Extracto
El gen supresor de tumores APC es frecuentemente mutado en el cáncer colorrectal humano, con mutaciones sin sentido que representa el 30% de todas las mutaciones en este gen. Reintroducción del gen APC WT en células de cáncer en general, reduce la tumorigenicidad o induce la apoptosis. En este estudio, hemos explorado la posibilidad de utilizar drogas para inducir prematuro codón de terminación (PTC) de lectura completa (aminoglucósidos, negamycin), como medio de reactivar endógena APC. Cuantificando la lectura completa de 11 mutaciones sin sentido en APC, hemos sido capaces de identificar a los que dan los niveles más altos de lectura completa después del tratamiento. Por estas mutaciones, hemos demostrado que aminoglucósido o tratamiento negamycin condujeron a una recuperación de la actividad biológica de APC en líneas celulares de cáncer, y mostraron que el nivel de la actividad de APC era proporcional al nivel de readthrough inducida. Estos resultados muestran que el tratamiento con inductores de readthrough debe ser considerada como una estrategia potencial para el tratamiento de los cánceres causados por mutaciones sin sentido del gen APC. También proporcionan una base racional para la identificación de mutaciones que responden a inductores readthrough
Visto:. Floquet C, JP Rousset, Bidou L (2011) la lectura a través de los codones de terminación prematuros en la poliposis adenomatosa coli génica restablece su actividad biológica en humanos Células cancerígenas. PLoS ONE 6 (8): e24125. doi: 10.1371 /journal.pone.0024125
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: February 2, 2011; Aceptado: August 4, 2011; Publicado: 31 Agosto 2011
Derechos de Autor © 2011 Floquet et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los fondos de la Asociación para la Investigación sobre el cáncer (ARC Nº 5016 de JPR) y la Association Française contre les miopatías (contrato 13986). CF fue financiado en parte por el Ministerio de Educación e Investigación de Francia y en parte por una beca de la Ligue Nationale Contre le cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El gen supresor de tumores APC (poliposis adenomatosa coli) codifica una proteína multidominio 311 kDa con sitios de unión para numerosos socios, entre los microtúbulos, axina y beta-catenina [1]. Esta proteína funciona como un regulador negativo de la vía de Wnt que está implicada en la transactivación de genes diana tales como el oncogén c-myc y el gen de la ciclina D1 [2]. El gen APC está mutado en el 80% de los cánceres de colon y de mutaciones ocurren temprano en el desarrollo de la mayoría de los cánceres colorrectales poliploides. Se ha demostrado que la reintroducción del gen APC de tipo salvaje en células cancerosas generalmente reduce la tumorigenicidad o induce la apoptosis [3], [4]. En general, 30% de todas las mutaciones en este gen son mutaciones sin sentido [5].
En los últimos años, ciertos antibióticos han demostrado que interfiere con el ribosoma de mamífero, la inducción de la lectura completa de los codones de parada prematuros (PTCs ). Los aminoglucósidos son los antibióticos más estudiados en este sentido, y múltiples estudios han sugerido que estos fármacos podrían utilizarse en estrategias innovadoras para el tratamiento de enfermedades genéticas causadas por mutaciones sin sentido (para revisión [6], [7], [8]) . El negamycin dipéptido antibiótico no está estructuralmente relacionada con aminoglucósidos [9] y se ha encontrado para ser más eficaz que la gentamicina para la promoción de la lectura completa de alguna mutación sin sentido [10]. Este medicamento puede por lo tanto constituyen un tratamiento alternativo atractivo para los pacientes portadores de una mutación sin sentido.
En un reciente estudio, hemos demostrado que incluso un nivel de lectura completa inducida por aminoglucósidos modesta (6%) desencadena la apoptosis de las células cancerosas que alberguen un disparate gen p53 -mutated [11]. Estos resultados proporcionaron la prueba de concepto de que los inductores readthrough se pueden utilizar en el tratamiento de cánceres ligados a la presencia de una mutación sin sentido en un gen supresor de tumores. En el presente estudio, se investiga la posibilidad de ampliar este enfoque para el cáncer relacionado con una mutación sin sentido en el gen APC. Recientemente, Zilberberg et al demostraron que inductores readthrough mejoraron los síntomas clínicos de la tumorigénesis en un modelo de ratón que lleva una mutación sin sentido en el gen APC. Sin embargo, no se estableció el enlace entre el nivel más bajo de desarrollo del tumor y la lectura a través de PTC [12]. Cada vez es más evidente que sólo un subconjunto de mutaciones sin sentido se beneficiaría de tratamiento con gentamicina, dependiendo de su contexto de nucleótidos [13], [14], [15], [16].
evaluó la eficiencia de lectura completa para 11 mutaciones sin sentido implicados en el cáncer colorrectal, con el fin de identificar las mutaciones sin sentido en el gen APC en mayor medida a los tratamientos inductores de readthrough. Para las mutaciones con los más altos niveles de readthrough, incluyendo una mutación endógena, el tratamiento antibiótico como resultado una recuperación de la actividad biológica de APC.
Resultados y Discusión
Identificación de mutaciones sin sentido de APC que responden a aminoglucósidos tratamiento
Se estudiaron 11 mutaciones sin sentido que se encuentran en el 23% de las células cancerosas que llevan una mutación sin sentido en el gen APC (T. soussi, comunicación personal). eficiencia lectura completa se ha demostrado que dependen de la naturaleza de las secuencias que rodean el codón de parada [13], [17], [18], [19]. Así, para cada mutación, insertamos una región que abarca el contexto que rodea (27 nucleótidos) en el dual reportero pAC99 vector (Tabla 1). Readthrough se cuantificó en las células NIH3T3 transfectadas de forma transitoria con el vector dual reportero, en presencia o ausencia de gentamicina (Figura 1). las tasas de lectura completa variaron de 0,01% (Q1131X) a 0,2% (L360X) para readthrough basal, y de 0,09% (APC Q789X) a 1,6% (L360X) en presencia de 800 mg /ml de gentamicina. Variaciones similares en los niveles basales readthrough y capacidad de respuesta a los aminoglucósidos se han reportado en varios estudios anteriores [13], [18]. También probamos otro antibiótico, amikacina, que dio niveles readthrough similares o inferiores que los obtenidos con gentamicina (datos no mostrados). Este resultado es consistente con un estudio previo de Howard et al que han comparado la actividad de la lectura a través de varios aminoglucósidos [20].
eficiencias de lectura completa para 11 mutaciones sin sentido en el gen APC se evaluaron en las células NIH3T3 con y sin gentamicina ( /ml) de tratamiento 800 g para 24 h. Dos mutaciones sin sentido (L360X y R1114X) muestran niveles de readthrough gentamicina inducida de más de 0,5%. Las medias se presentan los valores, junto con el error estándar de la media (SEM) (n = 5).
Se evaluó si los niveles readthrough fueron similares en células de origen de colon, mediante la evaluación también la lectura completa dirigida por cada mutación sin sentido en el colorrectal línea celular de cáncer DLD-1. Los resultados obtenidos fueron similares a las de las células NIH3T3 (datos no mostrados).
Para una caracterización adicional, nos hemos centrado en las mutaciones sin sentido y L360X R1114X, que muestran los niveles más altos de lectura a través de la presencia de la gentamicina aminoglucósido (1,6% y 0,7%, respectivamente). Para las dos mutaciones sin sentido seleccionados, cuantificamos los niveles readthrough obtenidos en presencia de diversas concentraciones de G418 (geneticina), ya que este antibiótico es el inductor más potente de lectura completa de los aminoglucósidos [11], [21], [22]. Ambas mutaciones sin sentido mostraron una respuesta dependiente de la dosis a G418, que resulta en niveles readthrough mayores que los observados para la gentamicina, llegando a 2,3% para L360X y 1,8% para R1114X (Figura 2 A y 2B, respectivamente). Los niveles de readthrough obtenidos en presencia del dipéptido negamycin fueron inferiores (L360X) o similar (R1114X) a los obtenidos con gentamicina (Figura 2 A y 2B, respectivamente).
(A) la eficiencia de lectura completa para APC L360X mutaciones sin sentido se determinaron en células DLD-1 en presencia de G418 (10, 25, 50, 100 y 200 g /ml), negamycin (1 mg /ml), amikacina (2 mg /ml) o gentamicina (800 mg /ml). (B) la eficiencia de lectura completa para mutaciones sin sentido APC R1114X se determinaron en células NIH3T3 en presencia de G418 (50, 100 y 200 g /ml) o negamycin (1 mg /ml). Las eficiencias readthrough en las células DLD-1 fueron consistentes con los de las células NIH3T3 (datos no mostrados). (C) aminoglucósidos tratamiento restaura la actividad de APC. APC unión a beta-catenina (reppression del reportero pTOPGlow) se restaura mediante el tratamiento de células DLD-1 transfectadas transitoriamente con ADNc de APC L360X con G418 (10, 25, 50, 100 y 200 g /ml), negamycin (1 mg /ml), amikacina (2 mg /ml) o gentamicina (800 mg /ml). (D) APC unión a beta-catenina (represión de reportero pTOPGlow) se restablece por el tratamiento de las células LoVo que llevan APC R1114X con G418 (50, 100 y 200 g /ml) o negamycin (1 mg /ml). Como control, las células LoVo se cotransfectaron con el plásmido reportero pTOPGlow y, o bien el siRNA APC-focalización (siRNA APC) o un siRNA no director (siRNA NT) y tratados con G418 (200 mg /ml). (E) Efecto de la siRNA dirigidos a APC ARNm. Estamos transfectadas transitoriamente células LoVo con un siRNA dirigidos (siRNA APC) o no focalización (siRNA NT) APC ARNm. PCR cuantitativa se utiliza para determinar los niveles de ARNm. Los resultados se expresan en relación con la cantidad de ARNm en presencia de siRNA NT. Los valores medios se presentan, junto con el SEM (n = 3).
nivel de lectura completa depende de la naturaleza del codón de parada y el contexto de nucleótidos circundante, pero las normas que regulan el nivel de lectura completa son complejas y se mantienen que se determinará para las células de mamíferos. La presencia de un residuo C inmediatamente después del codón de parada (4) se correlaciona con un alto nivel de lectura completa, aunque esto no parece ser el único factor determinante del nivel de lectura completa. Varios estudios también han demostrado que sólo unas pocas mutaciones sin sentido dan lectura completa "significativo" en presencia de gentamicina. En este estudio, sólo dos de los once mutaciones sin sentido ensayados, L360X y R1114X, muestra los niveles de readthrough gentamicina inducida mayor que 0,5%, pero sólo L360X tenido un residuo C en la posición 4. La mutación R1114X sería, por tanto, han sido descartados si esto hubiera sido el único criterio que se utiliza para identificar las mutaciones que responden bien a los inductores readthrough. Así, nuestro enfoque proporciona una estrategia racional para la identificación de pacientes que podrían beneficiarse del tratamiento con inductores readthrough.
Recuperación de la actividad biológica de la APC L360X ADNc APC después del tratamiento aminoglucósido
A continuación se investigó si el tratamiento con aminoglucósidos inducida niveles detectables de actividad biológica de una proteína APC producido a partir de un ADNc que lleva la mutación L360X. Activo APC media en el secuestro de beta-catenina en el citoplasma, impidiendo así la interacción de esta molécula con el TCF factor de transactivación requiere para la expresión de los genes diana. actividad de la proteína APC se evaluó mediante la determinación de la capacidad de esta proteína para unirse beta-catenina, el uso de un constructo informador que contiene sitios insertados aguas arriba del gen de la luciferasa de luciérnaga (pTopGlow) [23] de unión TCF /beta-catenina. En este sistema reportero, la interacción entre la APC y beta-catenina resultados activos en la inhibición de la expresión de luciferasa de luciérnaga.
células DLD-1 desprovisto de proteína APC funcional (APC del 1 pb 1406) se transfectaron con el pCMV vector de expresión que contiene ya sea WT o mutante L360X APC cDNA, junto con pTopGlow (Figura 2C). La transfección con el vector WT APC resultó en niveles de expresión de luciérnaga décima los obtenidos después de la transfección con un vector vacío. Sin tratamiento, L360X muestra los niveles residuales de la actividad, probablemente debido a la pérdida de la función de este alelo incompleta, ya que la actividad residual también se ha demostrado para las mutaciones en posiciones cercanas [23]. La dosis más alta de G418 disminución de la actividad de la luciferasa por un factor de 2,5, lo que demuestra la producción de una proteína APC funcional en el tratamiento aminoglucósido. G418 reprimió la actividad de luciferasa de una manera dependiente de la dosis en correlación con los niveles medidos en readthrough DLD-1 células (Figura 2A). El tratamiento con la gentamicina aminoglucósidos o amikacina, o con negamycin también desencadena la represión de la actividad de la luciferasa, lo que indica la síntesis de una proteína APC activo (Figura 2C). Para cada tratamiento, la actividad de proteínas se correlacionó con el nivel de nivel de readthrough medida en el sistema reportero doble (Figura 2A y 2C). Se utilizó el test no paramétrico de correlación de Spearman (dos colas) para evaluar la importancia de esta correlación. Se encontró que había una fuerte correlación, altamente significativa (rs = -0,95, p & lt; 0,0001) entre el nivel de lectura completa y la disminución de la actividad de luciferasa. Así, tanto aminoglucósido y el dipéptido negamycin puede inducir actividad biológica APC de un ADNc mutante, y el nivel de actividad es proporcional al nivel de lectura completa. Como control, se utilizó el vector pFopGlow que contiene sitios de unión mutada TCF /beta-catenina. Con este vector, se observó ningún cambio significativo después de aminoglucósido o tratamiento negamycin (datos no mostrados).
Recuperación de la actividad biológica de APC desde el gen endógeno R1114X APC después del tratamiento aminoglucósido
A continuación, investigamos si el tratamiento aminoglucósido de mutaciones sin sentido endógenos conduzca a resultados semejantes. células LoVo (APC R1114X) se transfectaron con el plásmido informador pTopGlow y dejaron sin tratar o tratados con G418 o negamycin. La actividad del gen reportero de luciferasa de luciérnaga fue máxima en ausencia de tratamiento y se fijó en 100%, lo que refleja la falta de actividad de la proteína APC. El tratamiento con negamycin y G418 disminuyó pTopGlow actividad luciferasa de luciérnaga a 50% y 18% del valor de referencia, respectivamente (Figura 2D). El nivel de actividad se correlaciona con la eficiencia de lectura completa (Figura 2B). Sorprendentemente, el tratamiento de gentamicina, a pesar de la promoción de niveles de readthrough similares a los obtenidos con negamycin, no disminuyó pTopGlow actividad luciferasa de luciérnaga (datos no mostrados). Por lo tanto, la eficiencia de lectura completa no es el único factor determinante para la recuperación de la actividad de la proteína de longitud completa. De hecho, PTC readthrough corresponde a la incorporación de un aminoacil cerca-tRNA [24], [25], [26], [27] (complementaria a dos de los tres nucleótidos de un codón de parada), potencialmente dando como resultado la sustitución de el residuo normal mediante un aminoácido incompatible con la estabilidad o actividad de la proteína de longitud completa [10]. Es posible que diferentes aminoácidos se incorporan en lugar del codón de parada en la presencia de estos dos fármacos, sólo con negamycin tratamiento que conduce a la incorporación de ácido (s) (a) amino compatible con la actividad biológica de la proteína. Esta situación puede surgir debido a los diferentes modos de la actividad de estos fármacos: aminoglucósidos parecen unirse exclusivamente al centro de decodificación [28], mientras que negamycin se ha demostrado que se unen no sólo para el sitio A de la subunidad pequeña ribosomal [9], pero también a la pared de la naciente túnel de salida de la cadena de la subunidad ribosómica grande [29]. Por lo tanto, podríamos esperar que el subconjunto de ARNt supresores naturales seleccionados para ser diferente después de aminoglucósidos y tratamientos negamycin.
En cuanto a la otra mutación probado, la expresión de luciferasa de pFopGlow que albergan mutado TCF sitios de unión /beta-catenina no fue significativamente afectada por tratamiento con antibióticos (datos no mostrados). Verificamos que la proteína APC activo fue realmente responsable de la disminución observada en la expresión de luciferasa de luciérnaga, utilizando un siRNA dirigidos específicamente el ARNm de APC. Hemos utilizado por primera RT-PCR para comprobar que el siRNA redujo efectivamente los niveles de ARNm de APC (Figura 2E). células LoVo se cotransfectaron con el plásmido reportero pTOPGlow y orientación siRNA o no la orientación APC.
Después del tratamiento G418 (200 mg /ml), el siRNA APC-focalización dio una disminución de la actividad de luciferasa de dos veces inferior a la observada en ausencia de siRNA, mientras que la no específica siRNA no tuvo ningún efecto sobre la inhibición de la luciferasa (Figura 2D). Por lo tanto, se detectó el efecto en el sistema reportero específicamente en presencia de APC ARNm que indica que está mediada por una proteína APC activo
.
Para estos dos mutantes, se determinó la capacidad de tratamiento aminoglucósido para restaurar la producción de la proteína APC de larga duración. Hemos sido capaces de detectar la proteína APC de longitud completa en células HeLa (APC WT), pero esta proteína no era detectable después del tratamiento de drogas en cualquiera de las células LoVo (R1114X) o células DLD-1 transfectadas con el ADNc L360X (Figura 3). Esta falta de detección fue probablemente debido a las limitaciones de la técnica para la detección de pequeñas cantidades de una proteína grande (311 kDa). Estos hallazgos sugieren que los niveles bajos de proteína APC pueden ser suficientes para regular la actividad del complejo transcripcional TCF /beta-catenina.
Células
LoVo se dejaron sin tratar o se trataron con G418 (200 mg /ml) durante 72 horas. Las transferencias Western se sondaron con el anticuerpo FE-9 dirigido contra el N-terminal de APC. Las formas truncadas correspondientes a los alelos mutados presentes en las células LoVo se indican mediante flechas. Un extracto de células HeLa (APC WT) se utilizó como un control; una banda se detectó a 311 kDa.
Conclusión
En este estudio, se investigó la capacidad de las moléculas que inducen readthrough para inducir la producción de una proteína APC funcional en las células que llevan varios mutaciones sin sentido en el gen APC. Se detectó actividad biológica para las dos mutaciones sin sentido más sensible al tratamiento aminoglucósido (R1114X y L360X) y esta actividad era directamente proporcional a los niveles de readthrough medidos con un sistema indicador dual. Este estudio muestra que los inductores readthrough, como aminoglucósidos y negamycin, pueden reactivar el gen supresor de tumores APC en las células cancerosas. Proporciona una estrategia racional para la identificación de pacientes que probablemente respondan y por tanto más probabilidades de beneficiarse del tratamiento con inductores readthrough. Un estudio reciente ha proporcionado la prueba de principio de que la re-expresión de una proteína APC de larga duración después del tratamiento con inductores readthrough reduce el tamaño del tumor en un ratón de xenoinjertos [12]. Además, recientemente hemos demostrado que el tratamiento de las células que llevan una mutación sin sentido en el gen supresor de tumores p53 conduce a la re-expresión de una proteína de longitud completa capaz de desencadenar la apoptosis en las células tumorales en cultivo [11]. Todos estos datos sugieren que las moléculas que inducen la lectura a través del codón de parada-podrían ser utilizadas no sólo para tratar enfermedades genéticas, sino también para diversificar el arsenal existente de tratamientos para el cáncer y como una base racional para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento personalizado.
Materiales y Métodos
líneas celulares y cultivo celular
Todas las células se cultivaron en DMEM más GlutaMAX (Invitrogen), complementado con un 10% de suero de ternera fetal (FCS, Invitrogen) y 100 U /ml de penicilina /estreptomicina. Las células se incubaron en una atmósfera humidificada que contiene 5,5% de CO
2, a 37 ° C. NIH3T3 (amablemente proporcionado por Marc Sitbon) las células son fibroblastos de embriones de ratón. LoVo (APC R1114X y del 1 pb 1430, proporcionado amablemente por Françoise Praz, [30]) y DLD-1 (APC del 1 pb 1406, proporcionado amablemente por Françoise Praz, [31]), las células son células epiteliales derivadas de un colorrectal humano adenocarcinoma. Las células HeLa (APC WT) son células epiteliales derivadas de un adenocarcinoma de cuello uterino humano (amablemente proporcionado por Fabrice Lejeune).
cuantificación de lectura completa en cultivo celular
oligonucleótidos complementarios correspondientes a mutaciones sin sentido incrustado en su hábitat natural de contexto (secuencias de la Tabla 1) se hibridaron y se ligaron en el plásmido dual reportero pAC99, como se describe anteriormente [32]. Esta doble reportero permite la cuantificación de readthrough codón de parada, a través de la medición de las actividades luciferasa y beta-galactosidasa (calibración interna), como se describe anteriormente [16]. Los niveles de readthrough de mutaciones sin sentido se analizaron en presencia o ausencia de gentamicina. NIH3T3 células se sometieron a electroporación con 20 g de plásmido reportero y, al día siguiente, las células se lavaron y, con o sin gentamicina, amikacina, negamycin o la suplementación con G418, se añadió medio fresco. En estos experimentos, no se observó toxicidad celular para las dosis de antibióticos utilizados. Veinticuatro horas más tarde, se recogieron las células y se lisaron con tripsina-EDTA (Invitrogen). actividades de beta-galactosidasa y luciferasa se analizaron como se describe anteriormente [32]. eficiencia lectura completa se estimó mediante el cálculo de la relación de luciferasa con la actividad beta-galactosidasa obtenido con el constructo de prueba y normalizando con respecto a la relación obtenida con una construcción de control en el marco. Para cada constructo, se realizaron al menos cinco experimentos de transfección independientes. Para la cuantificación readthrough en DLD-1, se utilizó el mismo protocolo, excepto que se utilizó el método de fosfato de calcio para la transfección. Para cada construcción, se realizaron al menos tres experimentos de transfección independientes.
construcciones de plásmidos de expresión
pCMV APC WT fue proporcionado amablemente por el Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins Oncology Center, Baltimore). La mutagénesis dirigida se realizó en un fragmento del gen APC para crear la mutación sin sentido APC L360X (pCMV APC L360X). Se verificó la secuencia del fragmento de reinsertados.
El análisis de Western-blot
células LoVo fueron tratados con G418 (200 mg /ml) durante 72 h. El medio se reemplazó y se añadieron antibióticos frescas cada día. Las células fueron tratadas como se describe anteriormente [11]. los niveles de proteína totales se determinaron con el reactivo de Bradford (Biorad) y los extractos se desnaturalizaron por incubación en tampón Laemmli durante 5 min a 90 ° C. Sometimos 100 g de proteína total a SDS-PAGE en NuPAGE Novex 3/8% Tris /geles premoldeados de etilo (Invitrogen). Las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa durante la noche, según lo recomendado por el fabricante. Las membranas se saturaron por incubación durante 1 h en TBS suplementado con 5% sin grasa de la leche en polvo, y se incubaron con el anticuerpo primario monoclonal, FE-9 mapeo (N-terminal epítopo entre los residuos de aminoácidos 1 y 35 de APC; Calbiochem, 1 /100). Las membranas se lavaron tres veces en TBS suplementado con 1% de leche en polvo no grasa y se incubaron con el anticuerpo secundario (conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-ratón IgG (1/2500) o fosfatasa alcalina conjugada con IgG anti-ratón (1/7000) Promega ) durante 45 minutos. Se lavaron seis veces y se detectó la quimioluminiscencia ECL con reactivos de detección de transferencia Western (Amersham, GE Healthcare).
ensayos de actividad de Proteína
La actividad biológica de APC se estimó con el vector pTOPGlow (amablemente proporcionada por el Dr. Marc Van de Wetering, hospital de la Universidad de Utrecht, Holanda).
células DLD-1 se cotransfectaron con pCMV L360X (4 g), pTOPGlow o pFOPGlow (10 mg) y pCMVLacZ (2 g) , por el método de fosfato de calcio. Cada precipitado de ADN se divide entre dos pocillos de una placa de seis pocillos. se añadieron inmediatamente después de la transfección, a excepción de G418, que se añadió el día después de los antibióticos (1 mg /ml negamycin 10 mg /ml a 200 mg /ml de G418; 800 g /ml de gentamicina;; 2 mg /ml) de amikacina. El medio se reemplazó cada día y se añadieron antibióticos frescas. Hemos preparado extractos de proteínas de 48 horas después de la transfección, y las actividades enzimáticas medidas
Para las células LoVo, antibióticos. (G418 en concentraciones de 50, 100 y 200 mg /ml; /1 mg ml negamycin) se añadieron el día antes la transfección y en cada día subsiguiente. Se cotransfectaron células LoVo, por el método de fosfato de calcio, con o TOPGlow FOPGlow (10 g) y pCMVLacZ (2,8 g) para normalizar la eficiencia de transfección, la viabilidad celular y la variabilidad de extracción de proteínas. Cada precipitado de ADN se divide entre dos pocillos de una placa de seis pocillos. Tres días después de la transfección, extractos de proteínas se prepararon y se midieron las actividades enzimáticas.
Para cada línea celular, se realizaron al menos tres experimentos de transfección independientes.
siRNA transfecciones
células LoVo, se determinó la actividad de proteína como se describió anteriormente. Las células fueron transfectadas con siRNA dirigidos a APC ARNm (Dharmacon en-blanco-003869-12 además J) o NS, nontargeting (Dharmacon en el blanco más el control de siRNA#1), en presencia de DharmaFECT Duo (Thermo Scientific; 1,3 g de siRNA por pocillo de una placa de seis pocillos), 24 h después de su transfección inicial como se describe anteriormente. Las células transfectadas se incubaron inmediatamente en un medio con o sin G418 suplementación (200 g /ml). Tres días después de la transfección, se recogieron las células y las actividades de luciferasa y beta-galactosidasa se ensayaron como se describe anteriormente. se realizaron al menos cuatro experimentos de transfección independientes.
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros del laboratorio y Mounira Amor-Guéret (Institut Curie, el CNRS, Orsay) útil para los debates. También damos las gracias a Julie Frugier para la asistencia técnica.