Extracto
Introducción
La herencia se estima que causa al menos el 20% del cáncer colorrectal. El subconjunto hereditario sin poliposis cáncer colorrectal se divide en el síndrome de Lynch y familiar colorrectal tipo de cáncer X (FCCTX) basada en la presencia de desajuste de reparación (MMR) defectos genéticos.
Aplicaciones
Hemos abordado la expresión génica firmas en el cáncer colorrectal asociado con el síndrome de Lynch y FCCTX con el objetivo de identificar genes candidatos y para trazar las vías pertinentes en la carcinogénesis colorrectal hereditario de señalización.
diseño experimental
el 18 k todo el genoma c- recocido mediada por ADN, la selección, la extensión y la ligadura (WG-DASL) de ensayo se aplicó a 123 cánceres colorrectales, incluyendo 39 tumores síndrome de Lynch y 37 FCCTX tumores. Los genes diana fueron validados técnicamente utilizando cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR) y la firma la expresión fue validado en conjuntos de datos independientes.
Resultados
Los cánceres colorrectales asociado con el síndrome de Lynch y mostraron FCCTX distintos perfiles de expresión génica, que por el análisis de la importancia microarrays (SAM) diferían en 2188 genes. vías funcionales implicados estaban relacionados con acoplado a proteína G señalización del receptor, la fosforilación oxidativa, y la función del ciclo celular y la mitosis. QRT-PCR verificó la expresión alterada de los genes seleccionados
NDUFA9, AXIN2, MYC, DNA2
y
H2afz
. Aplicación de la firma 2188-gen a conjuntos de datos independientes mostró fuerte correlación con el estado de MMR.
Conclusión
perfiles genéticos distintos y desregulación de las diferentes vías canónicas se aplican al síndrome de Lynch y FCCTX y objetivos clave en este documento pueden ser relevante para perseguir a las estrategias diagnósticas y terapéuticas refinados en el cáncer colorrectal hereditario
Visto:. Domínguez-Valentin M, Therkildsen C, Veerla S, M Jönsson, Bernstein I, Borg a, et al. (2013) Distintas firmas de expresión génica para el síndrome de Lynch y familiar de cáncer colorrectal Tipo X. PLoS ONE 8 (8): e71755. doi: 10.1371 /journal.pone.0071755
Editor: Ramón Andrade de Mello, Facultad de Medicina de la Universidad de Oporto, Portugal
Recibido: Abril 29, 2013; Aceptado: 2 Julio 2013; Publicado: 12 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Domínguez-Valentin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La danesa y el cáncer de Fondos de Suecia, desde el Consejo Sueco de Investigación, la Fundación Lundbeck, el fondo del cáncer Nilsson, el fondo del cáncer Kamprad y el hospital Universitario de Hvidovre, Dinamarca. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la herencia es un factor de riesgo importante para el cáncer colorrectal. La identificación de las personas y familias en mayor riesgo permite una vigilancia específica, que se ha demostrado para reducir la morbilidad y la mortalidad por cáncer colorrectal [1], [2]. el cáncer colorrectal hereditario sin poliposis (HNPCC) representa el 3-6% del cáncer colorrectal. El síndrome se clasifica clínicamente de acuerdo con los criterios de Amsterdam, que requieren al menos tres tipos de cáncer asociado con HNPCC, dos familiares de primer grado afectados y al menos un individuo diagnosticado antes de los 50 años [3], [4]. Entre un tercio y la mitad de las familias que cumplan con los criterios de Ámsterdam llevan reparación desajuste de la línea germinal (MMR) mutaciones genéticas en
MLH1, MSH2, MSH6
o
PMS2 Opiniones y se les conoce como tener Lynch síndrome [5] - [7]. El resto de las familias de origen genético aún no identificado muestran un predominio de cáncer colorrectal, pólipos adenomatosos frecuentes sincrónicas y metacrónicas y algunos tumores extracolonic y se conocen como familiar de cáncer colorrectal de tipo X (FCCTX) [8], [9]. En comparación con el síndrome de Lynch, los cánceres colorrectales vinculados a FCCTX se desarrollan más tarde, en su mayor parte se producen en el colon distal y menos a menudo muestran las características morfológicas linfocitos distintivos tumor infiltrante, pobre diferenciación y mucina producción características de los tumores síndrome de Lynch [8], [10], [11].
los datos sobre las características genéticas y los patrones de tumorigénicos FCCTX son escasos aunque los estudios genómicos han demostrado alteraciones en el número promedio de 6-8 contra copia con ganancias recurrentes de 7p, 7q, 8q, 13q, 20p y 20q y pérdidas de 17p, 18p y 18q [9], [12], [13]. Dos estudios han abordado los perfiles de expresión de genes y los patrones de mutación en los tumores FCCTX y han descrito similitudes entre FCCTX y esporádicas MMR tumores estables [14], [15]. En el cáncer colorrectal esporádico, MMR tumores defectuosos muestran distintos perfiles de expresión génica con regulación de genes inmunomoduladores, tales como chaperones, citoquinas y mediadores citotóxicos, genes de choque térmico, genes del complejo mayor de histocompatibilidad y los genes relacionados con la apoptosis [16] - [18] . Aplicamos la expresión génica global de perfiles a fin de delinear genes candidatos y la participación diferencial de las vías dentro de la subconjunto HNPCC de cáncer colorrectal hereditario con la comparación entre el cáncer colorrectal relacionado con el síndrome de Lynch y FCCTX.
Materiales y métodos
Declaración de Ética
El proyecto fue revisado éticamente en Copenhague, donde se le concedió una exención para la recogida de tejidos y los datos clínicos. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para su inclusión en el registro de HNPCC danesa durante las sesiones de asesoramiento genético. La aprobación ética para el estudio fue concedida por el Comité Científico y Ético en la región del capital de Copenhague, Dinamarca (HD-2007 a 0032).
Selección de la muestra y la extracción de RNA
El HNPCC danesa nacional registro se utilizó para identificar los cánceres colorrectales de los individuos con síndrome de Lynch y FCCTX. síndrome de Lynch se definió como familias /individuos con mutaciones de la línea germinal de genes MMR-predisponentes de la enfermedad (n = 16 en
MLH1
, n = 13 en
MSH2
y n = 10 en
MSH6
). Tinción inmunohistoquímica de proteínas MMR y el análisis de la inestabilidad de microsatélites (MSI) se realizaron como se describe anteriormente [11], [13]. FCCTX tumores fueron definidos como tumores que se desarrolló en las familias que cumplen los criterios de Amsterdam, pero no mostraron mutaciones de genes MMR-predisponentes de la enfermedad y habían conservado la función MMR. Se seleccionaron los cánceres colorrectales esporádicos para representar MMR dominio tumores deficientes de MMR y de individuos sin antecedentes familiares de cáncer. Los datos clínicos se resumen en la Tabla 1. En comparación con los tumores síndrome de Lynch, tumores FCCTX eran más a menudo se encuentran en el lado izquierdo del colon (p & lt; 0,00001, prueba exacta de Fisher) y mostraron diferenciación alto o moderado (p & lt; 0,00001, prueba exacta de los pescadores ). síndrome de Lynch y FCCTX no difirieron en cuanto a la edad de inicio (media 53 años frente a 58 años) o el estadio del tumor.
zonas tumorales no necróticas fueron la extracción de macro-diseccionado y el ARN se realizó a partir de tres 5 -
μ m
secciones de tejido incluido en parafina del tumor [11], [13] utilizando el kit de ARN de alta parafina pura (Roche, Castle Hill, Australia) según las instrucciones del fabricante. La concentración de ARN se determinó usando un espectrofotómetro NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) y las muestras de RNA produciendo suficiente (200 ng) con proporciones 260/280 & gt;. Se seleccionaron 1,8
perfiles de expresión génica
análisis de expresión génica se realizaron en el Centro de Genómica SCIBLU, Universidad de Lund, Suecia. El sistema de Illumina Bead-array (HumanWG-6 v4 Expresión BeadChip, Illumina) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el ARN total fue convertido a cDNA utilizando oligo-dT biotinilado
18 y nonamer azar cebadores. Dos oligonucleótidos de ensayo específicos fueron diseñados para interrogar a una única secuencia de 50 nt contiguos en cada ADNc. Cada uno de estos oligonucleótidos constaba de dos partes: un oligonucleótido corriente arriba específico (USO) que contiene una "secuencia génica específica y un 5 '3 secuencia de cebador universal PCR (P1), mientras que el oligonucleótido de aguas abajo específica (DSO) contenía un 5' gen específico de secuencia y una "secuencia diferente 3 universal de cebador de PCR (P2). Con este enfoque, un total de 24,526 oligonucleótidos pares (sondas) se diseñaron y se agruparon, que en conjunto constituyen el genoma completo (WG) piscina DASL ensayo (DAP), que corresponde a 18.626 genes únicos, basados en el contenido bien anotado derivado de la Nacional centro de Información sobre Biotecnología (NCBI) de base de datos de secuencias de referencia (Build 36.2, versión 22). A continuación, el DAP se recoció a los ADNc específicos, seguido de pasos de extensión y ligación enzimática, como se describe anteriormente [19]. productos ligados se amplificó por PCR y se marcaron con un cebador junto con Cy3 universal, después de lo cual los productos etiquetados de una sola cadena se precipitaron y se hibridaron a WG BeadChips de expresión génica como se describe anteriormente [20]. BeadChips fueron escaneadas en un lector de BeadArray ™ usando el software BeadScan (v4.2), durante el cual se leyeron las intensidades de fluorescencia y las imágenes extraídas.
Análisis de Datos
Los datos de expresión se cargan y se procesan en el GenomeStudio de software (Illumina, San Diego, CA). Los datos se normalizaron mediante la corrección de fondo, el método spline cúbico [21] y la escala de placa. características RefSeq con una detección
se utilizaron P
valor de ≤0.01 en al menos 80% de las muestras, dejando 9,218 características para su posterior análisis. Los datos se cargan en MeV v4 [22] donde fueron log2 transformado y centrado en la mediana en todos los ensayos. sin agrupación se realizó en el conjunto total de muestras CRC utilizando promedio de la agrupación vinculación con una correlación de Pearson como la similitud métrica. Se utilizó el análisis de la importancia microarrays (SAM) [23] para identificar los genes expresados diferencialmente de manera significativa con una tasa de falsos descubrimiento (FDR)
≤ página 5% [24]. están disponibles en el NCBI Expresión Génica Omnibus (GEO) (número de acceso GSE36335) los datos de expresión génica. vías biológicas se identificaron utilizando el software DAVID basado en la web con un FDR
≤ página 5% [25].
cuantitativa en tiempo real PCR con transcripción inversa (QRT-PCR)
QRT-PCR se utilizó para validar técnicamente aumento /disminución de la expresión de 5 genes relacionados con el cáncer con expresión diferencial entre los 4 subconjuntos de cáncer colorrectal. Se seleccionaron los genes para representar las principales vías desreguladas y los niveles de expresión fueron investigados en 3 muestras de cada subtipo. Los
rRNA18S
se utilizó como gen de referencia interna y muestra de colon normal como calibrador. cebadores específicos de genes y conjuntos de sonda TaqMan para cada gen se obtuvieron de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA). La transcripción reversa y PCR se realizó utilizando Quantitect kit de transcripción y la sonda kit de PCR, respectivamente (Qiagen, Heidelberg, Alemania) a revertir.
Validación de datos externos
La expresión genética hereditaria se validó mediante el GSE4554 datos fijados y los cuatro más grandes lotes de Genoma del cáncer Red Atlas (TCGA) RNAseqv2 [26], [27]. Con el fin de parecerse a los datos de microarrays, los valores RPKM del TCGA eran cuantil normalizado, un desvío de 32, se añadió, un tope de 65.000, y los genes estaban centrados. Posteriormente los datos se ajustó para la variable de proceso por lotes. Todos los datos se importaron en MeV v4, log2 transformadas, los genes eran centrado en la mediana en todos los ensayos y se eliminaron los 50% menos que varían genes. Agrupación jerárquica sin supervisión se realizó como se ha descrito anteriormente. Un centroide expresión génica fue construido por el promedio de los valores de expresión de las muestras en el síndrome de Lynch y FCCTX para cada gen con el fin de establecer un clasificador de firma para la clasificación centroide más cercano. Una muestra de los conjuntos de datos externos fue asignado a uno de los dos subconjuntos hereditarios sobre la base de la correlación de Pearson máximo de su expresión centroide a los valores de los centroides hereditarios.
Análisis estadístico
asociación clínica (la localización del tumor , la diferenciación, la edad de inicio y la etapa) en el síndrome de Lynch y FCCTX se determinaron utilizando la prueba exacta de Fisher (con una significación establecida para
P Hotel & lt; 0,05). Los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico IBM SPSS Statistics 20 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.).
Resultados
análisis de agrupación jerárquica sin supervisión en toda la serie (incluyendo el síndrome de Lynch 39 tumores, 37, 21 FCCTX tumores tumores esporádicos con dominio MMR y 26 tumores esporádicos con deficiencia de MMR) identificaron dos subgrupos principales relacionados con el estado de MMR (Figura S1). La firma intrínseca MMR era fuerte con 3873 genes expresados diferencialmente, de los cuales 2.159 (56%) son regulados hasta en los tumores defectuosos MMR y se relacionaron con 5 vías de señalización (Tabla S1).
En el tumor hereditario subconjunto, SAM análisis identificó 2188 genes expresados diferencialmente entre los tumores FCCTX y síndrome de Lynch (Figura 1). En los tumores FCCTX, la vía de señalización de la proteína G acoplada fue hasta reguladas (FDR = 0,6%), mientras que los tumores síndrome de Lynch mostraron sobre regulación de 2 vías relacionadas con el ciclo celular y la mitosis (FDR = 1,4%) y la fosforilación oxidativa (FDR = 3,5%) (Tabla 2).
la figura representa la parte superior-360 genes expresados diferencialmente. Las muestras se disponen a lo largo de los tumores en el eje x y muestran FCCTX (verde) y los tumores del síndrome de Lynch (Azules).
Los perfiles de expresión génica de los tumores FCCTX estaban estrechamente relacionados con los de triple vírica esporádica cánceres colorrectales Capaz con genes implicados en la modificación de los ácidos peptidil-amino, ligado a enzimas de señalización del receptor de la proteína y la regulación del crecimiento. Del mismo modo, el síndrome de Lynch y tumores esporádicos defectuosos MMR comparten genes implicados en la progresión del ciclo celular y la respuesta inmune. Comparación entre FCCTX y tumores esporádicos MMR dominio reveladas 4 genes expresados diferencialmente, mientras que la comparación entre FCCTX y esporádicos tumores deficientes de MMR identificado 3906 genes expresados diferencialmente. tumores síndrome de Lynch diferían de los tumores esporádicos estables MMR por 415 genes expresados diferencialmente y de los tumores esporádicos con deficiencia de MMR por 91 genes. Dentro de los tumores esporádicos, 1384 genes MMR diferían tumores deficientes y no deficientes.
Los perfiles genéticos fueron validados en conjuntos de datos independientes, es decir, el GSE4554 (Affymetrix microarrays) y el TCGA (secuenciación de ARN) [26], [27]. Ambos conjuntos de datos comprenden principalmente casos colorrectales esporádicos, incluyendo 51 MMR tumores estables y 33 MMR tumores defectuosos en el conjunto de datos GSE4554 y 91 triple vírica MMR estable, 19 y 28 tumores defectuosos MMR-bajos estables en el conjunto de datos TCGA. Agrupación jerárquica sin supervisión en base a nuestra firma 2188 genes identificados por nosotros, resultó en dos grandes grupos relacionados con el estado de MMR. La firma hereditaria clasificó correctamente el 82% y el 80% de los tumores MMR estables como FCCTX y el 100% y el 94% de los tumores defectuosos MMR como el síndrome de Lynch, respectivamente (Figura 2)
.
a) La agrupación basa en GSE4554 y b) la agrupación en base a los cuatro mayores lotes de los conjuntos de datos TCGA RNAseqv2. tumores MMR dominio (verde), tumores de microsatélites de bajo (azul) y los tumores deficientes de MMR (rojo) a lo largo del eje x.
validación técnica basada en QRT-PCR se realizó con 5 relacionada con el cáncer genes que representan las vías desreguladas observados en los tumores MMR estables y deficientes, respectivamente (Figura 3). El aumento de la expresión de los resultados confirmados
MYC
y
AXIN2 Hoteles en tumores FCCTX, disminución de la expresión de
NDUFA9 Hoteles en tumores FCCTX y en tumores esporádicos con dominio triple vírica y el aumento de la expresión de
Hoteles en H2afz tumores deficientes de MMR. No se observaron diferencias importantes respecto a
DNA2
.
Expresión diferencial de
MYC, NDUFA9
,
H2afz
,
AXIN2
, y
DNA2
se hizo para 12 muestras representativas (3 de cada grupo) y las relaciones de QRT-PCR se normalizaron a rRNA18S y centrado en la mediana.
Discusión
Dentro de la HNPCC subconjunto de cáncer colorrectal hereditario, que demostró claramente diferentes firmas de expresión génica en tumores síndrome FCCTX y Lynch, que se diferencian por 2188 genes. Sobre la base de estas diferencias en la expresión de genes, nuestros datos sugieren que la condición de MMR influye fuertemente en las firmas genéticas, también dentro de las familias fenotípicamente similares, que está de acuerdo con estudios anteriores sobre el cáncer colorrectal esporádico [16] - [18], [27], [36] . Los perfiles síndrome FCCTX y Lynch diferían en 3 vías principales relacionados con el cáncer, principalmente relacionadas con el ciclo celular andmitosis progresión, la fosforilación oxidativa y la proteína de señalización de receptores acoplados G, que se han correlacionado con la carcinogénesis colorrectal [18], [28], [29] , [36].
los tumores FCCTX mostraron sobre regulación de los genes 1059, varios (n = 16) de los cuales estaban relacionados con el G-proteína de la ruta del receptor acoplado (Tabla 2). Un objetivo candidato en el presente documento incluye el
GNAS
gen, que codifica para el G
α-subunidad, y se encuentra en la región 20q13.32 que se ha encontrado que se pueden obtener en los tumores FCCTX [9], [12], [13]. La activación de mutaciones en
GNAS
se han descrito en el CRC y se sugieren para promover la tumorigénesis a través de la activación de la Wnt y ERK1 /2 señalización MAPK vías [28], [29]. El mecanismo tumorigénico potencial es desconocido y la mutación de punto caliente
GNAS
c.601G & gt; T no se ha observado en tumores FCCTX [12]. También otros genes candidatos implicados en la proliferación y la migración, por ejemplo,
CDH26, SRC
y
¿Cuáles son ASIP localizado en 20q [30], [31]. Los tumores FCCTX también mostraron sobre regulación de
PTGER1, España que codifica para el receptor EP1 que pueden promover la proliferación y el desarrollo del tumor colorrectal a través de una función alterada de la prostaglandina E2 (PGE
2) [32] - [34 ].
tumores síndrome de Lynch mostraron sobre regulación de los genes 1129, por ejemplo, genes implicados en G
transición 1 /S (
CCNE
,
CCNH
,
E2F2
y
CDK2
), la replicación del ADN (
CDC45
,
RPA1
,
RFC5
,
MCM4
y
POLD3
) y la organización cromosómica y la mitosis (
CCNB2
,
MLF1IP
,
CASC5
,
KIF2C
y
PLK4
), que está en consonancia con los resultados anteriores (Tabla 2) [16], [18], [35], [36]. Sobre regulación de ejemplo
WEE1
,
CDKN1A
y
FANCD2
también se observó en nuestro estudio y también han sido reportados por otros investigadores, lo que puede sugerir la participación de la maquinaria del ciclo celular puesto de control [37 ], [38]. La sobreexpresión de proteínas de control han sido previamente asociado con el síndrome de Lynch y la derogación de la maquinaria punto de control se ha demostrado que sensibilizar a las células tumorales deficientes de MMR hacia la quimioterapia [39], [40]. También genes implicados en la vía de la fosforilación oxidativa, por ejemplo, la ATP sintasa genes de las subunidades y complejos I y III subunidad genes se encontraban entre los regulados hasta en tumores síndrome de Lynch. Baja regulación de la ATP sintasa genes subnit y complejo I, los genes III y V se han correlacionado con el cáncer colorrectal metastásico y pueden explicar el desarrollo del tumor más agresivo y de mal pronóstico observado en MMR tumores con dominio [11], [18], [41] .
en el cáncer colorrectal, el estado de MMR es un importante discriminador relacionada con distintivamente diferentes perfiles de expresión génica, que se apoya en los 3873 genes expresados diferencialmente en nuestra serie de tumores deficientes de MMR y con dominio [15], [16] , [27]. Se observó la importancia de la condición de MMR también cuando se aplicó la firma 2188-gen, capaz de discriminar entre el síndrome de Lynch y FCCTX a dos conjuntos de datos independientes que contienen principalmente tumores esporádicos. La firma definida correctamente 80-82% de la triple vírica y el dominio del 94-100% de los tumores deficientes de MMR (Figura 2). Varias proteínas de choque térmico y los genes de respuesta inmune (Tabla S1) fueron reguladas en los tumores defectuosos MMR, que apoya la implicación de los mecanismos de la respuesta inmune, independientemente de si el tumor fue causado por la línea germinal o somática de genes de inactivación MMR [16] - [ ,,,0],18], [42], [43]. En esporádicos, así como tumores hereditarios que dominan el MMR más genes de la
Wnt de señalización
fueron hasta reguladas, que encaja muy bien con su papel central en la tumorigénesis colorrectal (Tabla S1) [44], [45].
En conclusión, el cáncer colorrectal hereditario dentro de los perfiles genéticos HNPCC subconjunto espectáculo distict con 2188 genes expresados diferencialmente entre el síndrome de Lynch y FCCTX. Estos datos identificar los genes y las vías pertinentes para proseguir refinados para el diagnóstico y la terapéutica en el cáncer colorrectal hereditario.
Apoyo a la Información
Figura S1.
sin supervisión agrupación jerárquica de todo el conjunto de datos. El dendograma muestra la agrupación espontánea de 123 cánceres colorrectales en dos grandes grupos relacionados con el estado de MMR. tumores MMR dominio (verde), incluyendo tumores FCCTX y tumores esporádicos con dominio MMR y tumores deficientes de MMR (azul), incluyendo tumores síndrome de Lynch y tumores esporádicos con deficiencia de MMR
doi: 10.1371. /journal.pone.0071755.s001
(TIF)
Tabla S1.
Vías de señalización reguladas en tumores deficientes de MMR y MMR dominio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0071755.s002 gratis (XLS)
Reconocimientos
gracias Eva Rambech y Martin Lauss, Departamento de Oncología, Instituto de Ciencias clínicas, Universidad de Lund y Anja Nissen, Centro de Investigación clínica, hospital Universitario de Copenhague, Hvidovre en busca de ayuda y asistencia técnica y Sabrina Da Silva, Departamento de Medicina y Oncología, Sir Mortimer B , Davis-Jewish general hospital, Universidad McGill, Montreal, Canadá por el apoyo estadístico.