Extracto
FBP1, fructosa-1,6-bisfosfatasa-1, una enzima reguladora de la gluconeogénesis, cataliza la hidrólisis de la fructosa 1,6-bifosfato de fructosa 6-fosfato y fosfato inorgánico. El mecanismo que funciona para antagonizar la glucólisis y fue inactivada epigenetically través de la vía NF-kappaB en el cáncer gástrico ha sido reportado. Sin embargo, su papel en la carcinogénesis del hígado sigue siendo desconocido. A continuación, se determinó la expresión de ADN y metilación de FBP1 en el CHC primario y tumor de colon. FBP1 se expresó humilde de líneas celulares de cáncer de hígado 80% (8/10) carcinoma hepatocelular humano, 66,7% (6/9) y 100% líneas (6/6) de células de cáncer de colon, pero fue mayor en los tejidos no tumorales adyacentes apareados e inmortalizado líneas celulares normales, lo que se correlaciona bien con su estado de metilación. La metilación se detectó más en los HCC primarios, los tejidos tumorales gástrica y del colon, pero ninguno o de vez en cuando en los tejidos no tumorales adyacentes apareados. El análisis detallado de metilación 29 sitios CpG en una región promotora de 327 pb mediante secuenciación genómica de bisulfito confirmó su metilación. FBP1 silenciamiento podría ser revertida mediante tratamiento desmetilación química con 5-aza-2 'desoxicitidina (AZA), lo que indica silenciamiento epigenético directa. La restauración de la expresión en células FBP1 expresadas bajo el crecimiento celular y la formación de colonias inhibió significativamente la capacidad a través de la inducción de la detención del ciclo celular fase G2-M. Por otra parte, los efectos observados coincidieron con un aumento en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). En resumen, la inactivación epigenética de FBP1 también es común en el cáncer de colon y de hígado humano. FBP1 parece ser un supresor de tumores funcional implicado en la carcinogénesis de colon hígado y
Visto:. Chen M, Zhang J, Li N, Qian Z, Zhu M, Li Q, et al. (2011) hipermetilación del promotor mediada por regulación a la baja de FBP1 en el carcinoma hepatocelular humano y cáncer de colon. PLoS ONE 6 (10): e25564. doi: 10.1371 /journal.pone.0025564
Editor: Xin Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 13 Junio, 2011; Aceptado: 5 Septiembre 2011; Publicado: 19 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Major Ciencia y Tecnología Proyecto Especial del plan de china XI programa Quinquenal (núm 2008ZX1002-004), la Fundación de Investigación básica del Estado chino Grant (2007CB512904), Shanghai Ciencia y Tecnología programa de Investigación (08JC1403900), y el programa por Mejor Líder Médico Académico de Shanghai (08GWD19). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (HCC) sigue siendo la tercera causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo y la segunda neoplasia maligna más común en china. La patogénesis molecular de HCC permanece en gran medida desconocido. Se ha planteado la hipótesis de que el desarrollo y la progresión de HCC son la consecuencia de eventos genéticos y epigenéticos acumulativos. CpG hipermetilación actúa como un mecanismo alternativo para la inactivación de genes, y ahora se reconoce como un mecanismo importante durante la iniciación y progresión del tumor, incluyendo el cáncer de hígado [1], [2]. Es importante e intrigante para identificar nuevos genes silenciados por hipermetilación del promotor en el cáncer de hígado debido gen supresor de tumores aberrante (TSG) hipermetilación es a la vez un mecanismo y un biomarcador para la tumorigénesis [3].
FBP1, fructosa-1, 6-bisfosfatasa 1, una enzima reguladora de la gluconeogénesis, cataliza la hidrólisis de la fructosa 1,6-bifosfato de fructosa 6-fosfato y fosfato inorgánico. deficiencia de fructosa difosfatasa-1,6- está asociado con la hipoglucemia y acidosis metabólica. Se informó [4] que FBP1 que funciona para antagonizar la glucólisis se downregulated a través ruta de NF-kappaB en células NIH3T3 transformadas por Ras. funciones de NF-kappaB aguas abajo de Ras para promover la regulación a la baja de la epigenética FBP1. La inhibición de NF-kappaB invierte promotor de la metilación mediada por regulación a la baja FBP1. Por otra parte, la metilación del promotor de FBP1 era relevante para la carcinogénesis gástrica, por ejemplo, el género, las etapas TNM y la tasa de supervivencia se asoció significativamente con FBP1 la metilación del promotor. Además, se estudió [5] que el promotor FBP1 metilación contribuye a la disminución de expresión de la FBPasa en el cáncer de mama. Cuando las muestras de tejido no malignas y malignas del mismo paciente se compararon una correlación entre el aumento de la metilación del promotor de FBPasa y una disminución de los niveles de ARNm de la FBPasa se observó. Sin embargo, no hay resultados se muestran para FBP1 inactivación epigenética en la carcinogénesis del hígado.
especies de oxígeno reactivas (ROS), las moléculas químicamente reactivos que contienen oxígeno, incluyendo los iones de oxígeno y los peróxidos, son los principales mediadores del estrés oxidativo celular y desregulación redox involucrado en la iniciación y progresión del cáncer. Ahora es ampliamente aceptado que constitutivamente niveles elevados de estrés oxidativo celular y la dependencia de los mitogénica y anti-apoptótica ROS señalización en las células cancerosas están implicados en la carcinogénesis. Paradójicamente, aparte de estar involucrados en proliferativa, anti-apoptóticos, metastásico, y la señalización angiogénica, ROS puede también ejercer citotóxica y funciones proapoptóticos que limitaría la tumorigenicidad y la progresión maligna [6], [7]. FBP1 es una proteína multifuncional que es, además de su función en la gluconeogénesis, que participan en la producción de ROS después del tratamiento con MMS o en células cronológicamente de edades comprendidas [8]. En la ausencia de células FBP1 sobrevivir al tratamiento MMS mejor e incluso proliferar después del tratamiento a largo plazo. Esto podría ser el resultado de reducción de la producción de ROS observó en el mutante ΔFBP1 en respuesta a la metilmetano sulfonato tratamiento agente alquilante (MMS) y el envejecimiento. La falta de FBP1 mejoró superviviente de células envejecidas en un medio completo y dio lugar a un retraso en la inducción de la producción de ROS. La sobreexpresión de FBP1 reduce la capacidad de formar colonias incluso de los cultivos no tratados, vida más corta y un aumento de la inducción del promotor RNR2 después del tratamiento MMS.
Aquí, hemos demostrado que FBP1 sometió promotor CpG silenciamiento hipermetilación asociada en humanos cáncer de colon hígado y. El análisis de las líneas celulares de hígado y colon de cáncer y tejidos mostró que FBP1 hipermetilación era un evento común en el cáncer de colon y el hígado humano. También demostramos que FBP1 funciona como un TSG para suprimir el crecimiento de células de cáncer a través de la inducción de la detención del ciclo celular en fase G2-M y un aumento en los niveles de la generación de ROS. Los cambios epigenéticos en la homeostasis redox celular y los niveles de ROS afectarán la viabilidad mediante la modulación redox de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial que conduce a la liberación del citocromo C, apoptosome montaje y la activación de las caspasas ejecutoras, lo que favorece a agentes quimioterapéuticos del cáncer dirigidos por ROS.
Materiales y Métodos
líneas celulares de cáncer, los tejidos del tumor primario y ARN /ADN Extracción
Nueve líneas celulares de cáncer de hígado humano (HepG2, Hep3B, Huh7, HCC-LM3, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97H y MHCC-97L) se utilizaron para el análisis de los HCC. Uno líneas de células hepáticas humanas normales inmortalizadas L02 se utilizaron como controles "normales" para el análisis de los HCC. Seis líneas celulares de cáncer de colon humano (HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo y RKO) se utilizaron para el análisis de cáncer de colon y los tejidos adultos normales del colon humanos se utilizaron como controles "normales". Todas las líneas celulares se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Va., EE.UU.). A menos que se indique específicamente, las células se cultivaron en medio DMEM (Invitrogen, Carlsbad, Calif., EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C con 5% de CO
2 y 95% de humedad. Para la desmetilación farmacológica, las células se trataron con 5 uM 5-aza-2 'desoxicitidina (AZA) (Sigma, St. Louis, Mo., EE.UU.) durante 3 días consecutivos. El medio de cultivo se cambió cada 24 horas. Se utilizó una concentración equivalente de vehículo (DMSO) como el control
HCC primarios se obtuvieron de pacientes con cáncer de hígado en el Hospital Huashan en el momento de la cirugía.; muestras no tumorales emparejados de pacientes con cáncer de hígado se obtuvieron también al menos 2 cm de distancia del tumor. porciones no tumorales fueron recortados despegue de los bloques tumorales congeladas y las zonas tumorales seleccionados tenían células tumorales más del 80% según lo confirmado por histología. gástrico humano, los tejidos tumorales de colon y los tejidos normales del colon adultos fueron proporcionados por el Hospital de Medicina China de Zhejiang. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para la obtención de las muestras de estudio.
Total RNA y DNA genómico se extrajeron usando el reactivo Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La concentración total de ARN y ADN fueron cuantificados por NanoDrop 1000 (Nanodrop, Wilmington, Del., EE.UU.).
Real-Time RT-PCR
Se llevó a cabo una reacción de transcripción inversa usando 1 ug del total ARN con alta capacidad de cDNA transcripción reversa kit (Applied Biosystems, Foster City, Calif., EE.UU.). Los niveles de expresión de ARNm de FBP1 se determinaron por tiempo real RT-PCR utilizando SYBR Green Mix Kit maestro y ABI 7500 Real-Time RT-PCR System (Applied Biosystems, Foster City, Calif., EE.UU.). fosfato deshidrogenasa gliceraldehído-3- (GAPDH) se utilizó como un control interno de la integridad del ARN. Real-time RT-PCR se realizó por triplicado. Los cebadores usados para FBP1 fueron:. FBP1-F 5'-ATCCCCTTGATGGATCTTCC-3 'y FBP1-R 5'-TCCAGCATGAAGCAGTTGAC-3' (208 bp producto)
tratamiento con bisulfito del ADN y metilación específica de PCR
ADN genómico fue-bisulfito tratados con Zymo ADN Modificación Kit (Zymo Research, Orange, Calif., EE.UU.) de acuerdo con el protocolo proporcionado. PCR específica de metilación (MSP) se llevó a cabo durante 40 ciclos con la temperatura de recocido a 60 ° C. cebadores específicos de metilación fueron: FBP1-MF 5'-TGAAGATTTAAGTAGGCGGAGTC-3 'y 5' FBP1-MR-ATAAACACTAACCG CAAATACGAA-3 ', y no metilación específicos de cebadores fueron: FBP1-UF-5' GAAGATTTAAGTA GGTGGA GTTGTG-3 'y FBP1 -UR 5'-CTAACAAAAAAACTAACAAACCAAC-3 '
bisulfito de genómica secuenciación
ADN genómico tratado con bisulfito se amplificó usando bisulfito de secuenciación genómica primers (BGS), FBP1-BF:. 5'-TGATTTTGGAGGAAATAGTTATAGTTTTT- 3 'y FBP1-BR: 5'-TAATACAACTAAACCAAACCAAAC-3'. Los productos de PCR fueron purificados con Illustra GFX PCR ™ y kit de purificación de gel de banda (GE Healthcare Life Science, Uppsala, Suecia) y se clonaron en el vector pCR4-TOPO para la secuenciación (Invitrogen). Al menos cuatro colonias se eligieron al azar para la extracción de plásmido y análisis de secuenciación utilizando el kit de secuenciación ABI PRISM BigDye Terminator Cycle en el secuenciador ABI 3100 (Applied Biosystems).
Construcción de FBP1 Expresando Vector
La FBP1 vector que expresa se construyó por clonación de marco de lectura abierto FBP1 de longitud completa en mamíferos pcDNA3.1 vector de expresión. El marco de lectura abierto de longitud completa FBP1 se amplificó a partir de ADNc de estómago normales usando una alta fidelidad de ADN-polimerasa PFU (Invitrogen). Los cebadores utilizados para la clonación fueron FBP1-CF: 5'-CGGAATTCCGATGGCTGACCAGGCGCCCTTCGA-3 'y FBP1-CR: 5'-GCAAGCTTCCTGGGCAGAGTGCTTCTCATACACC-3' accomp- anied con los sitios de corte de doble enzima EcoRI y Hind III. La secuencia y orientación del inserto se confirmó por secuenciación de ADN.
formación de colonias de ensayo
células de cáncer de hígado humano transitoriamente transfectadas con pcDNA3.1 vector vacío o pcDNA-FBP1 expresando vector se utilizaron para la ensayo de formación de colonias monocapa para evaluar el crecimiento celular in vitro. Las células se cultivaron durante la noche en una placa de 12 pocillos (5 x 10
5 células /pocillo) y se transfectaron con el vector vacío o pcDNA3.1 pcDNA-FBP1 vector que expresa utilizando Fugene 6 (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). Cuarenta y ocho horas más tarde, los transfectantes se volvieron a sembrar por triplicado y se cultivaron durante 10~15 días en completo que contenía medio DMEM G418 (400 ug /ml). Las colonias supervivientes se tiñeron con violeta de genciana después de la fijación metanol y colonias visibles (≥ 50 células) se contaron. Los experimentos se repitieron tres veces.
Crecimiento Celular Ensayo
crecimiento celular se determinó mediante un ensayo de proliferación no radiactivo basado en la capacidad de las células metabólicamente activas para convertir 3- (4,5- dimetiltiazol-2-il) -5 (3-carboxymethonyphenol) -2 - (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio (MTS) (Promega, Madison, WI, EE.UU.) en formazan. Las células supervivientes después de la selección G418 se volvieron a sembrar en una placa de 96 pocillos con diferente número de células y se cultivaron en medio completo que contenía G418 DMEM (400 ug /ml) durante otras 72 horas. La cantidad de formazán se midió como la de arriba. La cantidad de formazán se midió a 490 nm de absorbancia después de una hora de incubación con 96 CellTiter acuosa Reactivo Una solución siguiendo las instrucciones proporcionadas.
Análisis del ciclo celular y la determinación de ROS Producción
Sobrevivir a las células después de la selección de G418 se tripsinizaron, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato, y se fijaron en 70% de solución salina tamponada con etanol con fosfato enfriada con hielo. Después de lavar a cabo etanol, las células fijadas se trataron con 0,01% de RNasa (10 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) durante 10 min a 37 ° C y luego se tiñeron con 0,05% de yoduro de propidio durante 20 minutos a 4 ° C en la oscuridad. La distribución del ciclo celular se determinó utilizando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA, EE.UU.) y se analizaron con el software Modfit (Phoenix, San Diego, CA, EE.UU.). Las células que sufren apoptosis se detectaron como la población sub-G1 debido a la pérdida de ADN fragmentado.
niveles de ROS se midieron mediante el uso de 2'-7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA) (Invitrogen) en un ensayo de citometría de flujo como se describe
[9]. El análisis estadístico
Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar (DE). Student se utilizó
t
prueba para comparar las diferencias de expresión FBP1 sobre el efecto de la formación de colonias y la proliferación celular. Todos los cálculos estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 11.0 para Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL). Valor de
P
. & Lt; 0,05 se tomó como la significación estadística
Resultados
regulación a la baja de FBP1 en el hígado humano y otros cánceres digestivos
La expresión de FBP1 se downregulated de manera espectacular en el 66,7% (6/9) líneas celulares de cáncer de hígado humano HepG2 incluyendo, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97H y MHCC-97L (Figura 1A), en comparación con las células normales del hígado humanas LO2. Del mismo modo, downregualtion de FBP1 también se encontró en 100% líneas (6/6) humanos de colon de células de cáncer incluyendo HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo y RKO (Figura 1A) en comparación con el tejido adulto colon normal humano. Con el fin de saber si la regulación por disminución de FBP1 debe atribuirse a la metilación del ADN, la expresión de FBP1 en líneas celulares de cáncer de colon hígado humano y antes y después del tratamiento Aza se determinaron mediante Real-Time RT-PCR. La expresión de FBP1 fue significativamente upregulated en líneas celulares de cáncer de hígado HepG2, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97H y MHCC-97L (6/9, 66,7%) después del tratamiento Aza (Figura 1B) y también en líneas celulares de cáncer de colon HT29, SW620, LoVo y RKO (4/6, 66,7%) (Figura 1B), lo que indica que es probable que FBP1 downregulated a través de la hipermetilación del promotor en el hígado y cáncer de colon humano.
(a) FBP1 expresión en líneas celulares de hígado y cáncer de colon humano y los controles normales fueron determinados por real-Time RT-PCR. GAPDH se utilizó para normalizar la cantidad de plantilla. (B) la expresión FBP1 relativa antes y después del tratamiento se determinó por Aza en tiempo real RT-PCR. GAPDH se utilizó para normalizar la cantidad de plantilla. Se ha demostrado que los cambios promedio de plegado ± SD.
metilación del promotor FBP1 en el hígado humano y colon
De hecho, uno típicos Islas CpG (CGI) fueron encontrados en los alrededores FBP1 exón 1 usando los siguientes criterios: contenido de GC & gt; 55%, Obs CpG /Exp CpG & gt; 0,65, y la longitud & gt; 500 pb (Figura 2A). El estado de metilación de esta CGI en células de cáncer de colon hígado y humanos se determinó por MSP. Como se muestra en la Figura 2B, la metilación del promotor de FBP1 se detectó fácilmente en líneas celulares de cáncer de hígado HepG2, Huh7, HCC-LM3, BEL-7402, SMMC-7721, Sk-HEP1, MHCC-97H y MHCC-97L, y de cáncer de colon humano líneas de células HT29, SW480, SW620, HCT116, LoVo y RKO. Además, BGS también reveló que el promotor FBP1 era fuertemente metiladas en HepG2, Huh7, células BEL-7402 y el tejido tumoral 8T, y no metilación se dedtected en 8N tejido no tumoral adyacente (Figura 2C).
(A ) estructura esquemática de la FBP1 CGI, con el exón 1 y la región MSP y BGS indicado. Cada línea vertical corta representa un sitio CpG. La posición de los cebadores MSP fueron marcados como flechas. El estado de metilación del FBP1 CGI se analizó por MSP (B) y BGS (C). PCR MSP = metilación específica; USP = PCR de no metilación específica. Para BGS en (C), cada círculo indica un sitio y círculos rellenos en negro representan sitios CpG metilados CpG. Una fila de círculos representa una sola colonia.
Regulación a la baja y la hipermetilación del promotor FBP1 en los tejidos tumorales primarios humanos
Para confirmar aún más la relevancia de FBP1 hipermetilación del promotor CGI en la mediación de su silenciamiento de hígado humano, gástrico y el cáncer de colon, la expresión FBP1 y la metilación del promotor en el carcinoma hepatocelular primario, los tejidos tumorales gástricas y de colon y los tejidos no tumorales adyacentes se analizaron mediante real-Time RT-PCR y MSP, respectivamente. FBP1 expresión se downregulated significativamente en 80% (8/10) de tejidos humanos de hígado de tumores, 100% (5/5) en gástrico y 80% (4/5) tejidos tumorales de colon (Figura 3A) en comparación con los tejidos no tumorales adyacentes . Además, la metilación del promotor fue detectado con frecuencia mediante el uso de MSP en muestras tumorales pero no en tejidos no tumorales (Figura 3B), lo que indica que la regulación a la baja de FBP1 participó en la carcinogénesis de hígado humano y otros cánceres digestivos.
( a) La expresión de FBP1 en los tejidos del hígado, gástrico y de tumor de colon y los tejidos no tumorales adyacentes se determinaron mediante real-Time RT-PCR. 1~10 N /T: cáncer de hígado, 11-15 T /N: cáncer gástrico, 16~20 N /T: el cáncer de colon. (B) El estado de metilación del promotor FBP1 de hígado primario, los tejidos tumorales gástricos y de colon y los tejidos no tumorales adyacentes fue detectada por MSP. Se muestran resultados representativos. 1~3 N /T: cáncer de hígado, 4~5 N /T: cáncer de colon, 6~9 N /T: cáncer gástrico. "T" indica los tejidos tumorales y "N" representa tejidos no tumorales adyacentes.
FBP1 sobreexpresión reducido de cáncer de colonias de células Habilidades de formación y inhibió el crecimiento de células de hígado y cáncer de colon
el efecto de la expresión FBP1 exógeno sobre el crecimiento de células de cáncer de hígado humano se investigó mediante un ensayo de formación de colonias monocapa. Para investigar más a fondo el papel potencial de FBP1 en la supresión tumoral, las células de cáncer de hígado SMMC-7721 y cáncer de colon SW480 se transfectó con pcDNA-FBP1 expresando vector y la capacidad de formación de colonias de células se examinó bajo la selección de G418. En comparación con células de control transfectadas con pcDNA3.1 vector vacío, células cancerosas transfectadas con pcDNA-FBP1 vector que expresa mostró disminución de la capacidad de formación de colonias (Figura 4B). Estos datos sugieren que FBP1 puede jugar un papel en la supresión tumoral. Además, FBP1 niveles de expresión estable en las células, incluyendo SW480 y SMMC-7721 también fue confirmada por tiempo real RT-PCR como se muestra en la Figura 4A.
(A) Nivel de expresión en el FBP1 SW480 transfectadas y SMMC- 7721 células fue confirmada por tiempo real RT-PCR. (B) El efecto de la expresión FBP1 ectópico en el crecimiento de células de cáncer de hígado se investigó mediante el ensayo de formación de colonias monocapa. La formación de colonias escaneada en placas de seis pocillos se muestra en el panel .. (C) El crecimiento de las líneas celulares de cáncer de colon y el hígado (SW480 y SMMC-7721) con y sin expresión FBP1 se determinó con el ensayo de crecimiento celular MTS. La expresión estable de FBP1 suprimió el crecimiento de células de cáncer de colon y del hígado. Los resultados se muestran como valores de SD ± media. Los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de Student (* p & lt; 0,05).
Cuando pcDNA-FBP1 se transfectó en células SW480 y SMMC-7721, se confirmó la función inhibidora del crecimiento de FBP1 en estas células mediante el ensayo de crecimiento celular MTS. PcDNA-FBP1 vector que expresa se transfectó en estas células, la velocidad de crecimiento de las células de cáncer de colon hígado y humanos después de FBP1 sobreexpresión se redujo drásticamente en el ensayo de crecimiento celular MTT (p & lt; 0,05; Figura 4C), que muestra un efecto de crecimiento supresores de FBP1 en las células cancerosas.
Expresión ectópica de FBP1 inducida G2-M Fase
Detención
Para determinar el mecanismo molecular por el cual FBP1 suprime la formación de colonias y la proliferación celular, se investigó el efecto de FBP1 sobre la distribución del ciclo celular . Después de propidio tinción de yoduro, célula análisis de clasificación activada por fluorescencia de FBP1 sobreexpresa SW480 y las células SMMC-7721 reveló un aumento en el número de células en fase G2-M y una disminución en el número de células en fase S (Figura 5A y 5B).
La distribución del ciclo celular de la línea celular de cáncer de colon y de hígado (SW480 y SMMC-7721) con y sin expresión FBP1 se evaluó mediante análisis de citometría de flujo. (A) y (B) de fluorescencia Representante activado por célula de análisis de las células cancerosas transfectadas con o sin FBP1 clasificación.
FBP1 La sobreexpresión intracelular Aumentado ROS Producción
Los niveles de ROS se midieron en las células de cáncer no transfectadas y transfectadas con pcDNA-FBP1 expresando vector. FBP1 expresión claramente el aumento de los niveles intracelulares de ROS exógenos en SMMC-7721 y las células SW480 (Figura 6A y 6B). Por lo tanto, FBP1 podría aumentar la producción de ROS que ejercen funciones citotóxicas y proapoptóticos y limitar la tumorigenicidad y la progresión maligna.
El efecto de la expresión ectópica FBP1 sobre el estrés oxidativo se determinó por citometría de flujo ensayo como se muestra en (A) y (B ). células estables se tiñeron con DCFH-DA y luego el estado redox de las células se midió por citometría de flujo.
Discusión
Más y más nuevos genes supresores de tumores se han encontrado para ser inactivada por la hipermetilación del promotor. metilación promotor se propone por lo tanto como un marcador importante para la identificación de nuevos genes supresores de tumores. En el presente estudio, hemos identificado que FBP1 era frecuentemente el regulado en líneas celulares de HCC 66,7% y las líneas celulares de cáncer de colon 100% (Figura 1A), y en el 80% primaria HCC, 100% de los tumores gástricos y 80 tumores% de colon (Figura 3A). La hipermetilación se detectó más en líneas celulares de HCC 66,7% y las líneas celulares de cáncer de colon 100% (Figura 2B), y también en los tejidos de tumor primario (Figura 3B). Por el contrario, FBP1 hipermetilación apenas se detectó en las líneas de células hepáticas normales y de vez en cuando en los tejidos no tumorales adyacentes apareados, lo que sugiere un papel importante de FBP1 en la patogénesis de hígado y otros cánceres digestivos. Además, demostró que el tratamiento con el reactivo de desmetilación Aza upregulated FBP1 expresión en células de cáncer expresados humilde (Figura 1B) y el estado de metilación fue verificada por secuenciación genómica, lo que indica que la hipermetilación del ADN mediada FBP1 inactivación.
En el cáncer, el dinámica de la genética y epigenética silenciamiento de genes son muy diferentes. mutación genética somática conduce a un bloque en la producción de proteína funcional a partir del alelo mutante. Si una ventaja selectiva se confiere a la célula, las células se expanden clonalmente para dar lugar a un tumor en el que todas las células carecen de la capacidad para producir la proteína. En contraste, mediada epigenetically silenciamiento de los genes se produce gradualmente. Se inicia con una disminución sutil en la transcripción, el fomento de una disminución de la protección de la isla CpG de la propagación de flanqueo heterocromatina y la metilación en la isla. Esta pérdida se traduce en un aumento gradual de los sitios CpG individuales, que varían entre las copias del mismo gen en diferentes células. Por ejemplo, se detectó alto nivel de FBP1 en células Huh7 y HCC-LM3 con alto nivel de metilación en la región promotora (Figura 1A y 2B). A pesar de que la metilación del promotor inactivada con frecuencia FBP1 en líneas celulares de cáncer de colon y de hígado humano, no podemos excluir la participación de otros mecanismos responsables de la regulación a la baja FBP1, tales como defectos en la remodelación de las histonas. Por ejemplo, en Hep3B, Huh7, HCC-LM3, SW480 y las células HCT116, promotor FBP1 no pudo ser totalmente upregulated después del tratamiento Aza (Figura 1B)
.
Además, para servir como un nuevo marcador para definir novela genes supresores de tumores, la hipermetilación del promotor también puede ser utilizado como un marcador sensible para el diagnóstico del cáncer y la predicción del pronóstico [10], [11]. Lamentablemente, por falta de un gran número de tejidos tumorales, pero no hemos podido probar FBP1 metilación en tejidos abundantes y analizar aún más su asociación con características clínicas, tales como la edad, el sexo, el grado del tumor y la tasa de supervivencia. Tuvimos que determinar la expresión FBP1 y el estado de metilación en sólo 10 pares de HCC primaria, 5 pares de tejidos tumorales gástricas y 5 pares de tejidos tumorales de colon (Figura 3), lo que sugiere que las funciones FBP1 como un nuevo candidato supresor de tumores downregulated través de la hipermetilación del promotor de cáncer de colon hígado y. Este es también el primer informe para demostrar que FBP1 es silenciado epigenético en el hígado humano y la carcinogénesis de colon. Una vez que se detectó FBP1 promotor metilación en una alta frecuencia en tejidos de carcinoma primario, pero los tejidos gástricos normales no no tumorales, FBP1 la metilación del promotor puede ser un biomarcador potencial para el diagnóstico del cáncer.
Como se muestra en la Figura 4, la restauración de FBP1 expresión marcadamente suprimió el crecimiento las células cancerosas. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo molecular subyacente responsable de FBP1 funciona como un supresor de tumores. Se ha comprobado [4] que funciona FBP1 a antagonizan la glucólisis. Como es bien sabido, las células cancerosas tienen una mayor tasa de glucólisis aeróbica, pero no la fosforilación oxidativa. La fructosa-1,6-bisfosfato es uno de los intermedios más importantes de la glucólisis y su nivel se controla principalmente por fructosa-6-fosfato quinasa y bisfosfatasa fructosa-1,6-. Se encontró que la producción de lactato después de la expresión FBP1 se redujo significativamente, lo que demuestra la supresión de la glicolisis aerobia por FBP1. Además, punto de control son importantes mecanismos de control que aseguren la correcta ejecución de los eventos del ciclo celular. La supresión del crecimiento inducida por la expresión ectópica FBP1 parece ser causada por la detención del ciclo celular desde el número de células con un bloqueo del ciclo celular (G2-M fase de la detención) se aumentó después de FBP1 re-expresión (Figura 5)
.
Durante mucho tiempo, se consideró ROS oncogénica ya que estaba implicado en la progresión del cáncer y la metástasis. estrés oxidativo persistente se ha asociado con carcinoma de mama y de muchos cánceres epiteliales como el de colon y cuello [12]. Sin embargo, numerosos estudios han demostrado la participación causal de la formación de ROS en la mediación de la apoptosis de células de cáncer inducida por diversos agentes quimioterapéuticos estándar, incluyendo paclitaxel, cisplatino, bortezomib y etopósido. Sorprendentemente, se ha demostrado que apoptogenicity cisplatino depende de la formación de ROS y se produce independientemente de daño en el ADN nuclear, lo que sugiere que el estrés oxidativo apoptogenic es el mecanismo crucial de la muerte de células cancerosas inducida por cisplatino [13]. Además de causar la detención del ciclo celular en la fase S, lo más importante en este estudio, el efecto inhibidor del crecimiento de FBP1 como un supresor de tumor también puede ser mediada a través de la mejora de la producción de ROS intracelular (Figura 6). Nuestros resultados fueron consistentes con los datos publicados previamente [8] que muestra la fructosa-1,6-bisfosfatasa media las respuestas celulares a daño en el ADN y el envejecimiento en Saccharomyces cerevisiae. Pero cómo ROS ejercen citotóxica y funciones proapoptóticos que limitarían la tumorigenicidad y la progresión maligna, se propuso que los cambios en la homeostasis redox celular y los niveles de ROS afectarán viabilidad través de la modulación redox de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial que conduce a la liberación del citocromo C, apoptosome montaje, y la activación de las caspasas verdugo, si los niveles de ROS celulares alcanzan un cierto umbral incompatible con la supervivencia celular [7], [14].
en resumen, hemos encontrado que FBP1 frecuencia se reduce por la hipermetilación del promotor en la mayoría de hígado y colon líneas celulares de cáncer y tejidos tumorales primarios. Nuestros resultados sugieren que la inactivación epigenética de FBP1 fue un factor importante en el hígado humano y la carcinogénesis de colon. Se demostró además que el silenciamiento mediado por la hipermetilación del promotor de FBP1 podría invertirse por desmetilación farmacológico y restauración de FBP1 suprimió el crecimiento de células tumorales a través de la inducción de G2-M detención del ciclo celular de fase y un aumento en la generación de ROS. Por lo tanto, será valioso para explorar la posible aplicación de FBP1 como marcador molecular para la detección y el tratamiento de estos tumores malignos.
Reconocimientos
Agradecemos al Sr. Wang Cheng útil para el debate y técnico asistencia. También damos las gracias al Sr. Jiang Jiukun para proporcionar líneas celulares de HCC MHCC-97H y MHCC-97L y el Dr. Chen Qian para proporcionar tejidos gástricas y cáncer de colon humano.