Extracto
Antecedentes
propagación del cáncer a otros órganos es la principal causa de muerte de los pacientes oncológicos. La migración de las células cancerosas de un tumor primario es el paso crucial en el complejo proceso de la metástasis, por lo tanto, el bloqueo de este proceso es actualmente la principal estrategia de tratamiento. inhibidores de la metástasis derivados de productos naturales, tales como, migrastatin, son agentes contra el cáncer muy prometedores. Por lo tanto, el objetivo de nuestro estudio fue investigar el efecto de seis análogos migrastatin (MGSTA-1 a 6) sobre la migración y la invasión de líneas celulares de adenocarcinoma mamario caninos aislados de tumores primarios y sus metástasis a los pulmones. tumores mamarios caninos constituyen una herramienta valiosa para el estudio de los aspectos múltiples de cáncer humano
Resultados
Nuestros resultados mostraron que dos de los seis análogos sintéticos totalmente de migrastatin:. MGSTA-5 y MGSTA-6 fueron potentes inhibidores de células de cáncer mamario de la migración y la invasión canino. Estos datos fueron obtenidos utilizando la herida prueba de curación, así como los ensayos de migración e invasión trans pocillos. Además, el tratamiento de las células cancerosas con el compuesto más eficaz (MGSTA-6) perturbado unión entre filamentoso F-actina y fascin1. Los análisis de microscopia confocal reveló que el tratamiento con MGSTA-6 aumentó la presencia de fascin1 no unido y la reducción de co-localización de F-actina y fascin1 en células de cáncer caninos. Lo más probable, los filamentos de actina no fueron reticulados por fascin1 y no generan la arquitectura filopodial típico de los filamentos de actina en respuesta a la actividad de MGSTA-6. Por lo tanto, la administración de MGSTA-6 resultados en la disminución de la formación de protuberancias filopodios y fibras de estrés en las células cancerosas mamarias caninas, que provoca una inhibición de la migración y la invasión del cáncer.
Conclusión
Dos análogos sintéticos migrastatin (MGSTA -5 y MGSTA-6) mostraron ser prometedores compuestos para la inhibición de la metástasis del cáncer. Pueden tener efectos terapéuticos beneficiosos en el tratamiento del cáncer en perros, especialmente en combinación con otros medicamentos contra el cáncer. Sin embargo, aún más
en
in vivo son necesarios
estudios para verificar esta hipótesis
Visto:. Majchrzak K, D Lo Re, Gajewska M, M Bulkowska, Homa A, Pawłowski K, et al. (2013) la migración de células Migrastatin Análogos de inhibición canina cáncer mamario y la invasión. PLoS ONE 8 (10): e76789. doi: 10.1371 /journal.pone.0076789
Editor: Waldemar Debinski, Wake Forest University, Facultad de Medicina, Estados Unidos de América
Recibido: 22 de mayo de 2013; Aceptado: 4 Septiembre 2013; Publicado: 8 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Majchrzak et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la beca número N N308 574940 del Ministerio de Ciencias y Educación Superior de Polonia y la Fundación Científica de Irlanda (número de concesión 07 /IN.1 /B966). La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Programa Personas (acciones Marie Curie) del Programa de la Unión Europea Séptimo Programa Marco (FP7 /2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención número REA PIEF-GA-2011 a 299.042. Este trabajo fue apoyado por CM1106 Acción COST. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la metástasis es la causa de la mayoría de las muertes por cáncer [1,2]. A pesar de que es investigado extensivamente, sigue siendo uno de los aspectos más inescrutables de la enfermedad. Los malos resultados de las terapias actuales, en especial mal pronóstico para los pacientes en etapas avanzadas de los tumores sólidos, debido a la metástasis animan a los investigadores de todo el mundo para encontrar nuevos fármacos que podrían inhibir la cascada metastásica. Un agente prometedor es el migrastatin producto natural: un nuevo compuesto anti-metastásico de origen microbiano. Es un producto natural macrolactona aislado originalmente de
Streptomyces sp
. MK929-43F1 por Imoto et al. en 2000 [3-5] y más tarde de
Streptomyces platensis fotos: por Licari et al. en 2002 [6] como un inhibidor de la migración de células tumorales. A tan sólo unos pocos años más tarde se informó de la primera síntesis química total de migrastatin [7,8]. Desde entonces, varios análogos más eficaces de migrastatin se han sintetizado y descrito como fármacos anti-metastáticos prometedores [8-13]. Se han hecho esfuerzos por generar nuevos análogos para estudios de estructura-actividad [14-17]. Es importante destacar que la actividad, los análogos más simples de migrastatin, tales como el macrólido MGSTA-8 (Figura 1), han demostrado ~ 1000 veces más activo que migrastatin sí en ensayos de migración de células tumorales
in vitro
[9]. análogos truncados, tales como MGSTA-4 y la macroketone MGSTA-5 y MGSTA-8 inhibir la metástasis de células tumorales altamente metastásicas en modelos de ratón [10,12]. Sin embargo, la inhibición de la célula capacidad migratoria depende considerablemente de la estructura de los compuestos y algunos análogos acíclicos muestran actividad [11,14,15].
El mecanismo molecular por el cual migrastatin afecta a la migración de células de cáncer y la invasión no ha sido completamente descubierto, aunque se ha propuesto para apuntar fascin1, la proteína actina agrupación [18]. Migrastatin puede unirse a uno de los sitios de unión a actina que impiden actina entrecruzamiento de filamentos y la formación de filopodios [18]. La sobreexpresión de la
fascin1
en células de cáncer ha sido previamente vinculados con el carácter de evolución rápida del tumor, mal pronóstico y se acorta el tiempo de supervivencia libre de enfermedad [18-20].
Nuestros estudios previos han demostrado sobre regulación de
fascin
en líneas mamarias caninas altamente invasivos de células de cáncer [21]. Por lo tanto, los utilizó como un modelo para la investigación de fármacos fascin-orientación, como la migrastatin. Por lo tanto, se examinaron un papel de seis diversos análogos de migrastatin MGSTA-1-6, incluyendo el macroketone Danishefsky (MGSTA-5) y macrolactona (MGSTA-4), en la invasión de células de cáncer mamario canino, la migración y la reorganización del citoesqueleto.
los tumores mamarios caninos son modelo atractivo y útil para estudiar el cáncer de mama humano porque capturan la esencia de los cánceres de mama humanos, a diferencia de la mayoría genéticamente modificado o modelos de xenoinjerto de roedores. En primer lugar, los perros comparten el mismo entorno que los seres humanos, por lo que están expuestos a muchas de las mismas carcinógenos. En segundo lugar, aquellos tumores ocurrir en perros natural y espontánea y tienen un curso idéntica a la de los seres humanos. Numerosas similitudes clínicas han demostrado hasta el momento, en relación con la etiología hormonal de los tumores, la edad de inicio, los factores de riesgo (por ejemplo, obesidad), los resultados clínicos, factores de pronóstico (por ejemplo, el tamaño del tumor, la invasión de los ganglios linfáticos y la etapa clínica) (para una revisión, véase: [ ,,,0],22-24];). Además, muchas similitudes fuertes y significativos a nivel molecular han demostrado en estudios comparativos de todo el genoma. Por ejemplo, las vías relacionadas con la promoción de la proliferación fueron reguladas en ambas especies, y los relacionados con el desarrollo celular, la adhesión celular de la matriz, y la comunicación de las células, se redujeron regulado [23]. Por otra parte, la sobreexpresión de los receptores de esteroides, marcadores de proliferación, factor de crecimiento epidérmico, las mutaciones del gen p53 supresor, metaloproteinasas y ciclooxigenasas, se encontró que en ambas especies, así como una gran homología en las alteraciones de las vías relacionadas con el cáncer tales como la fosfatidilinositol 3-quinasa ( PI3K) /Akt, KRAS, fosfatasa y tensina homólogo (PTEN), Wnt-β-catenina, y la mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) en cascada [23,25]. Por lo tanto, el modelo de tumor mamario canino constituye una valiosa herramienta para la medicina traslacional en particular para la evaluación y el desarrollo de aplicaciones de diagnóstico y pronóstico, así como novedosas estrategias terapéuticas que beneficiarán a los perros y los pacientes humanos con cáncer [22-26].
Métodos
cultivo de células
Las líneas celulares utilizadas para este estudio se han descrito en nuestro estudio publicado anteriormente [21,27]. Dos líneas celulares de adenocarcinoma fueron aisladas de los tumores caninos mamarias (CMT-W1 y CMT-W2) y dos líneas de células fueron aisladas de sus metástasis pulmonares (CMT-W1M y CMT-W2M). Las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640 que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 50 U /ml de penicilina, 50 mg /ml de estreptomicina y 2,5 mg de anfotericina B /ml (reactivos obtenidos de Sigma Aldrich Chemical Co., EE.UU.). Las células se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos (Nunc ™, Dinamarca) en una atmósfera de 5% de CO2 y 95% de aire humidificado a 37 ° C, y se subcultivaron de forma rutinaria cada segundo día.
Migrastatin análogos
Las estructuras de los análogos ensayados (migrastatin MGSTA-1 a 6) se presentan en la Figura 1.
Síntesis de análogos de migrastatin
Compuesto MGSTA-4 y MGSTA-5 se sintetizan a partir de 9 , como se informa en la literatura [9] mientras que los compuestos MGSTA-1 a 3 y MGSTA-6 se prepararon a partir 9 [9] como se ilustra en la figura 2. por lo tanto la esterificación de 9 con ácido 5-hexenoico en condiciones de Mitsunobu seguido de la metátesis de cierre del anillo (RCM) dio 10 y posterior eliminación del grupo TBS dio MGSTA-1. El tratamiento de 9 con tetrabromuro de carbono en presencia de trifenilfosfina soportada en polímero en diclorometano dio el bromuro alílico 11 [9]. La posterior reacción de β-ketosulfone 12 en presencia de DBU seguido de la eliminación reductora del grupo sulfona dio 13. anillo de cierre de metátesis y la retirada del grupo TBS dio MGSTA-2. La tiolactona se preparó a partir 14 que fue primero de todo convertido en el ácido tio 15 usando el reactivo de Lawesson [28]. La formación de la tiolactona bajo condiciones de Mitsunobu, RCM y extracción TBS dio MGSTA-3. El TBS protegida macroketone 16 se preparó a partir 9 como se describe anteriormente [9]. Formación del éter TMS enol se logró de manera regioselectiva y la oxidación subsiguiente con Pd (OAc)
2 dio el α, β-insaturados macroketone 17. Por último, la eliminación del grupo protector TBS dio macroketone insaturado MGSTA-6.
Reactivos y condiciones: (a) ácido 5-hexenoico, Ph
3P, DIAD, PhCH
3, rt, 3h, 69%; (B) Grubbs 2
nd, PhCH
3, reflujo, 25 min, 68%; (C) HF. Py, THF, rt, 18 h, 61%; (D) CBr
4, Ph
3P unido a polímero, CH
2Cl
2, rt, 50 min; (E) 12, DBU, PhCH
3 a continuación, 11, rt, 1,5 h; (F) Na /Hg, MeOH, rt, 3h, 51% en tres pasos; (G) Grubbs 2
nd, PhCH
3, reflujo, 15 min, 99%; (H) HF. Py, THF, rt, 38h, 84%; (I) reactivo de Lawesson, CH
2Cl
2, mw, 100 ° C, 10 min; (J) 9, Ph
3P, DIAD, PhCH
3, rt, 15h, 42%; (K) Grubbs 2
nd, PhCH
3, reflujo, 15 min, 88%; (L) HF. Py, THF, rt, 18h, 85%; (M) TMSCl, LHMDS, THF, 0 ° C, 2 h; (N) Pd (OAc)
2, CH
3CN, rt, 3h, 64% en dos etapas; (O) HF. Py, THF, rt, 18 h, 90%.
ensayo de viabilidad celular (MTT-ensayo)
La viabilidad celular (actividad metabólica de las células viables) se cuantificó mediante el ensayo de MTT. Las células fueron sembradas en placa de 96 pocillos (Nunc Inc., Dinamarca) a la concentración de 1 x 10
4 células por pocillo. Cuando las células alcanzaron un 60-70% de confluencia, el medio se reemplazó con medio que contenía FBS 10% y seis diversos análogos migrastatin (MGSTA-1 a 6) en las concentraciones de: 1, 10 o 100 m. Los cultivos se incubaron durante 24 horas. Luego, las células se incubaron con 0,5 mg ml MTT sal /tetrazolio diluido en rojo fenol libre de RPMI 1640 (Sigma Aldrich) durante 4 horas a 37 ° C. Para completar la solubilización de los cristales de formazano, se añadieron 100 l de DMSO (dimetil sulfóxido, Sigma Aldrich) a cada pocillo. La viabilidad celular se cuantificó midiendo la absorbancia fotométrica a 570 nm en un lector de placas de múltiples pocillos (Infinito 200 PRO Tecan ™, TECAN, Suiza). Todas las muestras se examinaron por triplicado, cada experimento se llevó a cabo tres veces (n = 9).
Cultivo de células sobre una membrana basal reconstituida (Matrigel)
Las células de cáncer se trataron con tripsina y se resuspendieron en medio de cultivo. Cada pocillo de las Lab-Tek portas de cultivo de 8 cámaras (Nunc Inc., EE.UU.) se recubrió con 25 l de factor de crecimiento reducido Matrigel (BD Biosciences) y los portaobjetos se dejaron solidificar durante 30 minutos. a 37 ° C. Después las células se colocaron en placas a una concentración de 10
4 células /ml en medio que contiene analógico-migrastatin o medio con la adición de DMSO (vehículo de fármaco). El crecimiento de las células en Matrigel se observó todos los días bajo microscopio de contraste de fase (IX 70 Olympus Optical Co., Alemania). El experimento se llevó a cabo tres veces (n = 3).
in vitro
heridas ensayo de curación (prueba de arañazos)
El ensayo de rayado se realizó para evaluar la influencia de migrastatin análogos de en canino mamaria motilidad de células de carcinoma. Las células se sembraron en una alta densidad en 600 mm placas de Petri (Corning-Costar, Cambridge, EE.UU.). Después de 24 horas, se retiró el medio y se reemplazó con medio que contiene 10% de FBS y uno de los seis análogos migrastatin (MGSTA-1 a 6) o DMSO (control). La monocapa fue herido por el rascado de la superficie: la manera más uniforme y recto como sea posible con una punta de pipeta (1000 l) al menos tres veces. Las imágenes de células que invaden el cero fueron capturados en los puntos de tiempo indicados (0, 4, 6, 8 y 24 horas) utilizando microscopía de contraste de fase (IX 70 Olympus Optical Co., Alemania). Las imágenes se analizaron mediante un analizador de imágenes asistida por ordenador (Análisis de imagen Olympus Microfilm ™, el software de la versión 4.0 para Windows, EE.UU.). La tasa de migración se expresó como porcentaje de cierre cero y se calculó como sigue:% de cierre cero = ab /a, donde (a) es una distancia entre bordes de la herida, y (b) es la distancia que se mantuvo libre de células durante la migración celular para cerrar la herida [29].
los valores se presentan como media de tres campos independientes de la herida de tres experimentos independientes (n = 9).
ensayo de migración trans-bien
ensayo de migración de células en la cámara de Boyden se realizó utilizando el BD Falcon ™ Fluoroblock ™ 24-multipocillos placas de inserción (8 micras de tamaño de poro) (BD Biosciences, EE.UU.). En primer lugar, las células (1 × 10
5) se suspendieron en medio libre de FBS y se añadieron a las cámaras apicales de las placas de un inserto (500 l). A continuación se añadieron 750 l de quimioatrayente (10% de FBS) a las cámaras basales. se añadieron los análogos de Migrastatin (MGSTA-5 o MGSTA-6 a 100 mM) o DMSO (como control) para el medio en ambas cámaras. Para los estudios dependientes de la dosis se utilizó MGSTA-6 en el intervalo de concentración de 0,1 a 100 mM. Migración ensayos se llevaron a cabo durante 18-20 horas en condiciones normales de cultivo. A continuación, el medio se retiró cuidadosamente de la cámara apical y el sistema de inserción se transfirió a una segunda placa de 24 pocillos que contenía 500 l de 2,5 /ml de calceína AM en Hanks 'Balanced Salt Solution g (HBSS). Las placas se incubaron durante una hora a condiciones de cultivo estándar. A continuación, la fluorescencia de células migradas se midió a longitud de onda de excitación de 485 nm y longitud de onda de emisión de 530 nm utilizando un lector de placa fluorescente con capacidades de lectura de fondo Infinito 200 PRO Tecan ™ (Tecan, Suiza). Todas las muestras se ensayaron por triplicado, y cada experimento se llevó a cabo tres veces (n = 9). Para cada experimento se utilizaron dos controles negativos: (1) células cultivadas como anteriormente sin añadir quimioatrayente para el medio, y (2) añadido medio como se describe sin células. Con el fin de determinar la fluorescencia de las células que migraron a través de la membrana, las placas se analizaron mediante microscopio de fluorescencia (Olympus BX60, ampliación x4).
Trans-así ensayo de invasión
El ensayo de invasión celular se realizó usando el BD BioCoat ™ 24-Multiwell Sistema Invasion pre-recubierto con BD Matrigel ™ Matrix (BD Biosciences, EE.UU.). Las placas de inserción se prepararon en primer lugar por la rehidratación de la capa de matriz BD Matrigel ™ con PBS caliente durante dos horas a 37 ° C. La solución de rehidratación fue cuidadosamente eliminado, y se añadieron 500 l de suspensión de células a las cámaras apical (2,5 × 10
5 células). La suspensión celular fue preparado por tripsinización monocapas de células (80% confluentes) y resuspendiendo las células en medio libre de FBS. A continuación se añadieron 750 l de quimioatrayente (10% de FBS) a las cámaras basales. Para el experimento, se añadieron MGSTA-6 o DMSO (como control) al medio en ambas cámaras. placas de ensayo de invasión se incubaron durante 22-24 horas en condiciones de cultivo estándar. A continuación, el medio se retira cuidadosamente del sistema de cámara y el inserto apical se tiñó con calceína AM en HBSS de la misma manera como se describe en el ensayo de migración. A continuación, se midió la fluorescencia de las células invadidas utilizando el lector de placas fluorescente Infinito 200 PRO Tecan ™ (Ext.485 nm /Ems. 530 nm) (TECAN, Suiza). Todas las muestras fueron analizadas por triplicado, cada experimento se llevó a cabo tres veces (n = 9). Para cada experimento, el control negativo constituido medio donde no se añadió quimioatrayente. Con el fin de determinar la fluorescencia de las células que invadieron a través de la membrana recubierta por Matrigel se analizaron las placas usando microscopio de fluorescencia (Olympus BX60, ampliación x4).
microscopía confocal
Las células cancerosas mamarias caninas eran crecido en portaobjetos de cultivo Lab-Tek recubiertas con Matrigel durante 24 horas en migrastatin que contenían medio (MGSTA-6 a la concentración de 100 mM). Luego, las células se lavaron dos veces en PBS caliente y se fijaron con 3,7% de paraformaldehído durante 20 min a temperatura ambiente (RT). A continuación, las células se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 diluido en PBS (10 min a RT), se lavaron en PBS tres veces y se incubaron con anti-fosfo-FSCN1 anticuerpo de conejo primario (Ser39) a 1: 100 dilución en PBS ( Bioss, EE.UU.). Después de la incubación durante la noche con anticuerpos primarios a 4 ° C, las células se lavaron tres veces en PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios Alexa Fluor 568 cabra anti-conejo diluido 1: 500 en PBS (Santa Cruz Biotechnology Inc., EE.UU.) y co-manchado para F -actina con FITC-faloidina X diluido 1: 100 en PBS (Invitrogen, EE.UU.) durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de microscopio utilizando SlowFade®Gold medio de montaje (Life Technologies, Invitrogen). Las células se visualizaron utilizando el microscopio confocal de barrido láser FV-500 del sistema (Olympus Optical Co, Hamburgo, Alemania). La combinación de excitación /emisión fueron: El láser de argón de 488 nm con filtro de 505-525 nm para láser de 543 nm FITC y He-Ne con 610 nm filtro de Alexa Fluor 568 tinción. Las imágenes se recogieron por separado para cada canal de fluorescencia. Las células se examinaron usando el programa Fluoview (Olympus Optical Co, Alemania). Para cuantificar los resultados confocal, hemos analizado la intensidad de la fluorescencia roja relacionada con fascin1 expresión y la intensidad colorimétrica de puntos que muestran la co-localización de fascin1 y F-actina en las imágenes de combinación, utilizando el analizador de imágenes asistido por ordenador (Análisis de imagen Olympus Microfilm ™ , versión de software 5.0 para windows, EE.UU.). Se analizaron cinco a diez imágenes en cada diapositiva. La intensidad de color de punto de antígenos se expresan como media píxel densidad óptica integrada (IOD).
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism versión 5.00 (GraphPad Software, EE.UU.). El ANOVA de una vía y de Tukey HSD (la diferencia honestamente significativa) prueba post-hoc, la prueba de Dunnett y
t-test
se aplicaron así como el análisis de regresión. El valor de p & lt; 0,05 fue considerado significativo, mientras que el valor p & lt; 0,01 y & lt; 0.001 como altamente significativa. Los datos se expresan como medias +/- S.D. a menos que se indique lo contrario. El
in vitro
herida se analizó usando el ensayo de curación ANOVA de dos vías RM y Bonferroni post-hoc test.
Resultados y Discusión
El efecto de seis análogos de migrastatin en la viabilidad de las células cancerosas
En primer lugar, se investigó si los análogos de migrastatin examinados afectados viabilidad celular. Cuatro de estos compuestos químicos (MGSTA-1, MGSTA-3, MGSTA-5, y MGSTA-6) no cambió la viabilidad de células de cáncer de canino en cualquier concentración usada (Figura S1). Sin embargo, la viabilidad de las células CMT-W1 y CMT-W2 disminuyó significativamente (en aproximadamente un 29% y 32%, respectivamente) después del tratamiento con MGSTA-4 a la concentración de 100 mM (p & lt; 0,01) (Figura S1A, B ). La viabilidad de las células CMT-W1 también disminuyó después de la incubación con MGSTA-2 en aproximadamente un 26% (Figura S1A). La disminución de la viabilidad celular después del tratamiento con 100 mM de MGSTA-4 y MGSTA-2 podría estar relacionada con su citotoxicidad, por lo tanto, en los siguientes experimentos, estos compuestos se utilizaron a la concentración de 10 mM para asegurar que el efecto observado de estos compuestos sobre la migración y la invasión no fue resultante de la inhibición de la proliferación celular o la muerte celular por inducción.
a la inversa, también se observó, que las concentraciones más bajas de otros análogos de migrastatin causó un ligero aumento en la viabilidad de células de cáncer (por ejemplo MGSTA -5 o MGSTA-6 en la línea celular de CMT-W1; líneas de células CMT-W2M) (Figura S1) MGSTA-1, MGSTA-2 en la línea celular de CMT-W2 y MGSTA-3 en la CMT-W1M y. Por lo tanto, para evitar posibles promoción del crecimiento de células de cáncer por compuestos tratados, en los siguientes experimentos hemos utilizado la concentración más alta posible (100 mM) que no afectó la viabilidad celular (ni disminución ni aumento de su viabilidad). Además, los estudios anteriores realizados en la línea celular de cáncer de pulmón A549 humano demostraron que concentraciones más bajas de los análogos de migrastatin (ME - éter núcleo migrastatin) no afectó la migración celular [13]. Además, un estudio realizado por Shen y colaboradores [11], en el que se investigaron dieciocho congéneres migrastatin producidos diferente semi-sintéticamente, reveló que sólo dos compuestos muestran inhibición de la migración de células IC
50 valores por debajo de 100 mu M en el ensayo de curación de la herida .
la inhibición de la migración de las células del cáncer de mama canino por análogos de migrastatin evaluados por herida de ensayo curativas
in vitro
la herida ensayo de curación se llevó a cabo con el fin de caracterizar el efecto de análogos de migrastatin sobre la migración de células de cáncer canina. Como se muestra en la Figura 3 dos de los seis compuestos examinados (MGSTA-5 y MGSTA-6) causada fuerte efecto inhibidor sobre la migración de células de cáncer en el CMT-W1, CMT-W1M y líneas de células de CMT-W2. Además, también MGSTA-2 era bastante eficaz en la línea celular de CMT-W2 en los puntos de tiempo 4, 6 y 8 horas después del rascado. Mientras que en las células condición de control cerrado 39,2 ± 6,8%, 57 ± 7,5% y 84 ± 9,4% de la herida (después de 4, 6 y 8 h, respectivamente), después de las células de la administración MGSTA-2 cerrados solamente 19,9 ± 2,1%, 29,6 ± 9,9% y el 38,9 ± 8,8% de la herida, respectivamente. Sin embargo, después de 24 horas la herida estaba completamente cerrada, como en la condición de control (Figura 3B). La migración celular no se vio afectada por cualquiera de los análogos de migrastatin examinados en la línea de células CMT-W2M (datos no mostrados).
La cuantificación de la migración de CMT-W1 (A), CMT-W2 (B) CMT- W1M (C) líneas de células se presentan como porcentajes de cierre cero y se calcularon como sigue:% de cierre cero = ab /a, donde (a) es una distancia entre bordes de la herida, y (b) es la distancia que se mantuvo libre de células durante la migración celular para cerrar el cero. Las fotografías de las células que invaden el cero fueron tomadas en el punto de partida y después de 4, 6, 8, y 24 horas utilizando microscopía de contraste de fase (IX 70 Olympus Optical Co., Alemania). La administración de MGSTA-5 y MGSTA-6 (100 mM) disminuyó la motilidad células de CMT-W1, W2 y CMT-líneas de células CMT-W1M. El tratamiento MGSTA-2 se redujo la motilidad de las células sólo en la línea de células CMT-W2. Otros análogos migrastatin no afectan la capacidad de migración de las líneas celulares examinadas. (D) Imágenes representativas de cierre cero en condiciones de control y después de MGSTA-5 y MGSTA-6 tratamiento (100 M) en el 8
º horas después de rascarse en el CMT-W1, CMT-W2 y líneas de células CMT-W1M; las imágenes fueron tomadas con lente con magnificación de 4x y se analizaron usando un analizador de imágenes asistido por ordenador (Análisis de imagen Olympus Microfilm ™, el software de la versión 5.0 para Windows, EE.UU.). El experimento se realizó tres veces. Se aplicaron dos vías ANOVA y pruebas post-hoc de Bonferroni. p & lt; 0,05 fue marcado como * y p & lt; 0.001 se caracterizó como ***.
El MGSTA-5 que se presentan a la concentración de 100 mM inhibieron la migración de CMT-W1, CMT-W1M y células CMT-W2 en respuesta a la herida cero. Las células CMT-W1 tratados con MGSTA-5 cerradas solamente 29 ± 6,5% y 56 ± 5,2% de la herida (después de 6 y 8 h, respectivamente), mientras que en condiciones de control, 50 ± 7,2% y 78 ± 7,8% de la herida se cerró 6 y 8 horas después de rascarse, respectivamente (Figura 3A). Del mismo modo, las células CMT-W2 incubadas con MGSTA-5 (100 M) cerrados solamente 30 ± 3,8% y 43 ± 3% de la herida 6 y 8 horas después del rascado (respectivamente), mientras que en las condiciones de control cerraron 57 ± 7,5% y 84 ± 9,4% de la herida en ese momento (6 y 8 horas respectivamente) (Figura 3B). Del mismo modo, también las células CMT-W1M incubadas con este compuesto cerrados 21 ± 7,7% y 30 ± 7,4% de la herida 6 y 8 horas después de rascarse, respectivamente, mientras que las células de control cerrado 59 ± 6,3% y 80 ± 8,7% de la herida en los mismos puntos de tiempo (Figura 3C). Por otra parte, las líneas de células CMT-W2 y CMT-W1M tratados con MGSTA-5 no cerraba la herida, incluso después de 24 horas de rascado (74 ± 7,3% y el cierre de 52 ± 7,8%, respectivamente). En condiciones de control, la herida estaba completamente cerrada (Figura 3B, C).
El MGSTA-6 también resultó ser un inhibidor muy eficaz de la migración. La línea de células CMT-W1 tratado con este agente cerró sólo un 25 ± 5,1% y un 37 ± 2,8% de la herida 6 y 8 horas después de rascarse (Figura 3C). El tratamiento de células CMT-W2 con MGSTA-6 disminuyó también su capacidad de migración. Fue muy significativo 8 y 24 horas después del rascado. En condiciones de control de la herida fue casi completamente cerrado en ese momento (86-100%), mientras que las células tratadas con MGSTA-6 cerraron sólo un 52 ± 8,1% y 78 ± 5,2% de la herida, respectivamente (Figura 3B). El MGSTA-6 causó un efecto similar en la línea celular CMT-W1M, que se manifestó por el bloque casi completa de la migración (9 ± 6,8% y 21 ± 3,7% de cierre de la herida 6 y 8 horas después de rascarse, respectivamente). Después de 24 horas sólo el 41 ± 4,2% de la herida se cerró (Figura 3C).
Danishefsky y colaboradores obtuvieron resultados similares [13]. Los autores investigaron las propiedades anti-metastásicos de éter núcleo migrastatin (ME) y éter migrastatin carboximetilcelulosa (CME). Ambos compuestos dados a la concentración de 100 mM casi completamente bloqueado migración de carcinoma de pulmón de células no pequeñas humano 12 horas después de cero. Los autores del ensayo basado en la cicatrización de heridas determinaron la mitad de la concentración inhibitoria máxima de migración (IC
50 valor), que fue inferior a la obtenida en nuestra investigación con el uso de ensayo de migración trans-pozo (más adelante). La inhibición más eficaz de la migración en tres líneas celulares de cáncer de canino, evaluada por el ensayo de curación de la herida se logró con MGSTA-5 y MGSTA-6 a una concentración de 100 mM, y estos dos se utilizaron para caracterización adicional. Aunque el MGSTA-2 inhibe la capacidad de migración de las células CMT-W2 era ineficaz en otras líneas celulares. A su vez, el MGSTA-4 ( 'macrolactona' Danishefsky) a alta concentración de 100 mM proliferación celular significativamente inhibido de dos líneas celulares (CMT-W1 y CMT-W2) (Figura S1A, B), pero en menor concentración (10 mM ) no tuvo ningún efecto sobre la migración celular (Figura 3). Estas discrepancias pueden deberse a diferentes características de las líneas celulares caninas.
La inhibición de la migración y la invasión de las células cancerosas mamarias caninas por dos los análogos más eficaces de migrastatin (MGSTA-5 y MGSTA-6) evaluados por cámaras de Boyden ensayo de
Para confirmar la actividad anti-metastática de dos compuestos que eran los más eficaces en el ensayo de cicatrización de la herida, se realizaron los ensayos de migración e invasión en cámaras de Boyden.
migración de las células del cáncer se redujo significativamente después de 24 horas de incubación con 100 mM de líneas de células CMT-W1M MGSTA-5 y MGSTA-6 en CMT-W1 y. La intensidad de la fluorescencia en relación con las células que migran en condiciones de control fue de 10,3 ± 2,5, y 19,7 ± 3,1 en CMT-W1 y la línea de CMT-W1M celular, respectivamente, mientras que, el tratamiento con macroketone MGSTA-5 disminuyó las unidades fluorescentes relativas (RFU) a 5,6 ± 1,2 y 14,2 ± 2,1 en el CMT-W1 y línea celular CMT-W1M, respectivamente (Figura 3A). Se obtuvo un efecto similar en las células tratadas con MGSTA-6. RFU disminuyó a 4,2 ± 1,2 y 3,8 ± 1 en CMT-W1 y línea celular CMT-W1M, respectivamente (Figura 4A). La migración de las células de CMT-W2 fue casi completamente inhibida por estos compuestos. Sin embargo, no se observó ningún efecto sobre la migración de las células de CMT-W2M, aunque una ligera disminución se observó (Figura 4A).
(A) La cuantificación de la migración de las líneas celulares examinadas (CMT-W1, CMT-W1M , CMT-W2, CMT-W2M) se presenta como relativa Unidades fluorescentes (RFU) obtenida utilizando un lector de placas fluorescente Infinito 200 PRO Tecan ™ (Ex. 485, Em. 530). El tratamiento de las células cancerosas con MGSTA-5 y MGSTA-6 durante 20 horas a la concentración de 100 mM disminuyó la migración a través de la membrana de CMT-W1, y las células CMT-W1M y casi abolió completamente la migración de las células de CMT-W2. En línea de células CMT-W2M aquellos compuestos eran ineficaces. El experimento se realizó tres veces. El análisis estadístico se realizó utilizando el software Prism versión 5.00 (GraphPad Software, EE.UU.). ANOVA de un factor seguido por el test post-hoc de Tukey HSD y la prueba t no pareada se aplicaron. p & lt; 0,05 fue marcado como *, p & lt; 0.001 se caracterizó como ***. (B) Las micrografías de las células migraron CMT-W1, CMT-W1M y CMT-W2 tomadas con microscopía Olympus BX60 con un aumento de x4.
El ensayo de invasión de las células cancerosas se realizó sólo con el más potente análogo de migrastatin (MGSTA-6). La invasividad de CMT-W1, CMT-W1M y líneas celulares de cáncer canino CMT-W2 se redujo significativamente por este compuesto se administra a una concentración de 100 mM durante 24 horas. La intensidad de la fluorescencia en relación con las células CMT-W1, CMT-W1M y CMT-W2 invadido en condiciones de control fue de 11 ± 1,7, 9,7 ± 0,6, y 11,4 ± 1,5, respectivamente (Figura 5A). La administración de MGSTA-6 disminuyó la invasividad de las células cancerosas. La intensidad de fluorescencia en relación con las células CMT-W1, CMT-W1M y CMT-W2 invadido era 6,7 ± 0,6, 6,6 ± 0,6, 7,3 ± 0,7, respectivamente (p & lt; 0,005). La invasión de células CMT-W2M no fue afectada por MGSTA-6. El análisis microscópico realizó mediante microscopía de fluorescencia confirmó los resultados obtenidos (Figuras 4B y 5B).
(A) Cuantificación de la invasividad de las líneas celulares examinados (CMT-W1, CMT-W1M, CMT-W2, CMT-W2M ) se presenta como Unidades fluorescentes relativa (RFU) obtenido utilizando un lector de placas fluorescentes Infinito 200 PRO Tecan ™ (Ex. 485, Em.530). El tratamiento de las células cancerosas con MGSTA-6 durante 24 horas a la concentración de 100 mM disminuyó la capacidad de invasión a través de la membrana pre-recubierto por Matrigel ™ Matrix, de CMT-W1M, CMT-W2, las células CMT-W1M. En línea de células CMT-W2M MGSTA-6 fue ineficaz. El experimento se realizó tres veces. El análisis estadístico se realizó utilizando el software Prism versión 5.00 (GraphPad Software, EE.UU.).