Extracto
La acumulación de pruebas ha sugerido la necesidad de una mayor estratificación de los pacientes en el mismo estadio tumoral en función de factores moleculares. Se evalúa la combinación de la etapa del cáncer y el estado de metilación del ADN como un indicador del riesgo de recurrencia y mortalidad entre los pacientes con cáncer colorrectal (CCR). Un estudio de cohorte de 215 pacientes con CCR (edad media de 64.32 años; el 50,5% de los hombres) del Hospital General Tri-Service en Taiwán examinó la asociación entre la etapa del cáncer y el riesgo de recurrencia y mortalidad de CRC. Un modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizó para analizar el estado del paciente metilación y la información clínica al inicio del estudio, y sus asociaciones con CCR recurrencia y mortalidad durante el seguimiento. Los pacientes en etapa avanzada con
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metilación se asociaron con un mayor riesgo de CCR recurrencia en comparación con los pacientes en etapa locales con el estado de metilación en los tejidos tumorales , con proporciones ajustadas de riesgo (CR) (95% intervalo de confianza [IC]) de 9,64 (2,92-31,81), 8.29 (3.40-20.22) y 11,83 (3,49-40,12), respectivamente. Al analizar los tejidos normales, se observó un riesgo similar de CRC recurrencia con CRI ajustados (IC 95%) de 10,85 (4,06-28,96), 9,04 (3,79-21,54), y 12,61 (4,90-32,44), respectivamente. Para los análisis combinados, el riesgo de recidiva en los pacientes en etapa avanzada con la metilación del ADN en ambos tejidos normales y tumorales, en comparación con la etapa local con no metilación, se aumentó con HR ajustado (CI 95%) de 9,37 (3,36 a 26,09). En los pacientes en etapa avanzada, estado de metilación y el subtipo de tejidos se asociaron con un mayor riesgo de recurrencia de 5 años CRC acumulativa (
p Hotel & lt; 0,001). Este estudio demuestra que el estado de metilación del ADN agrupación de acuerdo con la etapa del cáncer y el subtipo del tejido es fundamental para la evaluación del riesgo de recurrencia en pacientes con CRC y también indica un mecanismo subyacente
Visto:. Kuan JC, Wu CC, CA Sun , Chu CM, Lin FG, Hsu CH, et al. (2015) Combinaciones de metilación del ADN en tejido de colon normal adyacente predecir la recurrencia del cáncer: Evidencia de un estudio de cohorte clínica. PLoS ONE 10 (3): e0123396. doi: 10.1371 /journal.pone.0123396
Editor Académico: Hiromu Suzuki, Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 7 Octubre de 2014; Aceptado: February 18, 2015; Publicado: 27 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Kuan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Los datos han sido depositado en Dryad: doi:. 10.5061 /dryad.pg126
Financiación: Este estudio fue apoyado por becas de investigación del Consejo Nacional de Ciencia, República de China (NSC-98-2314 B016-001, NSC 99-2.314 -B016-020, NSC 100-2314-B016-025, y NSC 101 hasta 2314-B-016-029). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es uno de los cánceres más comunes, con más de 140.000 nuevos casos y 50,830 muertes estimadas que se han producido en los Estados Unidos en 2013 [1]. Aunque las tasas de incidencia y mortalidad de CRC han disminuido considerablemente en los últimos años debido a las mejoras sustanciales en las estrategias de detección y tratamiento, el pronóstico de los pacientes con CCR después de la resección quirúrgica sigue siendo [2].
Las directrices actuales para la evaluación pobres del pronóstico de pacientes con CRC destacar la clasificación de los elementos individuales tumor de nodo metástasis [3]. Sin embargo, evidencia acumulada ha sugerido el requisito de una mayor estratificación de los pacientes en la misma etapa del tumor de acuerdo con factores moleculares [4]. Además, los factores moleculares, que incluyen marcadores biológicos de varios tipos de cáncer, podrían tener valor clínico potencial en la predicción del desarrollo y progresión del cáncer, y predecir el pronóstico de los pacientes con cáncer [5,6]
.
CRC es reconocido como una consecuencia de la acumulación de genéticos (mutaciones de genes) y alteraciones epigenética (metilación aberrante del ADN) que transforman las células epiteliales del colon en células de adenocarcinoma de colon [7]. modificación epigenética, que consiste en ADN y las histonas modificaciones, desempeña un papel fundamental en las vías de la carcinogénesis en varios tipos de cáncer. Estudios anteriores han demostrado que la más frecuente modificación epigenética aberrante en el cáncer, la metilación del ADN, reduce la eficacia de la transcripción de ARN de los genes supresores de tumores [8,9]. Un estudio reciente ha concluido que varios metilaciones promotor del gen resultan en el silenciamiento transcripcional, y podría ser explotada como biomarcadores para la detección precoz del CCR [10]. La progresión tumoral en CRC es causada por la pérdida de función en la regulación del ciclo celular y la reparación mismatched DNA (MMR), que está relacionada con la metilación del ADN del sitio de inicio de la transcripción [11]. Estudios previos han identificado los genes relacionados con la metilación del ADN-asociados con las vías de carcinogénesis utilizando silenciamiento génico [12,13]. Sin embargo, estos estudios no analizaron el estado de metilación del ADN y la etapa clínica para el seguimiento de los pacientes con CCR.
El propósito de este estudio fue evaluar la combinación de la etapa del cáncer y el estado de metilación del ADN como un indicador de el riesgo de recurrencia y mortalidad entre los pacientes con CCR. También se investigó la asociación entre los factores de riesgo para el pronóstico y de la CRC, después de la estratificación de acuerdo a los subtipos de tejido de colon.
Materiales y Métodos
Características de los pacientes
De acuerdo con el escrito los procedimientos de operación, la buena práctica clínica (BPC), y los requisitos reglamentarios aplicables, esta solicitud fue aprobada por el Consejo Tri-Service hospital general de Revisión Institucional (IRB) (TSGHIRB número de homologación: 098-05-292). La junta fue organizada bajo, y funciona según la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) /OMS BPC y las leyes y reglamentos aplicables. Todos los pacientes firmaron carta de consentimiento informado y fueron diagnosticados clínicamente con el CRC tenía que ser capaz de tolerar la resección quirúrgica. Las características del paciente (sexo, edad en la cirugía, el escenario, la recurrencia y mortalidad) se obtuvieron a partir de sus historias clínicas. Los pares de muestras se recogieron de los 215 pacientes con CCR (430 muestras) que cumplían los criterios de inclusión. La recogida de muestras se llevó a cabo en las clínicas quirúrgicas, en el que el tumor y los tejidos normales fueron resecados de forma simultánea. Las muestras de tejido normal adyacente se obtuvieron de una incisión & gt; 10 cm de distancia de los sitios de carcinoma. Todas las muestras se almacenaron inmediatamente en nitrógeno líquido. El procedimiento de resección fue revisado por el Departamento de Cirugía Colorrectal, Hospital General Tri-Service.
aislamiento del ADN y tratamiento con bisulfito de sodio
ADN genómico fue extraído de muestras de tejido mediante el uso de un ácido nucleico MagCore Automatizado extractor (RBC Bioscience, Taipei, Taiwán) y una Tissue Kit ADN genómico de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN resultante fue de bisulfito de sodio modificado con el uso de un metilación del ADN Kit EZ (Zymo Research, Orange, EE.UU.). Un control de ADN metilado para ensayos de reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación (MS-PCR) se generó utilizando SSS I metilasa (Zymo Research, Orange, EE.UU.).
PCR específica de metilación de ensayo
Seleccionado 3 genes supresores de tumores (
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,
hMLH1
, y
MGMT
) están relacionados con el riesgo de CCR, que participa en las vías asociadas con las etapas del cáncer y el pronóstico, incluyendo la triple vírica y el ciclo celular [14]. Condiciones de DAN-bisulfito de tratamiento y ensayo de PCR específica de metilación se proporcionaron en Métodos S1, y el control de calidad del ensayo se proporcionan en la figura S1.
El análisis estadístico
características iniciales de los pacientes, incluyendo el sexo , edad a la cirugía (continua), la etapa (I, II, III, y IV), la recurrencia, el estado de la mortalidad, y el estado de metilación del gen de la región promotora de los genes candidatos (
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MGMT
), se compararon. Para evaluar las posibles interacciones entre la metilación del ADN y el estadio clínico, y el riesgo de recurrencia y mortalidad de CRC, los pacientes de diferentes etapas del cáncer se evaluaron por separado y también se dividen en 2 subgrupos (locales y avanzado). Los tejidos tumorales se compararon con los tejidos normales adyacentes. Varios factores pueden haber contribuido a las diferencias entre nuestros resultados y los de otros estudios. ajuste de los factores de confusión se detalla en Métodos S1. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS (IBM SPSS Statistics 21; Asia Analytics Taiwan Ltd., Taipei, Taiwán). Todas las pruebas estadísticas fueron de 2 caras con un nivel α de 0,05.
Resultados
La edad media (± DE) de los pacientes del estudio fue de 64,32 (± 14,48) años, y los hombres 50,5 constituido % de la muestra estudiada. En general, la duración media (± DE) de seguimiento fue de 24,94 (± 17.90) meses. Durante las 5.363 personas-meses de seguimiento, se identificaron 85 casos de CCR recurrencia y 43 defunciones, con una densidad de incidencia de 15.85 y 8.02 por 1000 personas-mes, respectivamente. La asociación entre el estadio clínico y riesgo de recurrencia y mortalidad de CRC es proporcionar en S1 Resultados.
La Tabla 1 muestra las características basales de los pacientes en función de su estado de metilación del ADN. Al analizar los tejidos normales, se observó que los pacientes con mayor estado de metilación de los genes supresores de tumores se asociaron significativamente con una mayor proporción de CRC recurrencia que los pacientes con estado de metilación más baja fueron (55,3% vs. 37,7%,
p
= 0,012). Esta asociación fue significativa en el límite en los tejidos tumorales (84,7% vs. 73,1%,
p = 0,065
). Además, examinó la asociación entre la etapa del cáncer y el riesgo de recurrencia de CRC, la estratificación por estado de metilación del gen diana en los subtipos de tejidos después de ajustada por sexo, edad a la cirugía y la quimioterapia adyuvante (Tabla 2). Al analizar los tejidos tumorales, se observó que los pacientes en estadio avanzado con
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hMLH1
, y
MGMT
metilación se asociaron con un mayor riesgo de CCR recurrencia en comparación con lo local los pacientes en etapa con el estado de metilación, con CRI ajustados (IC del 95%) de 9,64 (2,92-31,81), 8,29 (3,40-20,22), y 11,83 (3,49-40,12), respectivamente. Al analizar los tejidos normales, se observó un riesgo similar de CRC recurrencia en los pacientes en etapa avanzada con
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,
hMLH1
, y
MGMT
metilación en comparación con los pacientes en etapa locales con estado de metilación, con CRI ajustados (IC 95%) de 10,85 (4,06-28,96), 9,04 (3,79-21,54), y 12,61 (4,90-32,44), respectivamente. Además, un análisis de Kaplan-Meier con la prueba de log-rank mostró la importancia de la asociación entre la etapa del cáncer y el estado de metilación del ADN en tejidos normales adyacentes, y la recurrencia acumulada a 5 años de CRC (
p Hotel & lt; 0,001 ; Figura 1); un modelo de regresión de Cox confirmó el riesgo constante después de ajustar posibles factores de confusión, tales como sexo, edad, localización del tumor, la quimioterapia adyuvante, y el estadio clínico (
p Hotel & lt; 0,001)
El acumulativa. las tasas de recurrencia fueron significativamente diferentes en los 4 subgrupos durante los 5 años de seguimiento después de ajustado por sexo, edad a la cirugía, la localización del tumor, la quimioterapia adyuvante, y el estadio clínico.
Como se muestra en la Tabla 3, que posteriormente analizado el estado de metilación del ADN y la recurrencia de CCR en los pacientes del estudio, la estratificación de acuerdo con la etapa del cáncer (local y avanzado) y el subtipo de tejido (normal y tumoral). Hemos observado que el riesgo de CCR recurrencia se asoció significativamente con el estado de metilación en los pacientes de las diversas etapas del cáncer, y en los 2 subtipos de tejidos, después de ajustar por sexo y edad a la cirugía (
p Hotel & lt; 0,001) . Los pacientes en etapa locales se asociaron con un aumento no significativo del riesgo de recurrencia CRC, con independencia del estado de metilación y el subtipo del tejido. En los pacientes en etapa avanzada, estado de metilación y el subtipo de tejidos se asociaron con un mayor riesgo de recurrencia CRC.
Discusión
Nuestros resultados indican que la metilación del ADN de ciertos genes y estadio clínico estaban asociado con el riesgo de CCR recurrencia en nuestro estudio los pacientes. Hemos observado que el estado de metilación del ADN en los 3 genes diana y el estadio del cáncer se asociaron significativamente con el CRC recurrencia de tumor y los tejidos normales. Cuando que agrupan los estados de metilación de genes según la etapa del cáncer y el subtipo de tejido, observamos nuevos aumentos en el riesgo de recurrencia CRC. Estos resultados sugieren que la etapa clínica del cáncer y el estado de metilación del ADN podrían ser evaluados como predictores del riesgo de CCR recurrencia.
Estudios previos observaron de manera similar una asociación entre la supervivencia libre de recidiva a corto y metilación del ADN en pacientes con CRC [15 -17]. Zitt et al compararon diversas pruebas de detección de CRC, e informó de que la metilación del ADN proporciona un indicador clínicamente útil para la detección precoz de la progresión de la enfermedad en pacientes con CRC, lo que podría mejorar la supervivencia y calidad de vida [15] paciente. Kim et al informaron de que la metilación del ADN de múltiples promotores podría proporcionar un biomarcador para la detección precoz del CRC, y que los patrones de metilación del ADN también podría ser utilizado como predictores de metastásica o agresivo CRC [16]. Los datos de un estudio de seguimiento clínico reveló que la metilación de genes específicos se asocia con una baja supervivencia en pacientes con CCR avanzado [17]. Un gran estudio de seguimiento en 61 494 pacientes asiáticos y caucásicos con CCR indicó que las tasas de supervivencia fueron significativamente mayores en los pacientes de etnia china y filipina que en otros pacientes [18]. Sin embargo, nuestros resultados de una población china fueron consistentes con los de los estudios descritos y el estudio tuvieron resultados similares con el cáncer de Genome Atlas [19].
Las aberraciones en la metilación de las macromoléculas, especialmente ADN, así como alteración en la síntesis y reparación del ADN, se considera que desempeñan un papel importante en la carcinogénesis [20]. La metilación del ADN es el cambio epigenético más ampliamente investigado [21], y puede proporcionar una nueva generación de cánceres. Las modificaciones epigenéticas, especialmente la metilación del ADN en los promotores de genes seleccionados, son alteraciones a nivel molecular comunes en los tumores humanos [16]. En este estudio, se observó que la metilación de algunos genes se asocia con un aumento significativo del riesgo de recurrencia CRC. Brock et al identificaron la metilación de
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y
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en los ganglios linfáticos tumorales y mediastínicos, la estimación de los odds ratios (OR) para la CRC como recurrencia 8,00 (IC del 95%, 2,50-25,51) y 4,32 (IC del 95%, 1,61 a 185,02), respectivamente. Cuando se evaluó la metilación global en los ganglios linfáticos tumorales y mediastínicos, el OR para la CRC recurrencia fue de 15,5 (1,61 a 185,02) [22]. Nuestros resultados demuestran de manera similar un mayor riesgo de recurrencia CRC al estratificar estado de metilación de ADN de acuerdo con la etapa clínica del cáncer y el subtipo del tejido.
Los genes evaluados en este estudio,
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, están involucrados en la regulación del ciclo celular y el ADN MMR. Metilación aberrante promotor de los genes supresores de tumores puede conducir a la expresión transcripcional regulado por disminución y la expresión de la proteína en las células epiteliales [23]. MMR y el control del ciclo celular tanto juegan un papel crucial en la eliminación de repeticiones de mononucleótidos, y la pérdida del sistema de reparación es uno de los principales mecanismos implicados en la acumulación de cambio funcional efectos oncogénicos, incluyendo la Convención de desarrollo [24]. alteraciones de metilación del ADN responsables de la heterogeneidad histológica y la diversidad clínico-patológica de los cánceres humanos. La sobreexpresión de la ADN metiltransferasa 1 no es un resultado secundario de aumento de la actividad proliferativa de células, pero se correlaciona significativamente con la hipermetilación del ADN acumulado en las islas CpG de genes relacionados con el tumor [25]. La asociación entre la metilación del ADN y la etapa del cáncer puede ser dependiente de la interleucina 6, un marcador inflamación crónica que mejora la hipermetilación del gen supresor de tumor
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familias, pero reduce la metilación del receptor del factor de crecimiento epidérmico [26]. se considera una inflamación crónica que es causada por daño citosina mediada por inflamación, y los productos de tales daños podría proporcionar un enlace mecánico entre la inflamación y el cáncer [27], y promover la metilación aberrante en los cánceres humanos. mediadores de respuesta inflamatoria, tales como citoquinas, radicales libres, y factores de crecimiento, inducen cambios epigenéticos en genes supresores de tumores. Las observaciones de estos cambios han fortalecido aún más la asociación entre la inflamación y el cáncer [28].
Por lo tanto, el riesgo de mal pronóstico aumentos en los estadios clínicos avanzados de cáncer cuando los pacientes se diagnosticó por primera vez, incluso después de la resección quirúrgica. Nuestros resultados fueron consistentes con los de estudios relacionados que asocian las metástasis linfáticas distantes y con mal pronóstico [29,30]. Las etapas avanzadas de la CRC están asociados con un mayor riesgo de mal pronóstico en comparación con el CRC fase local. Además, un examen clínico de cáncer de pulmón indicó que cuando las estrategias se han establecido para acelerar el examen de personas sospechosas de tener cáncer, la enfermedad normalmente se desplaza hacia un escenario y tasas de resección aumento anterior [31]. Estudios previos han identificado que la hipermetilación aberrante promotor de los genes relacionados con el cáncer puede ser potencialmente útiles como marcadores epigenéticos para predecir el resultado del tratamiento del cáncer [32,33]. En el otro estudio de 22 cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) de los pacientes por Esteller et al., El 68% de los pacientes que presentan hipermetilación en el ADN del tumor también se demuestra en el ADN de suero a través de etapas, que se produjo con toda la etapa de I a IIIA [ ,,,0],33]. Dos estudios demostraron que la metilación del ADN aberrante está asociada con el pronóstico del cáncer, incluso en diferentes etapas clínicas. Otro estudio mostró que la metilación del promotor del gen está asociada con la recurrencia temprana de la etapa I NSCLC [22]. Además, las proporciones de metilación eran en su mayoría más bajo en los tejidos normales que en los tejidos tumorales en la Tabla 1, pero los riesgos de recidiva fueron similares en estos dos tipos de tejidos. Los resultados indican que una vez que se ha detectado la metilación del ADN en pacientes avanzados, el riesgo de recurrencia se incrementaría bruscamente. estudio previo ha mostrado el mecanismo de este aumento del riesgo a partir de los cambios de nivel molecular. Sato et al. han informado de la metilación del ADN de los tejidos no cancerosos obtenidas de pacientes con adenocarcinomas de pulmón estaba en etapas precancerosas con la metilación del ADN aberrante durante varios genes [34]. alteraciones de metilación del ADN en las etapas precancerosas se fortalecen en los tejidos normales durante la progresión a adenocarcinoma de pulmón desarrollado. La cual está constituida con nuestros hallazgos de que los cambios moleculares podrían no ser encontrados por el examen patológico, pero las alteraciones de metilación del ADN se han producido en los tejidos normales adyacentes de las lesiones. Por lo tanto, las alteraciones de metilación del ADN en los tejidos normales llevan a un mal pronóstico que en tejidos de cáncer. estado de metilación de genes en una cohorte de validación independiente se llevó a cabo con una probabilidad significativamente mayor relación de recurrencia entre los pacientes de casos, por lo general aumenta con diferentes sitios de detección metilados, tales como tumores, ganglios linfáticos del mediastino, regionales y del tumor y los ganglios mediastínicos. Investigaciones adicionales de información clínica del paciente, tales como datos bioquímicos de la sangre o el historial de medicamentos, con la estratificación para identificar los grupos de alto riesgo de recurrencia CRC, se requieren.
Las fortalezas y limitaciones de nuestra discusión orden de estudio. En este estudio se evaluaron los datos de seguimiento sobre la metilación del ADN y la etapa del cáncer como indicadores de riesgo de CCR recurrencia según el subtipo de tejidos. Realizamos nuestras evaluaciones mediante el uso de biomarcadores moleculares e información clínica. Nuestros resultados podrían proporcionar a los médicos con una referencia clínica para el pronóstico de los pacientes después de la cirugía CRC. Sin embargo, es concebible que más tiempo de seguimiento puede tener mayores diferencias en este estudio. Sin embargo, los estudios anteriores mostraron el corto mediana de seguimiento después del tratamiento quirúrgico entre los pacientes con CRC, de 2 años de períodos de seguimiento, que se presentan diferencias significativas en la incidencia de recurrencia [35,36]. En segundo lugar, no se evaluaron las respuestas inflamatorias o biomarcadores relacionados con la inflamación en los pacientes con CCR. Kanai et al. identificó que la inflamación crónica puede afectar el pronóstico de los pacientes con CRC [25]. No se pudo evaluar esta asociación. Aunque, se utilizó MSP semi-cuantitativa en este estudio, MPS cuantitativos tales como, piro-secuenciación se deben realizar en estudio. Por otra parte, la expresión de genes no evaluó en este estudio debido a los tejidos congelados almacenados en el banco de tumores, el nivel total de ARN en la muestra fueron insuficientes para el experimento de la expresión génica. La replicación no se llevó a cabo en este estudio.
En conclusión, este estudio demuestra que la agrupación estado de metilación de ADN de acuerdo a la etapa del cáncer y el subtipo del tejido es crítica para la evaluación del riesgo de recurrencia en pacientes con CCR. Los resultados del estudio también indican un mecanismo subyacente de un mayor riesgo de recurrencia en pacientes con CRC, especialmente en los tejidos no tumorosas.
Apoyo a la Información
Métodos S1. -Metilación específica condición PCR.
ADN tratado con bisulfito se sometió a una MS-PCR utilizando pares de cebadores diseñados para amplificar específicamente los genes diana. La solución de reacción (15 l) contenía HotStart Taq Premezcla (7,5 l) (RBC Bioscience, Taipei, Taiwán), el ADN tratado con bisulfito (0,6 l), y 0,6-mu l alícuotas de cebadores directo e inverso. El primer secuencias de
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se han descrito anteriormente. [14] La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el ciclismo condiciones metilado y no metilado cebadores implicados desnaturalización a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 35 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, hibridación a 62 ° C, 60 ° C, y 53 ° C durante 35 segundos, y 72 ° C durante 30 segundos, y una extensión final a 72 ° C durante 4 minutos. Los productos de PCR se mezclaron con un colorante de ADN (Bioman, Taipei, Taiwan), se sometió a electroforesis en gel horizontal en un gel de agarosa al 2% durante 25 minutos, y se tiñeron con bromuro de etidio durante 10 minutos. Los resultados se analizaron bajo ultravioleta transiluminación (UV), que se muestra en la Fig S1. Métodos de estadística. En este estudio, los pacientes se clasificaron de acuerdo con la metilación de 3 genes diana. Las medidas de resultado primarias fueron CRC recurrencia y mortalidad. Las personas-años de seguimiento se utilizaron para calcular las tasas de recurrencia y mortalidad de CRC, a partir de la fecha de la resección quirúrgica y continuando hasta la fecha de diagnóstico de CCR recurrencia, fecha de la muerte, o el 31 de diciembre de 2012. Una de Kaplan Meier y un modelo de riesgos proporcionales de Cox se utilizaron para analizar el estado del paciente metilación y la información clínica al inicio del estudio, y sus asociaciones con CCR recurrencia o mortalidad durante el seguimiento, después de ajustar por covariables potenciales de confusión. Las proporciones ajustadas de riesgo (CR) y los intervalos de confianza del 95% (IC) se calcularon para evaluar el estado de metilación como un predictor de riesgo de CCR recurrencia. Los potenciales variables de confusión en el modelo fueron el sexo, la edad de la cirugía (tratada como una variable continua), la localización del tumor, y la quimioterapia adyuvante. Los CRI ajustados se calcularon para cada categoría. Las asociaciones entre el estado de metilación del ADN y el riesgo de CCR recurrencia y mortalidad fueron evaluados mediante análisis estratificados de acuerdo a la etapa del cáncer clínica inicial (I-IV). Para probar una tendencia lineal a través de la etapas del cáncer y los estados de metilación clínica en subtipos de tejidos, se utilizó la tasa de incidencia de CCR recurrencia en cada categoría como una variable continua en un modelo multivariable
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S1 Fig. gel de agarosa se representa el estado
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gen metilado o no metilado de pacientes con CRC
T:. tejido tumoral; N: tejido normal; MR: marcador de referencia del tamaño del producto de PCR; U: no metilación; M: la metilación. Por la calidad de la PCR específica de metilación, controles experimentales fueron presentados por el CMB de las personas sanas, y dos líneas celulares de adenocarcinoma colorrectal humano (HT29 y DLD1). El agua era para control negativo para este experimento
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123396.s002 gratis (TIF)
S1 Resultados. Nuestros resultados de las asociaciones entre las diferentes etapas de cáncer y CRC recurrencia y mortalidad se observó un incremento escalonado significativa en el CCR recurrencia y mortalidad entre los pacientes la etapa IV-I (
p Hotel & lt; 0,001). La
estadio III y IV pacientes se asociaron con un riesgo significativamente mayor de recurrencia CRC en comparación con la fase I de pacientes, con CRI ajustados (IC del 95%) de 19,37 (2,59 a 145,05) y 56,36 (7,42 a 428,09), respectivamente. Los pacientes en estadio IV se asociaron con un riesgo significativamente mayor de mortalidad en comparación con la fase I de pacientes, con un HR ajustado (IC del 95%) de 5,76 (1,99 a 16,61). Se incluyeron la etapa I y II, los pacientes en el subgrupo fase local, y la etapa III y IV los pacientes en el subgrupo etapa avanzada. Los pacientes en el subgrupo en estadio avanzado se asociaron con mayor riesgo de CCR recurrencia y mortalidad en comparación con los pacientes en el subgrupo fase local, con CRI ajustados (IC del 95%) de 6,73 (3,56-12,71) y 1,75 (0,94-3,28), respectivamente
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123396.s003 gratis (DOCX)