Extracto
Antecedentes
Recientemente, se ha renovado el interés en la relación entre el colesterol y el cáncer de próstata. Se ha informado anteriormente que
in vitro
, las células del cáncer de próstata carecen de regulación de la retroalimentación esterol mediada por el factor de transcripción importante en la homeostasis del colesterol, de unión al elemento regulador de esteroles-2 de proteínas (SREBP-2). Esto podría explicar la acumulación de colesterol observada en los cánceres de próstata clínicos. En consecuencia, la regulación por retroalimentación perturbado a un aumento de los niveles de esterol se ha convertido en un concepto generalizado en el entorno del cáncer de próstata. En este caso, el objetivo fue explorar esto en mayor profundidad.
Metodología /Principales conclusiones
Después de alterar el estado de colesterol celular en células LNCaP y PC-3 con cáncer de próstata, se analizó el procesamiento de SREBP-2, efectos aguas abajo sobre la actividad del promotor y la expresión de genes SREBP-2 de destino, y la actividad funcional (la captación de lipoproteína de baja densidad, la síntesis de colesterol). Al hacerlo, se observó que las células LNCaP y PC-3 fueron sensibles a aumento de los niveles de esterol. En contraste, la reducción de los niveles de colesterol a través de tratamiento con estatinas generan una mayor respuesta en las células LNCaP de células PC-3. Esto pone de relieve una diferencia importante entre estas líneas celulares: la actividad basal de SREBP-2 parece ser mayor en las células PC-3, la reducción de la sensibilidad a la disminución de los niveles de colesterol
Conclusión /Importancia
Por lo tanto,. las células de cáncer de próstata son sensibles a los cambios en los niveles de esteroles
in vitro
, pero el alcance de este reglamento se diferencia entre el cáncer de próstata líneas celulares. Estos resultados arrojan nueva luz sobre la regulación del metabolismo del colesterol en dos líneas celulares de cáncer de próstata de uso común, y hacer hincapié en la importancia de establecer si es o no la homeostasis del colesterol es perturbado en el cáncer de próstata
in vivo
.
Visto: Krycer JR, Kristiana I, Brown AJ (2009) la homeostasis del colesterol en dos líneas celulares de cáncer de próstata humano más utilizadas, LNCaP y PC-3. PLoS ONE 4 (12): e8496. doi: 10.1371 /journal.pone.0008496
Editor: Immo A. Hansen, de la Universidad Estatal de Nuevo México, Estados Unidos de América
Recibido: 26 Octubre, 2009; Aceptado: 3 de diciembre de 2009; Publicado: December 30, 2009
Derechos de Autor © 2009 Krycer et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación de la AJB con el apoyo de una beca de la Fundación de cáncer de próstata de Australia (PR36, http://www.prostate.org.au). JRK es el beneficiario de la beca de la Fundación Petre (http://www.petrefoundation.org.au). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El estudio de la homeostasis del colesterol en un ajuste de cáncer de próstata (CaP) comenzó en 1942, cuando se publicó Swyer
In situ
hallazgos de niveles elevados de colesterol en la hiperplasia prostática benigna en comparación con el tejido normal [1] . Más recientemente, ha habido un renovado interés en los vínculos entre el colesterol y CaP [2] - [4]. Por ejemplo, se ha propuesto que una comprensión en profundidad de la regulación del colesterol en la progresión del CaP puede conducir al desarrollo de nuevas dianas farmacológicas [5]. En línea con esto, varios estudios epidemiológicos han mostrado una asociación entre el uso de estatinas (fármacos para reducir el colesterol) y un menor riesgo de CaP avanzado (revisado en [2] - [4]).
El colesterol tiene una importante influencia en la integridad de la membrana, de señalización, y el metabolismo, y por lo tanto hay una necesidad de regular sus niveles dentro de la célula [2]. Una de las principales mecanismo homeostático se produce a nivel de la transcripción, a través del factor de transcripción principal: esterol regulador elemento de unión a la proteína 2 (SREBP-2). La regulación de este factor de transcripción ha sido revisado por Brown y Goldstein [6]. Brevemente, SREBP-2 se sintetiza como un precursor, unido al retículo endoplásmico (ER). Cuando los niveles de colesterol son bajos, SREBP-2 es transportado desde la sala de emergencias en el aparato de Golgi, donde se procesa para liberar el dominio N-terminal. Esta forma madura de SREBP-2 migra hacia el núcleo, donde se regula por incremento genes cholesterogenic, tales como los que codifican el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) y la coenzima 3-hidroxi-3-metilglutaril A reductasa (HMGCR). Esto promueve la absorción y síntesis de colesterol hasta que los niveles de colesterol son suficientes, después de lo cual se retiene SREBP-2 en el ER, impidiendo su activación y la regulación negativa de este modo la expresión de genes objetivo. Este mecanismo de retroalimentación esterol dependiente también regula las isoformas SREBP-1a /c. En general, SREBP-1c regula al alza preferentemente genes grasos de relacionados con el ácido, SREBP-2 objetivos genes relacionados con el colesterol, y SREBP-1a puede activar tanto [7], [8].
Se ha sugerido que que esta regulación por retroalimentación de SREBP-2 carece de CaP, a través de la observación de que el tratamiento con esteroles reduce la expresión de genes SREBP-2 de destino, así como lipoproteína de captación de baja densidad (LDL), en las células normales pero no en PC-3 y células DU145 EG
in vitro
[9]. Las perturbaciones en la retroalimentación de esteroles mediada explicarían la acumulación de colesterol en las muestras de CaP [10], [11], y se ha convertido en un concepto ampliamente aceptado en el entorno CaP (revisado en [3], [4]). Esta desregulación implica que las células de CaP, y tal vez las células de cáncer en general (por ejemplo, [9], [12] - [15]), son un caso especial, ya que no se ajustan al paradigma que tengan en cautiverio de la homeostasis del colesterol celular [dieciséis]. Una acumulación de colesterol dentro de la célula sería, por ejemplo, endurecer la membrana mitocondrial, la reducción de la fosforilación oxidativa - esto promueve la glucólisis, incluso en presencia de oxígeno (el efecto Warburg [17]), un fenotipo metabólico comúnmente observado en células de cáncer y de gran interés en la investigación del cáncer [18]
.
El objetivo de nuestra investigación fue explorar la regulación del colesterol en mayor profundidad en dos CaP líneas celulares de uso común, PC-3 y LNCaP, usando una variedad de condiciones y enfoques. Hemos tratado de confirmar los resultados anteriores de la actividad de SREBP-2 siendo afectada por los esteroles [9], y determinar si esto afecta a la desregulación de la respuesta de las células de CaP a niveles bajos de esteroles. A partir de nuestros resultados, proporcionamos una nueva perspectiva sobre la homeostasis del colesterol en estas líneas celulares de CaP, que tiene implicaciones tanto para los experimentos de laboratorio y terapia de CaP.
Resultados
regulación mediada por esteroles de SREBP-2 genes diana existe en las células de cáncer de próstata
Para examinar la regulación de esteroles de SREBP-2 en el primer caso, se analizó la expresión de mRNA de dos SREBP-2 genes diana (
LDLR
,
HMGCR
) al manipular el estado de colesterol de las células LNCaP PC-3 y. Los experimentos se realizaron en condiciones deficiente en lipoproteína (con suero de ternera fetal deficiente en lipoproteína [FCLPDS]) para aumentar los efectos de tratamiento de las células con 25-hidroxicolesterol (25-HC), un derivado de colesterol oxigenada (oxysterol), y LDL. LDL colesterol entrega a través de la LDLR, presentando una alternativa fisiológica para aumentar los niveles de esteroles intracelulares.
Si la regulación de SREBP-2 está presente, la adición de esteroles, a través de cualquiera de los tratamientos 25-HC o LDL, reduciría SREBP 2 procesamiento y SREBP-2 expresión del gen diana. Por otro lado, la compactina estatina (también conocido como mevastatina) inhibe HMGCR, que cataliza un paso limitante de la velocidad en la síntesis de colesterol, y por lo tanto debe aumentar la actividad SREBP-2. Las líneas de células no cancerosas, las células prostáticas epiteliales (PrEC) y fibroblastos (FB), sirvieron como control, lo que demuestra que ambas formas de regulación de la retroalimentación (fig. 1A). la regulación de esteroles mediada similar se observó también en las líneas de células-PCA (Fig. 1A), en contra de los resultados anteriores [9].
Las células fueron tratadas con la compactina estatina (PCN, 5 M), 25 oxysterol -HC (1 mg /ml), o LDL (50 mg /ml) durante 24 h. El ARN celular se cosechó y la expresión de mRNA de los
LDLR
y
HMGCR
genes se analizó mediante qRT-PCR. Los niveles de mRNA fueron hechas con respecto a la condición del vehículo, como se describe en Materiales y Métodos. Los datos son la media ± SEM, de 3 experimentos independientes para cada línea celular. Cada experimento se realizó con pocillos por triplicado por condición. (A) Los datos presentados por separado para cada línea celular. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, de dos muestras
t-test
frente al estado del vehículo. (B) Los datos de (A) se ha sobrepuesto para cada gen, representada como media ± SEM para cada punto de datos. Las líneas celulares de CaP están representados por líneas continuas, mientras que los no-PCA líneas celulares están representados por líneas discontinuas.
En las células PC-3, lo que aumenta el estado de esterol celular con 25-HC o LDL redujo significativamente la expresión de genes lipogénica, en comparación con el estado del vehículo (Fig. 1A). La similitud entre las células tratados con vehículo y compactina-PC-3 es poco probable debido a la resistencia a la compactina, ya que se encontró que la compactina inhibe la síntesis de colesterol en PC-3 células por marcaje metabólico (datos no mostrados). Por el contrario, la compactina aumentado significativamente la expresión de genes lipogénica en las células LNCaP y células LNCaP de esterol tratados tenían patrones de expresión similares a las células tratadas con vehículo (Fig. 1A). La superposición de los datos de expresión de ARNm relativos de cada línea celular (Fig. 1B) mostró que las células de CaP (líneas continuas) tenían una respuesta reducida a la compactina comparación con las células PrEC, y se ven menos afectados por LDL que ambas líneas celulares no CaP . Sin embargo, estas líneas celulares de CaP eran sensibles a los cambios en el estado de colesterol.
regulación de esteroles mediada es específico de SREBP-2
Dado que la expresión de dos genes SREBP-2 objetivo (
LDLR
,
HMGCR
) respondieron de manera similar a los cambios de estado de colesterol (Fig. 1), se buscó una evidencia más directa de que este efecto es mediado por el factor de transcripción SREBP-2.
Desde maduros SREBP-2 se une al elemento de esterol de regulador (SRE) dentro de la región promotora de un gen diana, hemos desarrollado un ensayo de luciferasa-SRE específica, utilizando el LDLp-588luc plásmido [19], que codifica la luciferasa de luciérnaga bajo el transcripcional la regulación de la
LDLR
promotor. El uso de mutagénesis dirigida al sitio, se interrumpió el SRE dentro de la región del promotor para generar un plásmido de control negativo, LDLp-mutSRE. Se encontró que el promotor de tipo salvaje (LDLp-588luc) mostraron los cambios previstos en la actividad de luciferasa (aumentando con el tratamiento compactina, disminuyendo con 25-HC o tratamiento LDL), mientras que el promotor mutante (LDLp-mutSRE) produjo cambios insignificantes (Fig . S1). El promotor de la actividad de la luciferasa mutante se restó de la del promotor de tipo salvaje para cada condición de tratamiento para obtener la actividad SRE específica. Este ensayo de luciferasa reveló que la regulación por retroalimentación se produjo en células de CaP en respuesta a los niveles de colesterol alterados (Fig. 2A).
Las células (A) se transfectaron como se describe en Materiales y Métodos. El tratamiento incluyó la compactina estatina (CPN, 5 M), oxysterol 25-HC (1 mg /ml), o LDL (50 mg /ml) durante 24 h. Se determinó la actividad de luciferasa SRE-específico como se describe en Materiales y Métodos, y se normalizaron a la condición del vehículo. Los valores de tipo salvaje y mutante del promotor se muestran en la Fig. S1. Los datos son la media ± SEM, de 3 experimentos independientes para cada línea celular. Cada experimento se realizó con pocillos por triplicado por condición. *
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t-test
frente al estado del vehículo. (B) Los datos de (A) se ha sobrepuesto, representada como media ± SEM para cada punto de datos. Las líneas celulares de CaP están representados por líneas continuas, mientras que los no-PCA líneas celulares están representados por líneas de trazos. (C) Las células se trataron con CPN (5 mM) o 25-HC (1 mg /ml) durante 24 h. Los lisados celulares se sometieron a SDS-PAGE y transferencia Western con el anticuerpo IgG-1C6 anti-SREBP-2. El producto de escisión C-terminal de SREBP-2, SREBP-2 (C), se marca con una flecha - se supone que la banda de abajo es una banda no específica. El sondeo de α-tubulina sirvió como control interno de carga. La mancha se muestra es representativa de al menos 2 experimentos separados para cada línea celular.
En las células LNCaP, la actividad SRE-específica (Fig. 2A) apareció más sensible que la expresión de genes SREBP-2 objetivo ( Fig. 1) para esterol tratamiento. En consecuencia, la superposición de los datos de cada línea celular (Fig. 2B) reveló que cada línea celular se vio afectado de manera similar por tratamiento de esterol. En contraste, el tratamiento compactina volvió a demostrar que PC-3 y las células LNCaP difieren en la medida de sus respuestas homeostáticas: actividad SRE-específica se incrementó en gran medida en las células LNCaP en comparación con los no-PCA líneas celulares (líneas de puntos), en contraste con las células PC-3 (Fig. 2B). Curiosamente, en las células PrEC, la respuesta a la compactina (Fig. 2A) fue mitigado en comparación con SREBP-2 expresión del gen diana (Fig. 1A). Esto sugiere que otros factores de transcripción pueden alterar los efectos de SREBP-2 sobre la expresión del gen diana, lo que justifica el uso del ensayo de luciferasa-SRE específica.
Sin embargo, la isoforma de SREBP-1a también se une a los mismos como ERE SREBP-2 con una afinidad fuerte [7], lo que podría confundir los resultados. Por lo tanto, hemos probado si este efecto fue SREBP-2-específica por Western Blot. Puesto que el anti-SREBP-2-anticuerpo IgG 1C6 se une a la C-terminal [20], se detecta el producto de escisión C-terminal, dando una indicación de procesamiento de SREBP-2. Por ejemplo, los esteroles promoverían la retención de SREBP-2 precursor en el ER [21], la reducción de SREBP-2 escindido. Se encontró que el 25-HC reduce SREBP-2 escisión en todas las líneas celulares de próstata tres, mientras que el aumento de compactina SREBP-2 de escisión en las células PREC y LNCaP, pero no en las células PC-3 (Fig. 2C). Por lo tanto, el grado de procesamiento de SREBP-2 se correlacionó con la regulación de la actividad del promotor (Fig. 2A, B) y SREBP-2 expresión del gen diana (Fig. 1) se observa en estas líneas celulares de CaP. En general, estos datos muestran que las células PC-3 y LNCaP son ambos sensibles a esteroles, pero difieren en sus respuestas a compactina tratamiento.
cambios en la actividad SREBP-2 se traducen en el nivel funcional en células de CaP
Para ver si la regulación transcripcional ejerce efectos homeostáticos en el metabolismo del colesterol en células de CaP, se examinaron los efectos de la alteración de estado de esteroles en la actividad LDLR y la síntesis de colesterol.
La actividad de LDLR se determinó mediante un ensayo de captación de LDL . Después de la incubación con DiI-LDL (LDL marcada con el colorante fluorescente DiI), la fluorescencia posterior de las células proporciona una indicación de la absorción de LDL. Desde LDL se internaliza a 37 ° C, pero no 4 ° C [22], cada experimento se realizó dos veces al mismo tiempo, con un conjunto de células incubadas con DiI-LDL a 37 ° C y el otro a 4 ° C - la diferencia de de fluorescencia entre los dos conjuntos proporcionan una medida de internalizado DiI-LDL. Esto también controlada por la unión no específica de Dil-LDL. Este ensayo reveló que, con relación al estado del vehículo, 25-HC causó una disminución significativa en la internalización DiI-LDL en todos los tipos de células (Fig. 3A). Por el contrario, compactina aumento de la actividad en las células LNCaP LDLR solamente, que no tiene efecto significativo en las células PREC y causando una disminución (aunque no significativa,
p
= 0,08) en las células PC-3 (Fig. 3A).
las células fueron tratadas con la compactina estatina (CPN, 5 mM) o la oxysterol 25-HC (1 mg /ml) durante 24 h en medio C. se prepararon células (a), se trató, y se ensayaron para DiI internalización -ldl como se describe en Materiales y Métodos. La cantidad de DiI-LDL internalizado proporciona una indicación de la actividad de LDLR. Los datos se presentan como media + SEM, de al menos 3 experimentos independientes para cada línea celular. Cada experimento se realizó con pocillos por triplicado por condición. (B) Después del tratamiento, las células se lavaron con PBS y radiomarcado con [1-
14C] -ácido acético durante 2 h. El radiomarcado se realizó en presencia de tratamiento, con la excepción del tratamiento PCN (en cuyo caso el CPN estaba ausente). Las células fueron cosechadas y extractos de lípidos se sometieron a cromatografía en capa fina y phosphorimaging como se describe en Materiales y Métodos. Los phosphorimages mostrados son representativos de al menos 3 experimentos independientes para cada línea celular. La densitometría se realizó y los datos presentan como media + SEM para cada línea celular. *
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p
. & Lt; 0,01, de dos muestras
t-test
frente al estado del vehículo
para determinar la síntesis de colesterol, las células fueron radiomarcado después del tratamiento. El tratamiento de 25-HC se mantuvo durante el radiomarcado, mientras que el tratamiento de compactina se retiró - desde compactina reduciría la síntesis de colesterol, que en lugar de intentar simular la 'efecto rebote estatina' [23]. Este fenómeno es una respuesta homeostática al compactina: normalmente, la compactina aumenta SREBP-2 de procesamiento (Fig 2B.), La regulación positiva de la expresión de las enzimas sintéticas de colesterol. En consecuencia, cuando compactina se elimina, debido a los altos niveles de enzimas presentes, habrá un flujo grande a través de la vía. Este irónicamente provoca un aumento agudo en los niveles de colesterol. Esto se puede observar en PREC y LNCaP células (Fig. 3B). Sin embargo, el tratamiento previo compactina reduce sorprendentemente la síntesis de colesterol durante el radiomarcaje en células PC-3 (Fig. 3B). A pesar de esto, 25-HC abolió la síntesis de colesterol en las tres líneas celulares (Fig. 3B).
Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la regulación de tanto la absorción de colesterol (por medio de LDL) y la síntesis son sensibles a los niveles de esterol en células de CaP.
basal actividad de SREBP-2 es mayor en las células PC-3 que en las células LNCaP
Mientras tanto en PC-3 y LNCaP líneas celulares son esteroles sensible, SREBP-2 actividad en las células PC-3 apareció menos sensible a los niveles de colesterol en posición baja (compactina tratamiento, Figs. 1, 2). Estos experimentos se llevaron a cabo en condiciones deficiente en lipoproteína (Medio C), mientras que un aumento de dos veces en la actividad SRE-específica se observó con el tratamiento compactina (en relación con el tratamiento con vehículo) en condiciones de suero completo (Fig. 4). Esto sugiere que en las células PC-3, el efecto de la compactina es enmascarado por "saturación" de procesamiento de SREBP-2 en medios de comunicación deficiente en lipoproteína, de manera que más privación de colesterol a través de tratamiento compactina tendría poco efecto. Esto implica, además, que las células PC-3 no son insensibles a la compactina
per se
, pero requieren menos privación de esteroles para maximizar SREBP-2 la actividad en comparación con otras líneas celulares, incluyendo las células LNCaP.
células PC-3 se transfectaron como se describe en Materiales y Métodos. El tratamiento incluyó la compactina estatina (CPN, 5 M) o oxysterol 25-HC (1 mg /ml) durante 24 h, ya sea en suero completo (Medio A) o suero deficiente en lipoproteína (Medio C). Se determinó la actividad de luciferasa SRE-específico como se describe en Materiales y Métodos, y se normalizaron a la condición del vehículo. Los datos son la media ± SD, representativo de 2 experimentos separados. Cada experimento se realizó con tres pozos por condición.
Esta diferencia importante entre las células LNCaP y PC-3 se siguió examinando. Como estudio de caso, la regulación de línea de base y la actividad de LDLR se consideraron en condiciones deficientes de lipoproteínas, a partir de experimentos descritos en las figuras 1-3. En primer lugar, se consideró los datos de expresión de ARNm: el? C
valores de t para un umbral de 10 unidades de fluorescencia normalizados
-1.5 se compararon entre las células LNCaP PC-3 y. Los C
valores de t para la limpieza de genes, porfobilinógeno desaminasa (
PBGD
), fueron similares entre las dos líneas celulares (
p
≈0.73), lo que justifica esta comparación. El promedio
LDLR
? C
t valor fue de ~ 2 unidades inferiores en PC-3 células, lo que indica un 4 veces mayor basal
LDLR
la expresión de ARNm de células LNCaP (Fig. 5A) . Posteriormente, la actividad basal LDLR también fue significativamente mayor en células PC-3 (Fig. 5B).
Los datos se agruparon de experimentos en los que LNCaP y PC-3 células recibieron tratamiento con vehículo en Medio C durante 24 h. (A) Para cada experimento QRT-PCR, el? C
valores t (para el umbral = 10 unidades de fluorescencia normalizados
-1.5) para el
LDLR
gen, en relación con el
PBGD
limpieza de genes, se consideraron. Expresión se representa como un cambio veces (en relación con células PC-3), por el que un aumento de una unidad en? C
T da como resultado una disminución de dos veces en la expresión de mRNA. Los datos se presentan como media + SEM, de al menos 4 experimentos independientes para cada línea celular. (B) la captación de LDL Raw, medida como la fluorescencia normalizado por el contenido de proteína en el ensayo de captación de LDL, se promedió entre los experimentos y hecho en relación con las células PC-3. Los datos se presentan como media + SEM, de al menos 3 experimentos independientes para cada línea celular. (C) Para cada ensayo de luciferasa-SRE específica, la luciérnaga /
Renilla
relaciones de luciferasa generados a partir del plásmido LDLp-mutSRE se normalizaron a la del plásmido LDLp-588luc. Los datos presentan como media + SEM, de al menos 5 experimentos independientes para cada línea celular. Cada experimento en (A) - (C) se realizó con pocillos por triplicado por condición. *
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p Hotel & lt; 0,01, de dos muestras
t-test
frente a células PC-3. (D) Un modelo que representa las diferencias en la homeostasis del colesterol entre las células LNCaP PC-3 y. El nivel de umbral de colesterol celular, en el que se reduce drásticamente la actividad de SREBP-2, puede ser mayor en células PC-3. Esto reduciría el efecto de las estatinas, relativa a la condición basal.
Junto con la Fig. 2C, esto implica que la actividad basal SREBP-2 es mayor en células PC-3. Sin embargo, otros factores de transcripción también pueden contribuir a la expresión de genes SREBP-2 objetivo. Por lo tanto, se volvieron a analizar los experimentos anteriores luciferasa SRE-específicas. Para el estado del vehículo, la actividad relativa de luciferasa generada por el LDLp-mutSRE (SRE mutado en
LDLR
promotor) se consideró como una proporción de la de LDLp-588luc (de tipo salvaje
LDLR
promotor) . se supone que la actividad de la luciferasa mutSRE-Fluc para representar la actividad no SRE desde compactina y 25-HC tratamiento tuvo poco efecto sobre la actividad LDLp-mutSRE en todas las líneas celulares (Fig. S1). La proporción mutSRE-Fluc /LDLR-Fluc fue mayor en las células PC-3 que las células LNCaP (Fig. 5C), lo que implica otros factores de transcripción también pueden contribuir a las diferencias en
LDLR
la expresión de ARNm observadas entre estos por células líneas (Fig. 5A). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la actividad basal aguas abajo de SREBP-2 está regulada positivamente en las células PC-3, lo que resulta en una respuesta máxima en condiciones basales.
Discusión
En esta investigación, se buscó para profundizar en la homeostasis del colesterol celular en la configuración del CP. Una retroalimentación en respuesta aberrante a los esteroles parece ser un fenómeno común en las células del cáncer [9], [12] - [15] y que explicaría la acumulación de colesterol en el CaP clínica [10], [11]. Nuestros hallazgos sugieren que el procesamiento de esteroles regulados de SREBP-2 existe en células de CaP (Fig. 2C). En consecuencia, la regulación por retroalimentación de esterol tenía efectos aguas abajo en el SRE (Fig. 2B), en la expresión de genes SREBP-2 diana (Fig. 1B), y en el nivel funcional (Fig. 3). También se consideró la respuesta de estas células a niveles reducidos de esterol, encontrando que las células PC-3 y LNCaP difieren en sus niveles de regulación (Fig. 5).
En las células PC-3, esteroles causó una disminución significativa en la actividad de SREBP-2, en conflicto con los resultados anteriores [9]. Además de las consideraciones metodológicas, como cuantitativa en comparación con los métodos semi-cuantitativos de determinación del ARNm, otros factores pueden explicar la discrepancia con sus hallazgos. Por ejemplo, se ha demostrado que las células de adenocarcinoma de colon no se vieron afectados por los esteroles a densidades más altas, pero demostraron regulación por retroalimentación cuando se siembran a densidades más bajas [14]. Las células en densidades más bajas están creciendo exponencialmente, con altas tasas de absorción de colesterol y de síntesis que se encuentran tanto en las células cancerosas y las normales [14], [24]. Esto podría permitir la conciliación de los resultados aquí con los del estudio anterior [9], sobre todo porque sus experimentos se realizaron para una mayor duración (30 y 45 h, frente a las 24 h aquí). Hacemos enchapado en células PC-3 a baja densidad, para evitar overconfluence a las 48 h, y encontramos la sensibilidad a los esteroles hasta 48 h (Fig. S2).
Del mismo modo, se encontró que los esteroles para reducir la actividad de SREBP-2 en células LNCaP (Fig. 2). Aquí, hubo una ligera disminución de la SREBP-2 expresión del gen diana (Fig. 1), mientras que la absorción de colesterol y síntesis se abolió (Fig. 3). Esto es apoyado por una anterior conclusión de que los esteroles regulados a la baja la expresión de la HMG-CoA sintasa, otro SREBP-2 de destino, en las células LNCaP [25]. Por lo tanto, células de CaP son de hecho sensible a un aumento de los niveles de esterol. Esto no niega la idea de perturbado esterol-retroalimentación en células de CaP, sino que plantea más preguntas: ¿De CaP laboratorio líneas celulares se acumulan colesterol como se ve en el CaP clínico [10], [11]? ¿Le células de CaP ser menos sensibles a los esteroles en un
in vivo
contexto, como en xenoinjertos? Claramente, este objeto de nuevas investigaciones.
También examinamos la situación inversa, lo que reduce los niveles de colesterol utilizando el compactina estatina. De manera similar a las células PrEC, este aumento de la actividad SREBP-2 (Fig. 2), el aumento de SREBP-2 expresión del gen diana (Fig. 1), y se indujo un efecto estatina-rebote en la síntesis de colesterol (Fig. 3B) en células LNCaP. Curiosamente, la compactina no afectó a la actividad de LDLR en las células PrEC (Fig. 3A), mientras que se ha propuesto que las estatinas reducen los niveles de colesterol en la sangre mediante el aumento de la expresión de LDLR (visto aquí en la Fig. 1A) y por lo tanto la absorción de LDL [26]. Esta aparente paradoja se puede explicar ya que PCSK9 (proproteína convertasa subtilisina /kexina tipo 9), otro SREBP-2 objetivo, se ha encontrado para promover la degradación del LDLR, que limita la eficacia de las estatinas [27], [28]. células LNCaP parecen pasar por alto este mecanismo de regulación (Fig. 3A), lo que demuestra una mayor actividad en el tratamiento LDLR compactina. En general, esto demuestra que las células LNCaP responden a los bajos niveles de esterol.
En contraste, la compactina no causó un aumento significativo en la expresión de genes SREBP-2 objetivo (Fig. 1) en células PC-3, con relación a la el estado del vehículo. Compactina se confirmó para inhibir la síntesis de colesterol mediante marcaje metabólico. Por lo tanto, es probable que la falta de efecto compactina debido a casi máxima de procesamiento de SREBP-2 de la incubación en los medios de comunicación deficiente en lipoproteína (Fig. 4). Apoyando esto, los niveles basales de SREBP-2 procesada parecen ser más alto en las células PC-3 (Fig. 2C), y la expresión y la actividad LDLR basal fueron mayores en PC-3 que las células LNCaP (Fig. 5A, B). De este modo, PC-3 células requieren menos privación de esteroles con el fin de invocar una respuesta máxima de la vía SREBP-2. Además, el tratamiento compactina tendía a reducir la actividad de LDLR (Fig. 3A) y la síntesis de colesterol pretratamiento rebajado (Fig. 3B), por razones que son claro en la actualidad.
Por lo tanto, las células PC-3 y LNCaP varían en su colesterol homeostasis. Radhakrishnan
et al.
[29] proponer un "control del interruptor-como" de la actividad de SREBP-2, en el que una fuerte caída en el procesamiento de SREBP-2 se produce cuando intracelular (ER) los niveles de colesterol alcanzan un umbral preciso. Proponemos que esta 'calibre regulador "es mayor en las células PC-3 (Fig. 4D), lo que representa 1) las células PC-3 que tienen mayor SREBP-2 que las células LNCaP, 2) las estatinas que parece tener poco efecto basal en PC- 3 células (en relación con la condición basal), y 3) la reducción de la actividad de esteroles SREBP-2 en ambas líneas celulares de PCA.
Esta diferencia en la regulación del colesterol puede atribuirse a otras diferencias fenotípicas entre estas líneas celulares, tales como la capacidad de respuesta de andrógenos. células LNCaP se sensibles a los andrógenos [30], mientras que células PC-3 son relativamente independiente de andrógenos [31]. Los andrógenos se han demostrado para regular al alza la expresión de SCAP, aumentando posteriormente SREBP-2 de activación [32]. Dado que la falta de regulación de la retroalimentación se observó anteriormente en los CaP líneas de células independientes de andrógenos (PC-3, DU145) [9], se ha argumentado que interrumpió la retroalimentación de esteroles puede estar asociada con la privación de andrógenos debido SREBP-2 fue aumentada en xenoinjertos LNCaP
in vivo
sobre la castración de acogida [33]. Sin embargo, esto no puede conciliarse con nuestros resultados, ya que se encontraron células PC-3 para ser esterol sensible aquí. Sin embargo, un factor implicado en la independencia androgénica puede favorecer las células PC-3, lo que podría elevar la línea de base la actividad de SREBP-2. Alternativamente, otros factores de transcripción pueden contribuir a la expresión de genes SREBP-2 objetivo (Fig. 5C), tales como la oncostatina M unión a la SIRE (elemento de respuesta a esterol-independiente) dentro de la
LDLR
promotor [34], aumentando el metabolismo del colesterol basal en las células PC-3. Se necesitan más investigaciones para delinear los mecanismos precisos por los cuales la homeostasis del colesterol es diferente en estos CaP líneas celulares - a la luz de esto, un trabajo reciente ha reportado diferencias en el perfil transcripcional entre células LNCaP y PC-3 [35], si bien no están directamente relacionados con la homeostasis del colesterol.
por lo tanto, nuestros resultados apoyan la afirmación de que estas dos líneas celulares no pueden ser tratados como ejemplos sinónimo de CaP líneas celulares de
in vitro
estudios en [35], [ ,,,0],36]. Sin embargo, es difícil relacionar estos hallazgos con un entorno clínico, ya que, a lo mejor de nuestro conocimiento, ningún estudio ha examinado la regulación mediada por esteroles de SREBP-2 y el metabolismo del colesterol en las células aisladas de muestras de próstata. Además, ha habido informes contradictorios sobre el perfil de expresión de CaP en un contexto relacionado con esteroles. Por ejemplo, en estudios recientes examinar el perfil cambiante con la progresión de la metástasis, estado refractario a las hormonas: algunos estudios encontraron un aumento en la expresión de SREBP-2 [37] y esterol biosintética [38] genes, mientras que otro encontró una disminución [ ,,,0],39]. Estos conflictos pueden deberse a diferencias en las poblaciones de pacientes, preparación de muestras, o plataformas de microarrays (revisado en [40]).
Sin embargo, se ha argumentado que las células LNCaP son más característicos de CaP clínico que las células PC-3 [41], [42]. Por lo tanto, los resultados aquí pueden tener ramificaciones clínicas: en particular, las células LNCaP tienen actividad LDLR mayor en respuesta a la compactina tratamiento. Esto sugiere que el tratamiento con un fármaco reductor del colesterol (tal como una estatina) puede inducir la captación de LDL específicamente en células de CaP. Esto implica que la administración simultánea de dichos agentes quimioterapéuticos específicos de tumores, incorporado en el colesterol LDL o otras vesículas LDLR de unión [43], [44], puede proporcionar una opción de tratamiento potencial para el CaP.
Materiales y Métodos
Materiales
PrEC células humanas no cancerosas se obtuvieron de Lonza (Mt Waverley, Vic, UA), las células de prepucio humano FB fueron un regalo del Dr Ingrid Gelissen (Universidad de Nueva Gales del Sur, AU)