (AE) para evaluar la contribución a las disparidades de CRC. Se evaluó la expresión génica de 43 AA y 43 tumores EA CRC emparejados por fase y 40 emparejan colorrectal tejidos normales usando las matrices de todo el genoma humano Agilent 4x44K de ADNc. Gene y vía de análisis se realizaron utilizando Importancia Análisis de Microarreglos (SAM), la validación cruzada de diez veces, y Ingenuity Pathway Analysis (IPA). SAM reveló que 95 genes fueron expresados diferencialmente entre AA y los pacientes de EA a una tasa de falso descubrimiento de ≤5%. El uso de IPA se determinó que la mayoría de las asociaciones más prominentes de la enfermedad y de la vía de los genes expresados diferencialmente estaban relacionadas con la inflamación y la respuesta inmune. Diez veces la validación cruzada demostró que después de 10 genes puede predecir el origen étnico con una precisión del 94%: CRYBB2, PSPH, ADAL, VSIG10L, C17orf81, ANKRD36B, ZNF835, ARHGAP6, TRNT1 y WDR8. La expresión de estos 10 genes fue validado por QRT-PCR en un conjunto de pruebas independientes de 28 pacientes (10 AA, 18 EA). Nuestros resultados son los primeros en implicar a la expresión diferencial de genes en las disparidades raciales y CRC indican diferencia importante en la inflamación CRC entre AA y los pacientes de EA. Las diferencias en la susceptibilidad a la inflamación apoyar la existencia de microambientes tumorales distintas en estas dos poblaciones de pacientes
Visto:. Jovov B, Araujo Pérez-M, Sigel CS, Stratford JK, McCoy AN, Yeh JJ, et al. (2012) Expresión diferencial de genes entre afroamericanos y americanos cáncer colorrectal Los pacientes europeos. PLoS ONE 7 (1): e30168. doi: 10.1371 /journal.pone.0030168
Editor: Hassan Ashktorab, Howard University, Estados Unidos de América
Recibido: 30 Marzo, 2011; Aceptado: 15 de diciembre de 2011; Publicado: 19 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Jovov et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio recibió el apoyo de subvenciones para gastrointestinal Especializada Programa de Investigación de Excelencia (SPORE GI, P50 106991) y por la Universidad de Carolina del Norte, del Centro para la Biología y la enfermedad gastrointestinal (CGIBD, P30 DK 34987). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo el cáncer gastrointestinal más común en los Estados Unidos, a pesar de las recientes mejoras en el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad. Las tasas de incidencia y mortalidad de CRC para los afroamericanos (AA) son mayores que en la población general EE.UU. [1], [2]. Muchas investigaciones epidemiológicas y genéticas se han centrado en los AA [3], [4], [5], [6] con el objetivo de descifrar las razones de esas diferencias. Considerando que no se puede descartar la contribución de los factores socioeconómicos, como una etapa más avanzada de la enfermedad en el diagnóstico en los AA, otros factores biológicos también contribuyen a la progresión del cáncer de colon [4]; [7]. Sin embargo, una base biológica para la existencia de un CRC más agresivo en los pacientes afroamericanos que queda por esclarecer aún más. La inestabilidad genómica es una característica crucial en el desarrollo de tumores y hay al menos 3 rutas distintas en CRC patogénesis: inestabilidad cromosómica (CIN), la inestabilidad de microsatélites (MSI), y las vías de la isla CpG methylator fenotipo (CIMP) [8], [9]. Cualquiera o todas estas vías pueden contribuir a una biología CRC más agresivo en los afroamericanos. Recientes estudios de asociación de genoma completo en el CCR han demostrado no sólo una fuerte evidencia de polimorfismo de un solo nucleótido común asociación (SNP) en un número de genes y regiones cromosómicas, sino también la heterogeneidad genética en asociación CRC en los AA en comparación con EA [4], [10] , [11], [12], [13]. Diferente incidencia de MSI y diferentes niveles de metilación de genes funcionalmente muy relevantes también fueron reportados como posibles factores de CRC disparidades raciales [8], [14], [15].
La hipótesis de que los perfiles de expresión génica de CCR en pacientes afroamericanos y europeo-americanos pueden revelar diferencias biológicas entre las dos poblaciones que podrían explicar el fenotipo más agresivo del cáncer en los afroamericanos. Por lo tanto, hemos realizado en todo el genoma de perfiles de expresión de genes en una amplia serie de muestras tumorales que se aparearon por variables clínicas seleccionadas. Analizamos nuestros resultados en los niveles de genes y las vías para identificar diferencias clave en la biología del tumor entre los pacientes afro-americano y europeo-americanos.
Métodos
Los pacientes
Ciento catorce tumores (86 incluidos en el análisis original y 28 para el estudio de validación) y 40 tejidos normales de pacientes con CRC identificados de-se obtuvieron de la Junta de Investigación Institucional (IRB) aprobó Universidad de Carolina del Norte (UNC) Servicio de Adquisiciones de tejido después de la Escuela de Medicina de UNC IRB aprobación para este estudio. Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes. Se recogieron todas las muestras entre 1999 y 2008 en el momento de la operación y se congelaron en nitrógeno líquido. Se excluyeron los pacientes con diagnóstico de poliposis adenomatosa familiar y hereditario no asociado a poliposis CRC. se disponía de datos identificados-De entre ellos la raza, tumor, nodo y la metástasis (TNM), el grado o la diferenciación, estado de los márgenes, y la supervivencia de la mayoría de los pacientes.
Aislamiento de ARN y la hibridación de microarrays
Todo el aislamiento de ARN y la hibridación se realizó en Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) de todo el genoma humano 4X44 K microarrays de ADN en la UNC. ARN fue extraído de muestras tumorales congeladas instantáneamente utilizando macrodissected Todos los kits de preparación (Qiagen, Valencia, CA) y se cuantificó mediante espectrofotometría Nanodrop (ThermoScientific, Wilmington, DE). la calidad del ARN se evaluó con el uso de la Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). RNA fue seleccionado para la hibridación utilizando el número de la integridad del ARN y mediante la inspección de los 18S y 28S ARN ribosomal. Se seleccionó similares calidad del ARN a través de muestras. Un microgramo de RNA se utilizó como molde para la preparación de ADNc antes de la hibridación a todo Agilent 4X44 K arrays genoma humano. cDNA se marcó con Cy5-dUTP y un control de referencia (Stratagene, número de catálogo 740000; Agilent Technologies, Santa Clara, CA; [16], fue marcado con Cy3-dUTP utilizando el kit de amplificación de Agilent entrada baja ARN lineal y se hibridaron durante la noche a 65 ° C a Agilent 4X44 K enteros matrices genoma humano. Las matrices fueron lavadas y escaneadas usando un escáner de Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA):.
Todos los microarrays de datos están en forma compatible con MIAME y crudo y procesado de datos tiene sido depositado en la Expresión génica Omnibus (GEO); véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, número de acceso:. GSE28000
microarrays y el análisis estadístico
todos los datos de la matriz se normalizaron mediante la normalización LOWESS. los datos fueron excluidos por genes con mala calidad del terreno o genes que no tienen una intensidad media mayor que 10 para uno de los dos canales (verde y rojo) en al menos 70% de los experimentos. la relación de log2 de la intensidad de rojo medio en intensidad verde media se calculó para cada gen seguido de LOWESS normalización [17]. Los datos faltantes se imputaron mediante la imputación k-vecinos más cercanos (KNN) con k = 10 [18]. Los genes que fueron significativamente arriba o hacia abajo reguladas fueron identificados mediante análisis de la importancia microarrays (SAM) [19]. SAM asigna una puntuación a cada gen sobre la base de un cambio en la expresión génica en relación con la desviación estándar de mediciones repetidas. Para los genes con puntuaciones superiores a un umbral ajustable, SAM utiliza permutaciones de las repetidas mediciones para estimar el porcentaje de genes identificados por casualidad - la tasa de falso descubrimiento (FDR). Se establecieron los parámetros de análisis (delta) para dar lugar a FDR≤5%.
Red y la ontología de genes análisis
genes expresados diferencialmente fueron investigados por la red y la interrelación funcional de genes mediante análisis Ingenuity Pathways (IPA) software (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com;. [20] IPA analiza el conjunto de genes de entrada para identificar las redes mediante el uso de Ingenuity Pathways Knowledge Base para las interacciones entre los genes identificados 'Focus', en este estudio, los genes expresados diferencialmente entre AA y EA y conocidos e hipotéticos genes que interactúan almacenados en la base de conocimientos en el software IPA se utilizó para generar un conjunto de redes con un tamaño máximo de red de 35 genes /proteínas. las redes se muestran gráficamente como productos de genes /genes ( "nodos") y las relaciones biológicas entre los nodos ( 'bordes'). Todos los bordes son de información canónica almacenado en el ingenio Pathways Knowledge Base. Además, IPA calcula una puntuación para cada red de acuerdo con el ajuste del conjunto de genes importantes del usuario. La puntuación indica la probabilidad de que los genes de selección en una red de base de conocimiento de Ingenuity se encuentran juntos debido al azar. Una puntuación de 3, ya que el punto de corte para la identificación de las redes de genes, indica que sólo hay una posibilidad de que los genes 1/1000 enfoque que se muestran en una red se deben al azar aleatorio. Por lo tanto, una puntuación de 3 o más indica un nivel de confianza del 99,9% para excluir el azar.
diez veces la validación cruzada (Ten-f-CV)
Ten-f-CV análisis [ ,,,0],21] fue utilizado para seleccionar más pequeño conjunto representativo de los genes para el estudio de validación de QRT-PCR. Usando Diez-f-CV análisis se identificaron 10 genes que pueden predecir el origen étnico del paciente a la que la matriz se realiza con una tasa de error del 6%, lo que sugiere que estos 10 genes son representativos de toda la lista de genes.
cuantitativo PCR en tiempo real
La validación de resultados de microarrays se realizó en 28 pacientes con CRC (10 AA y 18 EA). Diez genes expresados diferencialmente (identificados por SAM y seleccionados por el método de Diez-f-CV) fueron validados por QRT-PCR. El gen de la sintasa hidroximetilbilano (HMBS) sirvió como la limpieza de genes [22]. QRT-PCR se realizó por duplicado usando ensayos de expresión de genes SYBR Green (Applied Biosystems, Forester City, CA), que incluyen imprimación pre-optimizado conjuntos específicos para los genes sido validada [23]. Los genes validados fueron: Cristalina, beta B2 (CRYBB2), homólogo fosfoserina fosfatasa (PSPH), adenosina deaminasa similar (ADAL), V-set y el dominio de inmunoglobulina que contiene 10 como (VSIG10L), Cromosoma 17 marco de lectura abierto 81 (C17orf81) , anquirina repetir dominio 36B (ANKRD36B). El zinc proteína de dedos 83 (ZNF83), Rho GTPasa activación de la proteína 6 (ARHGAP6), WD repetición de dominio 8 (WDR8), ARNt nucleotidyl transferasa, CCA-adición, 1 (TRNT1), y HMBS. Los datos fueron recolectados a través de ABI PRISM 7500 secuencia sistema de detección (Applied Biosystems, Foster City, CA). QRT-PCR datos para cada muestra se normalizó el uso de la expresión de los genes HMBS limpieza. Los gráficos se prepararon a partir de datos normalizado en relación con HMBS. El análisis estadístico de los datos se realizó con una de dos caras
t-test
o con una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de dos lados, si los datos de expresión no seguían una distribución normal.
Resultados
h3> identificación de genes expresados diferencialmente entre AA y EA CRC pacientes
características de la población de pacientes de 43 AA y 43 pacientes de EA
La comparación de los perfiles de expresión génica de los tumores y AA EA utilizando SAM reveladas 95 transcripciones de genes que se expresan diferencialmente entre los dos grupos a los FDR de ≤5%. Cincuenta y ocho fueron de genes regulados (Tabla 2) y 37 abajo reguladas (Tabla 3) en el tumor de los AA. Utilizamos Ingenuity Pathway Analysis para evaluar las asociaciones de la enfermedad y de la vía de estos 95 genes que son expresados diferencialmente en los tumores CRC por raza. El análisis reveló asociación con la enfermedad asociaciones de genes expresados diferencialmente con vías genéticas que están vinculados a la respuesta inflamatoria, enfermedad sistema hepático, trastornos del desarrollo, trastornos genéticos y las enfermedades neurológicas (Tabla S1). Los seis mejores vías asociadas para genes expresados diferencialmente se muestran en la Fig. 1. Tres de estos seis vías están relacionados con la respuesta inflamatoria e inmune. genes expresados diferencialmente en las cinco redes con mayor puntuación se muestran en la Tabla 4. Principales funciones de la red asociada de los genes expresados de manera diferente fueron los siguientes: 1) lesiones del organismo y las anomalías, la expresión génica, el desarrollo celular 2) metabolismo de los lípidos, la bioquímica pequeña molécula, el transporte molecular 3) el montaje y la organización celular, el desarrollo de órganos, el metabolismo de hidratos de carbono 4) la presentación del antígeno y la respuesta inflamatoria, movimiento celular 5) comportamiento, el desarrollo del sistema digestivo y la función, el desarrollo y la función del sistema endocrino. Una de estas redes (red 4; de presentación de antígeno y la respuesta inflamatoria) se representa gráficamente en la Fig. 2. Siete de los nueve genes en esta red fueron hasta reguladas en pacientes AA (HLA-DQB1, IL33, Pak2, PROKR1, saa2, TLR4, ZNF234), y dos genes se redujeron reguladas (DHX58, IL27).
eje y es una indicación inversa de p-valor o importancia. La línea marca el umbral de p = 0,05. (Tenga en cuenta que 3 de 6 vías principales que se muestran están relacionados con la inflamación y la respuesta inmune).
Red símbolos se asignan para hasta reguladas y verde para reguladas por los genes. forma de nodo se corresponde con el papel funcional de las moléculas, como se muestra en la leyenda. interacciones directas o indirectas se muestran mediante líneas completas o discontinuas.
También se realizó el análisis SAM utilizando tejidos de colon no tumorales de pacientes AA y EA y no ver la expresión diferencial de genes (datos no mostrados), lo que sugiere que los cambios que hemos identificado son microambiente tumoral específica.
validación de los resultados de microarrays
con el fin de seleccionar un grupo representativo de genes para la validación de QRT-PCR los genes de la expresados diferencialmente entre AA y los pacientes de EA CRC, se realizó a 10 veces el análisis de validación cruzada que resultó en la selección de los siguientes diez genes: CRYBB2, PSPH, ADAL, VSIG10L, C17orf81, ANKRD36B, ZNF835, ARHGAP6, TRNT1 y WDR8.
la expresión de estos diez genes fue validado por QRT-PCR en un conjunto de pruebas independientes de 28 pacientes con CRC (10 AA y 18 EA). Los resultados QRT-PCR se muestran en la Fig. 3. Dos de los 10 genes expresados diferencialmente fueron reguladas en AA vs pacientes EA CRC; CRYBB2, p = 0,0004 y PHSP, p = 0,001 (Fig 3;. Panel A.). Ocho fueron las reguladas en AA vs pacientes EA CRC; VSIG10L, p = 0,015; C17orf81, p = 0,032; WDR8, p = 0,002; TRNT1, p = 0,004; ANKRD36B, p = 0,044; ARHGAP6, p = 0,049; ADAL, p = 0,074; ZNF83, p = 0,11; (Fig 3;. Panel B.). La dirección del cambio (hacia arriba o hacia abajo la regulación) de los genes de QRT-PCR validados estaba de acuerdo con los resultados de SAM. Ocho de diez genes en el estudio de validación de QRT-PCR alcanzó un nivel estadísticamente significativo (p & lt; 0,05; CRYBB2, PSPH, C17orf81, ANKRD36B, VSIG10L, WDR8, TRNT1 y ARHGAP6).
Panel A. Expresión de dos hasta reguladas genes en pacientes con cáncer colorrectal afroamericanos: CRYBB2, PSPH. Panel B. Expresión de ocho reguladas por los genes en pacientes con cáncer colorrectal afroamericanos: ARHGAP6, VSIG10L, C17orf81, ZNF83, ANKRD36B, ADAL, WDE8 y TNRT1. Los puntos son valores relativos de Ct para las muestras individuales; líneas horizontales son valores promedio para el conjunto de la muestra. Los genes expresados diferencialmente de manera significativa (p & lt; 0,05) entre los afro-estadounidense (n = 10) frente a Europa y Estados Unidos (n = 18) CRC tumores son etiquetados por una estrella. Los gráficos se prepararon a partir de genes de datos normalizados expresión en relación con el servicio de limpieza (HMBS) de genes.
Discusión
Las causas de la disparidad que existe entre CRC pacientes AA y EA permanecen para ser totalmente dilucidado. Aunque la mayor parte de la investigación sobre esta disparidad se ha centrado en los factores socioeconómicos, los últimos hallazgos apoyan firmemente el papel de los factores genéticos y biológicos. se informó de diferencias genéticas entre AA y los pacientes de EA CRC para la asociación de SNP, por incidencia de MSI y el nivel de metilación de genes [4], [14], [15]. Cualquiera de estas diferencias pueden resultar en la expresión génica diferencial entre AA y los pacientes EA CRC. En este estudio se analizaron los perfiles de expresión génica de los 86 tumores de 43 AA y 43 pacientes de EA. Se identificaron diferencias significativas en la expresión de genes relacionados con la respuesta inmune y la inflamación dentro del tumor micro-entorno entre estos dos grupos. Esta interpretación fue apoyada tanto por asociación con la enfermedad y analiza vía. La mayoría de los genes relacionados con la inmunidad tuvieron mayor expresión en los tumores de pacientes afroamericanos que en los pacientes de Europa y Estados Unidos. Aunque de forma preliminar, estos resultados son nuevos y podrían tener implicaciones para la terapia del cáncer. Desde el presente estudio, no sabemos por qué CRC de pacientes afroamericanos tendría un perfil inmunológico diferente de los tumores de pacientes Europea-americanos. Nuestra hipótesis es que las causas de estas diferencias son multifactoriales. La inflamación crónica se piensa que es un factor causal en la carcinogénesis de colon [24], [25]. Se demostró que una firma de respuesta inmune en el hígado de pacientes con cáncer predice la metástasis y la recurrencia de carcinoma hepatocelular [26]. Por lo tanto, los estudios futuros deben evaluar si el perfil inmunológico de CCR en pacientes afroamericanos es un factor predisponente para la progresión tumoral y la metástasis. Investigaciones previas identificaron una firma tumor de dos genes (CRYBB2 y PSPHL) que diferenciaba con precisión entre los pacientes con cáncer de próstata afroamericanos y europeo-americanos [27]. Esos dos genes también fueron expresados diferencialmente entre pacientes afro-americanos y europeos estadounidenses con cáncer de mama [28] En este estudio hemos encontrado sobre regulación de genes y CRYBB2 PSPH en el CCR de los pacientes afroamericanos. Las mutaciones en el gen CRYBB2 también son responsables de la catarata familiar [29]. PSPHL es un homólogo de PSPH. Curiosamente, PSPH se encuentra en el cromosoma 7p15.2, una región cromosómica conocida por tener ganancia de función relacionada con el estadio del tumor avanzado en células no pequeñas adenocarcinoma de pulmón [30]. Se demostró que el aumento de expresión de PSPH en el cáncer de pulmón de células no pequeñas corresponde a la respuesta clínica al tratamiento con erlotinib [31]. Por lo tanto, es posible que el aumento de expresión de PSPH contribuye a CRC susceptibilidad en los AA y que los niveles de expresión PSPH pueden correlacionarse con la respuesta al tratamiento anti-EGFR. Estas posibilidades tendrán que ser probados en estudios futuros. Teniendo en cuenta abajo de los genes regulados en los AA encontramos una menor expresión del gen C17orf81. La regulación por disminución de este gen se asocia con el cáncer de colon [32], lo que sugiere que la menor expresión de este gen puede contribuir a la más agresiva CRC en los AA. Otros genes regulados hacia abajo en los AA incluyen: TRNT1 (involucra en el procesamiento del ARN; [33]); ARHGAP6 (promueve la remodelación de actina: [34]); WDR8 (facilita la formación de complejos multiproteicos: [35]). Teniendo en cuenta las funciones celulares de estos genes no es difícil imaginar cómo su expresión puede influir en la agresividad del CRC.
expresión de genes del genoma completo experimentos de análisis pueden ser propensos a conclusiones que son exclusivos para una población de pacientes seleccionados o son creados artificialmente por la tecnología aplicada. Para excluir la posibilidad de un artefacto, dos enfoques diferentes fueron usados para cruzar validar nuestros datos de expresión génica. En primer lugar, se compararon los resultados de los genes expresados diferencialmente entre 86 tumores y 40 tejidos no tumorales circundantes con los de un meta-análisis publicado de cinco CRC de expresión génica de datos en Oncomine [36], [37], [38], [ ,,,0],39], [40]; Tabla S2. Encontramos un muy buen acuerdo entre nuestros resultados y los resultados de los otros 5 metanálisis. De los 20 genes sobreexpresados en tumores de CRC a través de los 5 otros metanálisis (Oncomine; https://www.oncomine.org), también se encontraron 15 es significativamente hasta reguladas (FDR, & lt; 5%) en nuestro estudio. De los 20 genes expresados bajo en CRC tumores a través de los 5 otros metanálisis, 17 fueron significativamente las reguladas (FDR, & lt; 5%). En nuestro estudio
En segundo lugar, se validó la expresión de diez genes clave a través de QRT-PCR y diferencias confirmados en la expresión génica entre los CRC de los AA y EE para ocho de ellos.
en conclusión, el perfil de expresión génica de CRC corresponde a las diferencias en la biología del tumor entre los afroamericanos e pacientes Europea-americanos. Las implicaciones de estas diferencias en la agresividad y la respuesta al tratamiento de la enfermedad deben ser evaluados en estudios futuros.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Ingenuity Pathway Analysis de asociación de genes expresados diferencialmente con las principales funciones biológicas.
doi: 10.1371 /journal.pone.0030168.s001 gratis (DOCX)
Tabla S2.
Comparación de los 40 principales expresa de forma diferente genes en otros cinco estudios de microarrays CRC y este estudio.
doi: 10.1371 /journal.pone.0030168.s002 gratis (DOCX)