Extracto
Antecedentes
epigenética y la alteración genética juega un papel importante a la desarrollo de carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC). El consumo de tabaco (fumar /mascar) y el virus del papiloma humano (VPH) también se asocian con un aumento del riesgo de CECC. la hipermetilación del promotor de los genes de supresión tumoral está relacionada con la inactivación de la transcripción y la pérdida de la expresión génica. Investigamos alteración epigenética (metilación del promotor de los genes relacionados con el tumor /loci) en los tejidos tumorales en el contexto de la alteración genética, infección viral, y la exposición al tabaco y el estado de supervivencia.
Metodología
El estudio incluye 116 muestras de tejido tumoral (71 y 45 tejidos normales) de la población indígena del noreste. Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación (MSP) para determinar el estado de metilación de 10 genes relacionados con el tumor /loci (
p16
,
DAPK
,
RASSF1
,
BRAC1
,
GSTP1
,
ECAD
,
MLH1
,
MINT1
,
MINT2
y
MINT31
). Polimorfismos de
CYP1A1
,
GST gratis (
M1 Hotel & amp;
T1
),
XRCC1
y
XRCC2
genes fueron estudiados mediante el uso de la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP-PCR) y PCR múltiple, respectivamente.
Principales conclusiones
análisis de agrupación jerárquica sin supervisión basada en el patrón de metilación habían identificado dos grupos tumorales, que difieren de manera significativa por la isla CpG methylator fenotipo (CIMP), el tabaco,
GSTM1
,
CYP1A1
, el VPH y el estado de supervivencia. El análisis de metilación de genes /loci individualmente, hemos encontrado significativo metilación más alta de
DAPK
,
RASSF1
,
p16 Opiniones y
MINT31
genes (
P =
0,031, 0,013, 0,031 y 0,015, respectivamente) en HPV (+) los casos en comparación con el HPV (-). Por otra parte, un CIMP-alta y el Grupo 1 característica también se asoció con una baja supervivencia.
Conclusiones
perfiles de metilación del promotor que reflejan una correlación con el tabaco, el VPH, el estado de la supervivencia y la alteración genética y puede actuar como un marcador para determinar los subtipos y evolución de los pacientes en el CECC
Visto:. Choudhury JH, SK Ghosh (2015) hipermetilación del promotor de perfiles Identifica los subtipos de cáncer de cabeza y cuello con distinta viral, Medio Ambiente, características genéticas y de supervivencia. PLoS ONE 10 (6): e0129808. doi: 10.1371 /journal.pone.0129808
Editor Académico: Dajun Deng, Hospital del Cáncer y el Instituto de la Universidad de Pekín, China
Recibido: 20 Marzo, 2015; Aceptado: 13-may de 2015; Publicado: 22 Junio, 2015
Derechos de Autor © 2015 Choudhury, Ghosh. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a nivel mundial, el cáncer de cabeza y cuello es el quinto cáncer más común y representa a más de 550.000 nuevos casos cada año [1]. Consumos de tabaco (fumar y de mascar), alcohol y la infección por HPV son factores de riesgo bien conocidos hacia el desarrollo y la progresión de carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) [2, 3]. En la India, tiene un profundo CECC fumar, betel y el tabaco de mascar y el perfil comparativamente pobre supervivencia [4-6]. Sin embargo, (+) CECC VPH positivo tenía el perfil de riesgo distinto y se asocia con una mejor supervivencia en comparación con el VPH negativo - HNSCC [7] (). La alteración genética tales como mutaciones y polimorfismos genéticos son también juegan un mecanismo clave en HNSCC [8-11]. Además, la modificación epigenética (variación de la expresión de genes sin afectar a la secuencia primaria del ADN) puede alterar la expresión de genes clave relacionados con el tumor y por lo tanto considerado como un jugador crucial para el desarrollo de diversos tipos de cáncer [12-14].
hipermetilación de las islas CpG en la región promotora de los genes (los que participan en la regulación del ciclo celular, apoptosis, daño en el DNA de reparación y vía de desintoxicación) están asociados con la progresión del cáncer y el desarrollo. Por lo tanto, la metilación aberrante de islas CpG es una de las modificaciones epigenéticas prometedores inmensa biomarcador molecular potencial para la predicción y la detección de una variedad de tipos de cáncer [15, 16]. CpG isla methylator fenotipo (CIMP), los tumores asociados son un grupo diferenciado definido por rica en CpG hipermetilación del promotor de múltiples genes y tienen una epidemiología distinta y características moleculares [17-20]. El concepto de CIMP se propuso primero en el cáncer colorrectal como un marcador molecular [21], después se estudió también en otros tipos de tumores. Sin embargo, el papel de la vía de CIMP en la tumorigénesis de HNSCC es aún desconocido. La principal enfrentan en el estudio y la exploración de CIMP tumores asociados es definir loci metilada específica que se debe utilizar como panel de CIMP. metilación aberrante de las islas CpG normalmente no metiladas se asocia con la inactivación de la transcripción y así la pérdida de la expresión génica. Recientes investigaciones realizadas en diferentes genes relacionados con el tumor también muestran patrón de metilación diferencial en HNSCC [22-26]. Para evaluar y pantalla de estado CIMP de los cánceres, Parque et al [27] propusieron un grupo de genes que consta
de p16 /CDKN2A
,
MINT1
,
MINT2
,
MINT31
y
MLH1
(referido como el panel clásica CIMP) .Las frecuencias de hipermetilación en un panel de seis genes (
ECAD
,
p16
,
DAPK
,
MGMT
,
RASSF1
y
TIMP3
) se encontraron muy alta en el cáncer de cabeza y cuello [28]. En otro estudio, la metilación aberrante de
MINT1 Opiniones y se encontró
MINT31
estar asociado con un mal pronóstico [29]. Estudios anteriores también informó de que
p16
y
DAPK
metilación aberrante se asoció con un mal pronóstico en el cáncer oral [30, 31]. Por lo tanto, hemos propuesto un panel de siete genes CIMP, incluyendo;
DAPK gratis (muerte asociada a la proteína quinasa),
RASSF1 gratis (Ras dominio de asociación familiar-1),
BRCA1 gratis (cáncer de mama 1),
MLH1
(mutL homología 1),
p16 gratis (dependiente de ciclina inhibidor de la quinasa 2A),
ECAD gratis (cadherina epitelial),
GSTP1 gratis (glutatión S-transferasa pi-1 ), y tres loci metilado como
MINT1
,
MINT2
y
MINT31 gratis (metilado en el tumor de 1, 2 y 31, respectivamente). Los estudios epigenéticos recientes sobre diversos tipos de cáncer se centraron principalmente en el enfoque de múltiples genes, las asociaciones con la infección por VPH y los datos clinicpathological y con alteraciones genéticas [32-34]. Las oncoproteínas HPV E6 y E7 son conocidos por estar asociados con la inestabilidad genómica mediante la inactivación de p53 y proteínas supresoras de tumor Rb de la vía del ciclo celular [35], aparte de esto, HPV también modula la metilación del ADN aberrante del genoma del huésped [36] y causar cancerígeno procesos. En los últimos años, muchos estudios se habían realizado para explicar la asociación de CECC con alternancia de genes de la vía de reparación del ADN y xenobióticos, así como gen-gen y gen-medio ambiente interacción [37, 38]. Tahara et al. [39] mostró factores genéticos, relacionados con la reparación del ADN o de las vías xenobióticos puede tener un papel en la carcinogénesis gástrica relacionada con la hipermetilación CpG isla. Sin embargo, no había tales estudios realizados centrándose perfil específico promotor de la metilación en HNSCC con una combinación de factores de riesgo genéticos relacionados con xenobióticos y vía de reparación del ADN. Por lo tanto, la variación en el patrón de la hipermetilación del promotor CECC basado en los hábitos, la alteración genética y la infección por el VPH sigue siendo poco clara.
Para entender los mecanismos subyacentes de las diferencias en los patrones de hipermetilación específico de tumor, se ha analizado el perfil de metilación aberrante promotor del CECC utilizando siete importantes vía de los genes relacionados con el tumor, incluyendo
DAPK
,
RASSF1 gratis (vía de la apoptosis),
BRCA1
,
MLH1 gratis (reparación del ADN vía),
p16 gratis (vía del ciclo celular),
ECAD gratis (adhesión célula-célula),
GSTP1 gratis (vía xenobióticos) y tres loci metilado (
MINT1
,
MINT2
y
MINT31
) en la zona de alta incidencia de cáncer de noreste de la India. A lo mejor de nuestro conocimiento, somos los primeros en explorar; la correlación de las características genéticas con CIMP (polimorfismos de
GSTM1
,
GSTT1
,
CYP1A1
,
XRCC1
y
XRCC2
genes ) y los factores ambientales (fumar, mascar betel y tabaco) y también con el VPH y la supervivencia de los pacientes con CECC estado. Además, se realizó un análisis de agrupamiento jerárquico para identificar los distintos subconjuntos de CECC en función del perfil de metilación del promotor.
Materiales y Métodos
Colección de tejidos HNSCC
En el presente estudio, se examinaron 116 muestras de tejido, incluyendo 71 muestras tumorales de CECC y 45 tejidos normales adyacentes, recogidas en diferentes hospitales del noreste de la India el periodo 2009-2013. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la recogida de las muestras. datos demográficos básicos como la edad, el sexo, el tabaco (fumar /mascar) Consumo, hábitos alimentarios, etc. se recogieron mediante un cuestionario estándar.
Declaración de Ética
Colección, la forma y el análisis de muestras de tejido consentimiento fueron aprobados por el Comité de ética Institucional (CEI), la Universidad de Assam, Silchar, Assam, India.
extracción de ADN
El ADN genómico fue extraído de muestras de biopsia, cáncer de los tejidos extirpados quirúrgicamente, y los tejidos normales adyacentes utilizando el protocolo de extracción con fenol /cloroformo estándar y también por el ADN genómico aislado de Bioline minikit (Bioline, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después, el ADN extraído se disolvió en TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, EDTA 1 mM) de tampón y se almacenó a -80 ° C para su posterior análisis [40].
HPV detección
las muestras de tejido fueron seleccionados utilizando conjunto de cebadores consenso My9 /MY11 para amplificar fragmentos de genes L1 de HPV, que puede detectar cepas de alto riesgo del VPH [32]. La amplificación se llevó a cabo en 20 l de mezclas de reacción que contienen 2X Biomix (Bioline, Reino Unido), adelante y atrás primers, la muestra 2 l de agua y libre de nucleasa. La mezcla de reacción de PCR se sometió a una desnaturalización inicial a 94 ° C durante 5 min, seguido de 35 ciclos a 94 ° C durante 45s, 47 ° C durante 1 minuto y 72 ° C durante 1 min. La extensión final se realizó a 72 ° C durante 10 min. Se tomaron todas las precauciones posibles, incluidos los controles negativos para reducir al mínimo la contaminación cruzada. Los productos de PCR se observaron en gel de agarosa al 2% con tinción con bromuro de etidio.
Los polimorfismos genéticos de metabolizar carcinógeno (
GSTM1
,
GSTT1
y
CYP1A1
) y las reparaciones de ADN (
XRCC1
y
XRCC2
) genes
Los polimorfismos de
CYP1A1 gratis (T3801C),
XRCC1 (
Arg399Gln) y
XRCC2 gratis (Arg188His genes) se analizaron mediante la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP) método. El sitio polimórfico de
CYP1A1
,
XRCC1
y
XRCC2
se amplificó utilizando publicados adelante y atrás primers [37, 41] en 20 l reacciones de PCR. Cada mezcla de reacción de PCR contiene 10-100 ng de ADN genómico, 20 pmoles de cada cebador, tampón de reacción 10X, mezcla de dNTP,
ADN polimerasa Pfu
, MgCl
2 y agua libre de nucleasa (NFW). La mezcla de reacción de PCR se estableció con una desnaturalización inicial a 94
° C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de 94
° C para la desnaturalización de 45 años, 62
° C /58
° C /60
° C (por
CYP1A1
,
XRCC1
y
XRCC2
respectivamente) para 45s para la hibridación del cebador y extensión a 72
° C durante 1 min. La extensión final se realizó a 72
° C durante 10 min. Los productos de PCR de
CYP1A1
,
XRCC1
y
XRCC2
se digirió por separado con el enzima de restricción
MSP1
,
HpaII
y
HPHI
enzimas (New England Biolabs, EE.UU.), respectivamente. Los productos digeridos fueron resueltas en gel de agarosa al 3% para evaluar el tamaño de los productos de PCR-RFLP [37]. Genotipado de la
GSTM1
y
GSTT1
se realizó mediante PCR multiplex, utilizando
CYP1A1
gen como un control interno, en un volumen total de 10 l de mezcla de reacción 2X Biomix (Bioline, Reino Unido) y 10 pmoles de cada uno de los hacia adelante (F) y atrás (R) cebadores (S2 tabla). Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5% teñido con bromuro de etidio.
Promotor análisis y evaluación de la hipermetilación CIMP-estado
estado de metilación de los genes relacionados con el tumor (
RASSF1
,
DAPK
,
ECAD
,
BRCA1
,
MLH1
,
p16
y
GSTP1
) y tres loci metilado (
MINT1
,
MINT2
, y
MINT31
) se analizaron utilizando cebadores PCR específica de metilación (MSP) (S2 Tabla). Para el ensayo de MSP, las muestras de ADN fueron sometidas a modificación usando el kit DNA Imprint1 Modificación (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), siguiendo las instrucciones como se describe por el fabricante de [18]. En este procedimiento, la desnaturalización del ADN y la modificación con bisulfito se llevan a cabo simultáneamente. Bisulfito reacciona con ADN monocatenario a deaminate la citosina (C) y se transforma la citosina no metilada (C) a uracilo (U) y deja citosina 5-metil sin cambios y por lo tanto crea diferentes secuencias para ADN metilado y no metilado. A continuación, hemos utilizado dos conjuntos diferentes de cebadores para cada gen, una serie específica de cebadores para el ADN metilado y el otro para el ADN unmetyhlated. También usamos ADN de linfocitos de sangre periférica de individuos sanos sin infección por VPH, como control negativo, y el ADN a partir de linfocitos de sangre periférica tratados con SssI methyltranferase se utilizó como control positivo (para ADN metilado). Toda la reacción de PCR se llevó a cabo en el termociclador de gradiente (Applied Biosystems, Inc, CA, EE.UU.) y los productos amplificados de ADN metilado y no metilado se corrieron lado a lado en gel de agarosa para la comparación. En este estudio, el panel CIMP se clasificó en tres grupos: CIMP-alta (al menos 5 genes /loci metilados de los 10), CIMP-bajo (menos 5/10 genes /loci metilado), y CIMP-negativo (0/10 genes /loci metilado). Esta clasificación se realiza sobre la base de los criterios utilizados previamente para el estado CIMP en otros tipos de tumores [19, 42]. índice de metilación (MI) también se calculó para cada caso a través de la división del número de genes metilados /loci por el número total de genes /loci bajo estudio.
Análisis de supervivencia
La supervivencia se calculó en meses desde el principio del tratamiento hasta el mes de deathusing curvas de supervivencia de Kaplan-Meier en el software SPSS, versión 18 (Windows). Las muertes debidas a enfermedades /aparte del cáncer de complicación fueron expulsados del estudio. La asociación entre las características diferentes (HPV, CIMP y racimo) y el caso de la muerte se analizó mediante pruebas de log-rank (Mantel-Cox).
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión de software 18 y de dos caras
P-valor
0,05 (dos colas) se consideró estadísticamente significativo. Se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para comparar los niveles de metilación del promotor de muestras tumorales HNSCC y muestras normales, que permiten la comparación de dos grupos de muestras independientes [43]. Los valores significativos se ajustaron posteriormente para múltiples pruebas por el método de Bonferroni (
P
-valor se multiplica por el número de comparaciones). Además, para reforzar la asociación entre los diferentes factores y CIMP en el riesgo CECC,
P
-valores se calcularon después de ajustar los factores de confusión tales como la edad, el género, el VPH, el tabaquismo, el estado de mascar betel quid y el tabaco, según proceda. Prueba de tendencia lineal se realizó también para múltiples CIMP estado ordinal. Agrupación jerárquica sin supervisión se realizó utilizando el software JMP 12 del paquete SAS, que identifican subgrupos entre los pacientes HNSCC basado en la frecuencia de metilación del promotor.
Resultados
Características de los pacientes
Los datos clínico-patológica del 71 estudiaron HNSCC pacientes se resumen en la Tabla 1, compuestos 51 (71,8%) hombres y 20 (28,2%) mujeres con un rango de edad de 23-86 años (77,5% pertenecen al grupo de edad de 45 a 86). De los 71 pacientes HNSCC; 38 (53,5%) del cáncer oral (incluyendo la mejilla, base de la lengua, la lengua, gingivam, y la mucosa bucal) 16 (22,6%) tenían cáncer de laringe, 8 (11,2%) tenían cáncer de faringe y 9 (12,7%) tenían otro tipo de cáncer tipos en la cabeza y el cuello. Según la clasificación TMN, la mayoría de los pacientes tenían etapa avanzada (III /IV) (67,3%) en el diagnóstico. Entre los pacientes con CECC, los fumadores, los masticadores de betel quid y masticadores de tabaco fueron 71,8%, 66,2% y 74,6%, respectivamente.
Las frecuencias de promotor hipermetilación en muestras tumorales de pacientes HNSCC y tejidos normales
estado de la hipermetilación del promotor de la
p16
,
DAPK
,
GSTP1
,
RASSF1
,
BRCA1
,
ECAD
,
MLH1
,
MINT1
,
MINT2
y
MINT31
genes de 71 CECC y 45 muestras normales de los tejidos se muestran en la Tabla 2 . Los tejidos tumorales habían genes mucho más altas /loci frecuencia de hipermetilación en comparación con muestras de tejidos normales (32,4% frente a 13,3% para
p16
, 29,6% frente a 11,1% para
DAPK
, 18,3% vs . 8,9% para
BARC1
, 31% frente a 15,6% para
GSTP1
, 32,4% frente a 8,9% para
ECAD
, 50,7% frente a 22,2% para
RASSF1
, un 5,6% frente al 2,2% para
MLH1
, 43,7% frente a 13,3% para
MINT1
, 52,1% frente a 11,1% para
MINT2
y el 46,5% frente a 17,8% para
MINT31
). Sin embargo, se observó significativamente alto nivel de hipermetilación en
p16
,
DAPK
,
ECAD
,
RASSF1
,
MINT1
,
MINT2
y
MINT31
(
P
= 0,02, 0,02, 0,04, 0,02, 0,01, & lt; 0,01, y 0,01, respectivamente) en los tejidos HNSCC en comparación con muestras de tejido normal . El índice de metilación (MI) (relación entre el número de promotores metilados y número total de promotores en estudio) varió desde 0 hasta 0,9 de los 71 pacientes. De los 71 pacientes HNSCC 14 (19,7%) tenían 0 (cero) MI, 33 (46,5%) tenían MI de 0,1-0,5 y 24 (33,8%) pacientes tuvieron MI de 0,6-0,9. HNSCC pacientes con diferentes hábitos y perfiles genéticos se encontró que presentaban índice de metilación diferencial (MI). MI significa masticadores de tabaco /los fumadores fue mayor que los fumadores no masticadores /. Del mismo modo, los pacientes con
GSTM1
nula,
genotipo CYP1A1
CC y el VPH (+) también muestran un mayor índice de metilación (Figura 1).
Cada diagrama de caja representa el índice de metilación diferencial (MI) entre los fumadores /no fumadores masticadores y /o masticadores genotipo salvaje vs. variante de genotipo o VPH (+) frente al VPH (-). HNSCC pacientes
estado
Promotor metilación en el VPH positivo (+) y VPH negativo (-) CECC
en el estudio, el VPH se detectó en 37 de los 71 casos (52,11%) utilizando cebadores consenso. La correlación entre la metilación de los genes relacionados con el tumor y el VPH se resume en la Tabla 3. Los resultados muestran que la metilación del promotor de
DAPK
,
RASSF1
,
p16
y
MINT31
fueron significativamente mayores en los pacientes (+) HNSCC VPH positivas en comparación con el VPH negativo (-) de los pacientes (
P = 0,031
, 0,013, 0,031 y 0,015) (figura 2B). Se encontró una asociación altamente significativa entre los tumores VPH positivos (+) y CIMP-alta grupo (
P = 0,028
). Sin embargo, no hubo correlación entre el CECC VPH (+) CIMP-bajo y (
P = 0,477
), en comparación con el VPH (-). HNSCC tumores
(A) de Kaplan-Meier tumores (i) el VPH (+) HNSCC que muestran una mayor supervivencia en comparación con el VPH - (tumores): gráficos de supervivencia. (Ii) CIMP-alta grupo de tumores HNSCC que muestran una peor supervivencia en comparación con otros. (Iii) Dos clúster epigenética también mostró supervivencia diferencial con el racimo-1 tuvieron una supervivencia pobre. (B) La frecuencia de metilación del promotor de 10 genes relacionados con el tumor /loci de VPH (+) y el HPV (-) HNSCC [* P & lt; 0,05 (Mantel-Cox Log-rank)]. (C) índice de metilación (MI) en tres CIMP-grupos de tumores HNSCC.
CIMP en los tejidos tumorales HNSCC
En este estudio, el estado CIMP se clasificó como CIMP -alta (cinco o más genes metilados), CIMP-bajo (menos de cinco genes metilados) y CIMP-negativo (no hay genes metilados). De las muestras HNSCC 71, el 39,4% (28/71) fueron CIMP-alta, el 42,3% (30/71) fueron CIMP-bajo y el 18,3% (13/71) fueron CIMP-negativo.
Correlación entre factores ambientales y CIMP
Cuando se analizaron los datos sobre los factores ambientales tales como fumar, mascar betel quid y con CIMP y se encontró fumar y el tabaco de mascar tenía fuerte correlación con CIMP-alta (
P =
0,008 y 0,034, respectivamente) en comparación con CIMP-negativo. Sin embargo, mascar betel quid no tuvo correlación significativa con CIMP-marcadores. Asimismo, no habíamos encontrado diferencias significativas entre CIMP-bajo Vs CIMP-negativo y CIMP-alta Vs CIMP-bajo en términos de consumo de tabaco de mascar o (Tabla 4).
Correlación entre factores genéticos y CIMP
también se correlacionaron los datos de la alteración genética de la metabolización de carcinógeno (
GSTM1
,
GSTT1
y
CYP1A1
) y la reparación del ADN (
XRCC1 Opiniones y
XRCC2
) genes con datos de panel CIMP. Los tumores CIMP-alta tenían significativamente mayor frecuencia de
GSTM1
nula, en comparación con los tumores CIMP-bajo y CIMP-negativos (
P = 0,004
y 0.023, respectivamente). Sin embargo, no hubo correlación significativa entre la
GSTT1 gratis (null),
CYP1A1 gratis (T3801C),
XRCC1 gratis (Arg /Glu) y
XRCC2
(Arg /His) genotipos variantes y diferentes marcadores CIMP (Tabla 4).
la supervivencia se correlaciona con CIMP y HPV
la supervivencia se analizó con respecto a los marcadores CIMP utilizando las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier (Fig 2A). El análisis reveló que la mediana de supervivencia global de 47 pacientes de los 71 era de 15 meses [IC del 95% = 10,97 a 19,03], y la mediana de supervivencia en CIMP-alta, CIMP-bajo y CIMP-negativos fueron 11 meses [95% IC = 7.71 a la 14.28], 18 meses [IC del 95% = 13,73 a 22,26], y 19 meses [IC del 95% = 5,14 a 32,85], respectivamente (
P
la tendencia
= 0,011). Una vez más el tiempo medio de supervivencia para Grupo 1 y Cluster-2 característico eran 13 y 18 meses, respectivamente (
P = 0,026
) (Tabla S1). El CIMP-alta y el Grupo 1 se asociaron significativamente con una mala supervivencia en pacientes con CECC. Considerando que, con el tiempo de supervivencia de los pacientes HNSCC VPH (+) fue mejor (17 meses) que el VPH (-) pacientes CECC (13 meses) (
P = 0,041
): perfil
grupos de tumores identificados. y la correlación con las características ambientales, genéticos y epigenéticos
en el presente estudio, se realizó la agrupación jerárquica sin supervisión y se identificaron dos clases o subgrupos en base a los datos de metilación del promotor en muestras tumorales (figura 3). Habíamos construido agrupaciones jerárquicas utilizando siete genes /loci, ya que después del ajuste siete genes /loci de cada diez encontrado para ser hypermethylated significativamente. Los dos grupos identificados tenían características ambientales, genéticos y epigenéticos distintos y se resumen en la Tabla 5. La frecuencia del consumo de tabaco (86,2%) y el tabaco de mascar-(89,7%),
GSTM1 nulo
(82,8%) y
CYP1A1 gratis (31,05%),
XRCC1 gratis (27,6%) y
XRCC2 gratis (48,3%) variante genotipos fue mayor en el Grupo-1 en comparación con el clúster-2. Sin embargo, sólo fumar, mascar tabaco y
GSTM1 null genotipo
habían mostrado variación estadísticamente significativa entre los grupos (
P = 0,048
, 0,034 y 0,002, respectivamente). Además, la frecuencia de los tumores (+) positivo HNSCC VPH fue significativamente mayor (
P
= 0,009) en el Grupo 1 en comparación con el Cluster-2. CIMP-alta grupo (93,1%) es significativamente mayor en los del Grupo 1 (
P Hotel & lt; 0,001) en comparación con el Cluster-2, mientras que, Cluster-2, caracterizado por CIMP-bajo (66,7%) y CIMP grupos negativos-(30,9%) guía
Los diferentes factores en la carta térmica estuvieron representados por la variación del color: los consumidores de tabaco., la presencia del VPH y
GSTM1
nula,
GSTT1 nulo (
oscura color rojo); tabaco no consumidores y VPH ausencia
GSTM1
presente y
GSTT1
presentes (color amarillo claro). Para
CYP1A1
,
XRCC1
y
XRCC2
estado: de tipo salvaje (rojo oscuro); heterocigóticos (rojo anaranjado) y el alelo variante homocigótica (naranja claro) y para el estado CIMP: CIMP-alta (rojo oscuro), CIMP-bajo (rojo naranja) y CIMP-negativo (color claro) guía empresas
Discusión
El desarrollo y la progresión de la CECC es un proceso de múltiples pasos modulada por factores genéticos, epigenéticos y ambientales [2, 44, 45]. Los principales factores ambientales tales como el consumo de tabaco y de mascar, así como la infección por VPH puede conducir a una amplia gama de procedimientos genéticos y epigenéticos que promueven la inestabilidad genómica y apoyar el desarrollo de tumores [3, 5, 9]. perfil promotor hipermetilación de los genes relacionados con el tumor se prevé que será crucial y frecuente en diferentes tipos de cáncer. Muchos eventos epigenéticos en vías cancerígenas se han estudiado recientemente y revelado los métodos para detectar CpG patrón promotor isla metilación para estratificar los grupos de alto riesgo entre los diferentes tipos de cáncer [15, 17, 18, 34]. Esto ayuda en la detección de la aparición temprana de cáncer, y predice los resultados clínicos. Por lo tanto, es indispensable para estudiar el estado de metilación de un panel de genes representativos en HNSCC. Aquí, en este estudio, se analizó el perfil de organizador metilación aberrante del CECC utilizando siete importantes vía de los genes relacionados con el tumor (
p16
,
DAPK
,
GSTP1
,
ECAD
,
RASSF1
,
MLH1
y
BRCA1
) y tres loci metilado (
MINT1
,
MINT2
y
MINT31
) en la zona de alta incidencia de cáncer de noreste de la India. En nuestro estudio, también se correlacionan estado de metilación aberrante de los pacientes con polimorfismos genéticos (de
GSTM1
,
GSTT1
,
CYP1A1
,
XRCC1
y
XRCC2
) y el factor ambiental (fumar, mascar betel y tabaco), así como con los datos de supervivencia.
Hemos encontrado un nivel significativamente alto de
p16
,
DAPK
,
ECAD
,
RASSF1
,
MINT1
,
MINT2
y
MINT31
hipermetilación en los tejidos en comparación con HNSCC muestras de tejido normal, lo que refleja la posible participación de alteración epigenética hacia el desarrollo y la progresión de la CECC. Nuestra investigación actual se había cubierto un amplio grupo de genes de la ruta relacionados con el tumor, incluyendo
p16 gratis (control del ciclo celular),
DAPK
,
RASSF1 gratis (apoptosis),
BRCA1
,
MLH1 gratis (reparación del ADN),
ECAD gratis (adhesión célula-célula),
GSTP1 gratis (el metabolismo carcinógeno),
MINT1
,
MINT2
y
MINT31 gratis (loci metilado en los tumores).
Muchos estudios epigenéticos anteriores dilucidado existencia de VPH mediada la metilación del ADN en HNSCC [46, 47] . estudio reciente de la India de nordeste utilizando un panel de 10 genes, explicó el papel del VPH y el tabaco en la génesis del cáncer UADT [32]. Sin embargo, además se analizó la hipermetilación de los genes individuales /loci por separado en el VPH (+) y el HPV (-) de los casos. Encontramos la metilación del promotor de
DAPK
,
p
16,
RASSF1 Opiniones y
MINT31
se asoció significativamente con el VPH (+) tumores del CECC. Por lo tanto, el VPH que parecía ser un agente causante de alteraciones de la isla CpG de metilación de genes de tumor supresor en HNSCC. En general, el VPH (+) HNSCC se asocia con una supervivencia más favorable [9], nuestro estudio también exploró HPV (+) de los pacientes de HNSCC tenían una mejor tasa de supervivencia en comparación con HPV (-). Pacientes que reflejan un posible papel en el pronóstico
en muchos tipos de cáncer, especialmente en el cáncer colorrectal, CpG Island methylator Fenotipo (CIMP) se utilizó para identificar clínica y patológicamente relevantes subconjuntos de tumores. Toyota et al. introdujo la isla CpG methylator fenotipo (CIMP) para clasificar el cáncer basado en el estado de metilación de un grupo de genes [21]. En el cáncer colorrectal, tumores CIMP tenían características epidemiológicos de la enfermedad, la inestabilidad (MSI) mutaciones de BRAF perfil de microsatélites y la supervivencia, en comparación con los tumores no-CIMP [48, 49]. CIMPs se ha informado de un número de cánceres, incluyendo el tracto aerodigestivo superior (UADT) [32], cáncer oral [50], y el carcinoma de células escamosas del esófago [51] y el cáncer de mama [19]. Sin embargo, sólo el único estudio estaba allí en HNSCC, que explican CIMP en el sub-grupo de VPH (+) Tumor de HNSCC [33]. El perfil de la hipermetilación de promotores de genes es diversa para cada tipo de cáncer y también el método de detección y la selección de genes múltiples para CIMP del panel varía entre los estudios. Basado en el patrón de hipermetilación de 10 genes relacionados con el tumor /loci, clasificamos CECC en tres grupos: CIMP-alta, CIMP-bajo y CIMP-negativos. Hemos observado distintas características de tumor dentro de los grupos CIMP-alta y CIMP-negativos. Las frecuencias de fumar, mascar tabaco y
GSTM1
genotipos nulos de los pacientes fueron significativamente mayores en los grupos CIMP-alta en comparación con CIMP-negativo. Características genéticas y ambientales pueden dirigir a las características de los tumores CIMP HNSCC. También se observó una pobre tasa de supervivencia de inclinación en CIMP-alta en comparación con el grupo de tumores CIMP-negativas; indicar CIMP-alta puede ser un predictor de mal pronóstico del CECC en población indígena del noreste. Tal vez no es inesperado que hemos encontrado correlaciones entre la CIMP-alta y el paciente mal resultado, si lo comparamos nuestros datos sobre la CIMP y la supervivencia en los CECC con otros cánceres descritos anteriormente [52, 53]. Una profunda comprensión de CIMP podría permitir el diseño de mejores estrategias de tratamiento para HNSCC
.
agrupación epigenética de los pacientes HNSCC se realiza en base a los perfiles de metilación de ADN en muestras de tejido tumoral. análisis de agrupamiento jerárquico identificó dos subconjuntos distintos, uno subgrupo de pacientes con CECC alta frecuencia de tabaquismo, hábitos de tabaco de mascar,
GSTM1 nulo y
CYP1A1 gratis (CC) variante de genotipo. El cluster-1 también se caracteriza por el VPH (+) casos, y contenía CIMP-alta del grupo, lo que refleja una posible correlación entre la metilación del ADN y factores genéticos y ambientales en el VPH asociado CECC. Por lo tanto, epigenética y junto con la alteración genética con una combinación de factores ambientales también pueden desempeñar un papel en un subconjunto de HNSCC. En nuestro estudio anterior, encontramos una fuerte interacción entre los genes que metabolizan carcinógenos (
GSTM1
y
GSTT1
) y los factores ambientales en HNSCC [2]. La interacción de la Fase I (
CYP1A1
) y Fase II (
GSTM1 Hotel & amp;
GSTT1
) que metabolizan los carcinógenos del tabaco genes puede dilucidar la acumulación de la mayor cantidad de sustancias tóxicas dentro del cuerpo que podría desempeñar el papel importante durante el desarrollo de la CECC. Además, uno de nuestro otro estudio exploró la interacción entre el tabaco y la reparación del ADN (
XRCC1 Opiniones y
XRCC2
) polimorfismos de genes y la diafonía entre estos genes de reparación del ADN de dos hacia la susceptibilidad de HNSCC [37] . estudio reciente de Tahara et al. [39] encontró asociación entre el
GSTM1
genotipo nulo y una mayor susceptibilidad a la hipermetilación de CpG, sin embargo se encontraron con susceptibilidad reducida a CpG hipermetilación de
DAPK
gen con
XRCC1 codón 399 Gln