Extracto
La interleucina-23 (IL-23) es una citoquina proinflamatoria convencional que juega un papel en la progresión tumoral mediante la inducción de la inflamación en el microambiente tumoral. Sin embargo, el papel de la IL-23 en la migración y la invasión del cáncer de tiroides sigue siendo poco clara. En el presente estudio, se observó que el tratamiento con IL-23, la migración inducida y la invasión de las células del cáncer de tiroides humanos. Los datos adicionales demuestran que
SOCS4
regula negativamente la migración mediada por IL-23 y la invasión. En la investigación de los mecanismos implicados en la IL-23 mediada por la migración y la invasión, se observó que el miR-25 promueve la migración y la invasión de las células del cáncer de tiroides uniéndose directamente a la 3'-UTR de
SOCS4 Windows que conduce a la inhibición de
SOCS4
. Además, también hemos demostrado que la IL-23 aumenta el miR-25 niveles de expresión, y sobreexpresa el miR-25 está implicada en la IL-23-asociado
SOCS4
la inhibición y la migración celular y la invasión. En conjunto, nuestros datos sugieren que la IL-23 induce la migración y la invasión de las células del cáncer de tiroides por mediación de la miR-25 /
SOCS4
vía de señalización
Visto:. Mei Z, S Chen, Chen C , Xiao B, Li F, Wang Y, et al. (2015) La interleucina-23 Facilita la migración de células del cáncer de tiroides y la invasión por inhibición de
SOCS4
Expresión a través de microARN-25. PLoS ONE 10 (10): e0139456. doi: 10.1371 /journal.pone.0139456
Editor: Zhiqian Zhang, la Universidad de Pekín Hospital del Cáncer & amp; Instituto, CHINA
Recibido: 19 Junio, 2015; Aceptado: 12 de septiembre de 2015; Publicado: 5 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Mei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por las becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81372880); el proyecto independiente de investigación de la Universidad de Wuhan (núm 2042014kf0184; NO 2042014kf0119.); el programa de doctorado del Fondo de Investigación de Educación Superior (Nº 20130141120093; Nº 20110141110062); la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Hubei (No.2012FFA045). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de tiroides es un tipo común de tumor maligno endocrino que ha mostrado un rápido aumento en la incidencia en todo el mundo durante las últimas décadas [1]. A pesar de las mejoras en las estrategias terapéuticas, algunos pacientes son difíciles de tratar y desarrollar la invasión y metástasis [2]. Por lo tanto, es esencial para identificar los mecanismos moleculares que subyacen a la invasión del cáncer de tiroides y metástasis. Informes recientes han demostrado que la inflamación es un fuerte promotor de la carcinogénesis y la malignidad en muchas formas de cáncer [3,4]. La inflamación parece ser un mediador importante para el desarrollo de cáncer y proporciona a las células de cáncer de un microambiente hospitalario [5]. La interleucina-23 (IL-23), un heterodimeric tipo 1 de citoquinas compuesto por el /la subunidad p40 de IL-12 y la subunidad p19 específico, pertenece a la superfamilia de la interleucina-6 [6]. Estudios anteriores han demostrado que la IL-23 se asocia con la carcinogénesis, así como la inflamación. Los altos niveles de IL-23 se encontraron en el carcinoma hepatocelular humano, carcinoma colorrectal, carcinoma escamoso, carcinoma de esófago y [7-10]. La evidencia sugiere que la sobreexpresión de IL-23 puede inducir la metástasis colorrectal, de pulmón y el cáncer oral [7-10].
Los supresores de la señalización de citoquinas (SOCS) son importantes reguladores de retroalimentación negativa de la señalización de citoquinas [11]. Las proteínas SOCS son una familia de proteínas (8 SOCS1-7 y un SH2 que contiene proteína citoquina inducible o CIS). Cada proteína SOCS contiene un dominio SH2 central que interactúa con tirosinas fosforiladas [12]. proteínas SOCS se han investigado recientemente por su papel en el desarrollo de diferentes tipos de cáncer [13-18]. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de SOCS4 en el carcinoma, y su posible influencia en el crecimiento del tumor y los tumores malignos.
Los microARN (miRNA) son una especie de pequeños ARN de cadena simple no codificantes que juegan un papel importante en el desarrollo de diferentes tipos de cáncer mediante la unión de la región 3 'no traducida (3'-UTR) de genes específicos [19]. miARN expresión aberrante También se ha informado con frecuencia en numerosos tumores [20]. En los últimos años, múltiples puntos de prueba en un papel de miRNAs en los procesos biológicos de células tumorales, incluyendo la proliferación celular, la diferenciación, la migración y la invasión [21]. El microARN-25 pertenece a la agrupación de miR-106b-25 que incluye el miR-106b, miR-93 y miR-25. MicroARN-25 se ha informado que se sobreexpresa de forma aberrante en varios tumores, como el cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y [22-26]. Aunque la expresión de miR-25 en diferentes tumores ha sido descrito, un papel claro para el miR-25 en el carcinoma de tiroides sigue siendo poco clara.
En este estudio, hemos demostrado que la IL-23 promueve la migración celular y la invasión del cáncer de tiroides . Además, demuestran que la IL-23 regula la migración y la invasión de las células del cáncer de tiroides a través de una vía de señalización de miR-25 /SOCS4.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todo los participantes dieron su consentimiento informado para participar en el estudio escritos. El estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y aprobado por el Comité de Ética del Hospital de la Universidad de Wuhan Remin, de conformidad con las directrices para la protección de los sujetos humanos.
Las muestras y los casos
tejidos tiroideos fueron recogidos en el hospital de la Universidad de Wuhan Remin desde febrero de 2010 y febrero de 2014. las muestras de tejido fueron cortados en dos partes, una que fue revisado por dos patólogos expertos para verificar el diagnóstico histológico, el otro se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido, y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta la extracción de ARN. Ninguno de los pacientes había recibido ningún tratamiento preoperatorio. Los tumores se clasifican de acuerdo a la Comisión Conjunta Americana del Cáncer (AJCC) patológica del tumor-nódulo-metástasis (TNM) classiication. Las características de los pacientes se describen en las Tablas S1 y S2.
Cultivo de células
líneas celulares de cáncer de la tiroides humana K1 (papilar) y WRO (folicular) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco BRL), 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg de sulfato de estreptomicina /ml. Las células se mantuvieron a 37 ° C en un 5% CO
2 incubadora. Todas estas líneas celulares fueron comprados originales del banco de células de la Academia de Ciencias de China, Shanghai
Reactivos
recombinante humano IL-23 (rhIL-23) fue adquirido de R & amp;.; D Systems ( Minneapolis, MN). Los anticuerpos monoclonales (ABS) contra SOCS4 humano y GAPDH se adquirieron de Sigma (St Louis, MO). Sintetizado químicamente imita miARN y miARN inhibidores fueron adquiridos de Ambion (Austin, TX, EE.UU.). TRIzol, Lipfectamine-2000, mezcla de enzimas se adquirieron de Invitrogen (Basilea, Suiza).
PCR cuantitativa en tiempo real
El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real se llevó a cabo para determinar los niveles de mRNA de los genes miARN y maduros. Para la detección cuantitativa microRNAs maduros, miRNAs totales se aislaron usando un kit de aislamiento de mirVana miRNA (Ambion), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total (2 mg) se reversetranscribed con cebadores Bulge-Loop madura miARN-específicos de transcripción inversa (Ambion) y el virus de la leucemia murina de Moloney la transcriptasa inversa (Promega). la cuantificación basada en la PCR cuantitativa en tiempo real de miRNAs se realizó usando los kits de análisis de miARN (Ambion), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de miRNAs se normalizaron a los de la snRNA U6 de control interno. Para detectar los ARNm celulares, el ARN total fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen, Basilea, Suiza). Las muestras de ARN celulares se transcrito de forma inversa usando cebadores aleatorios. PCR en tiempo real se realizó con un LightCycler 480 (Roche) y el sistema de SYBR Green (Applied Biosystems). GAPDH se amplificó como un control interno. Los cebadores usados este estudio se enumeran en la Tabla S3 y los productos SYBR verde verificadas por la secuencia.
Transwell ensayo
La migración celular y la invasión de ensayo se realizaron como se describe anteriormente [27]. Brevemente, las células se trataron con 50 ng ml rhIL-23 o tampón BSA /control para el tiempo y la dosis descrito y se observaron en consecuencia. El número medio de la migración y la invasión de las células se expresó como un porcentaje con respecto al control, que fue designado como 100%.
Cierre de la herida ensayo
Una herida se introdujo en las células confluentes monocapa utilizando una punta de micropipeta. Las fotografías fueron tomadas a 40 aumentos mediante microscopía de contraste de fase inmediatamente después de la incisión de la herida y en los puntos de tiempo seleccionados. Cierre de la herida se midió mediante el cálculo de densidades de píxeles en el área de la herida por el software de Cella (Olympus Biosystem Gmb, Hamburgo, Alemania) y se expresa como porcentaje de cierre de la herida de las áreas triplicados ± SD.
ensayo MTT
el (-2-il 4,5-dimetiltiazol) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo de 3- fue utilizado en la evaluación de la proliferación de células. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 5 x 10
3 células /pocillo. Veinticuatro horas más tarde, se llevó a cabo el ensayo de MTT. Por último, se determinó la densidad óptica a 570 nm utilizando el lector de placa ELISA (Modelo 550; Bio-Rad). se aseguraron al menos tres experimentos independientes.
Transfección y ensayo informador de luciferasa
Las células se sembraron en 24 pocillos o 6 pocillos platos, dependiendo del experimento, y se hicieron crecer hasta la confluencia llegar aproximadamente 80 a 90% en el momento de la transfección. Las células se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) según el protocolo proporcionado por el fabricante. Un vector indicador de luciferasa de Renilla PRL-TK se utilizó como control interno. Los ensayos de luciferasa se realizaron con un kit de doble especificidad ensayo luciferse (Promega, Madison, WI). Firefly luciferase actividades se normalizaron sobre la base de las actividades de luciferasa de Renilla. Todos los ensayos de reportero se repitieron por lo menos tres veces. Los datos mostrados son los valores medios ± SD de un experimento representativo.
ARN de interferencia
SOCS4 shRNA y el control shRNA irrelevante (shRNA-control) fueron adquiridos de GenePharma (GenePharma, Shanghai) y preparado por ligadura de los pares correspondientes de oligonucleótidos a PGPU6 /GFP /Neo. La secuencia diana se puede encontrar en la Tabla S4.
análisis de transferencia de Western
lisados de células enteras se prepararon por lisis de las células con PBS pH 7,4 que contiene 0,01% de Triton X-100, 0,01% de EDTA, y el 10% de cóctel inhibidor de la proteasa (Roche, Ciencias Aplicadas). La concentración de proteína se determinó por el ensayo de Bradford (Bio-Rad). Los polipéptidos de los lisados celulares se separaron en SDS 12% geles de poliacrilamida reticulados con N, N -methylenebisacylamide, y se transfirieron eléctricamente a membranas de nitrocelulosa (Millipore, Billerica, MA). La unión no específica se bloqueó con 5% de leche en PBST antes de añadir anticuerpos primarios utilizados en este estudio. anticuerpos peroxidasa de rábano vinculados anti-conejo y anti-ratón (Sigma, St Louis, MO) se utilizaron como anticuerpos secundarios. Los niveles de proteína se cuantificaron mediante el escaneo de manchas en un generador de imágenes Gel Doc EZ (Bio-Rad) y el análisis con el software Quantity One 1D análisis de imágenes 4.4.0 (Bio-Rad)
El análisis estadístico
Estadística los análisis se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 5 (GraphPad software, la Jolla, CA, EE.UU.). datos paramétricas y no paramétricas fueron analizados utilizando una prueba t de dos colas y la prueba de Mann-Whitney U, respectivamente. Un valor de P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Los datos se presentan como media ± S.D.. o la media ± SEM
Resultados
IL-23 promueve la migración y la invasión de las células del cáncer de tiroides
Queríamos poner a prueba el efecto de la IL-23 sobre la proliferación celular de las las células del cáncer de tiroides con el fin de observar si la proliferación celular perturba la capacidad de migración y la invasión de las células. El ensayo MTT demostraron que la proliferación de células K1 y células WRO fueron apenas se ve afectada por ninguna de las dosis de IL-23 (S1 Fig). A continuación se investigó si la IL-23 podría afectar a la migración y la invasión de las células del cáncer de tiroides. movimiento mejorada y la invasión de células K1 se detectaron en la presencia de 50 y 100 ng /ml de IL-23 (Fig 1A y 1B). Del mismo modo, el aumento de la migración y la invasión También se detectaron tan pronto como 48 horas (h) después del tratamiento con 50 ng /ml de proteína IL-23 (Fig 1C y 1D). Se demostró además que la IL-23 aumentó la migración y la invasión de las células WRO de la dosis y tiempo dependiente manera (Fig S2). Además, la herida ensayo de curación también muestran que la IL-23 aumentó la migración de células K1 (Fig 1E y 1F). En conjunto, estos resultados confirman la dosis y dependiente del tiempo y efecto promigratory proinvasive de IL-23.
(A) K1 fueron tratadas con rhIL-23 durante 48 horas a las concentraciones indicadas, seguido de cultivo en un sistema transwell por 24 horas. (B) los experimentos de ensayo de invasión de la célula se realizaron con células K1 que fueron tratados como en (A). K1 (C) se trataron con una concentración de 50 ng /ml de rhIL-23 para los puntos de tiempo indicados, seguido de cultivo en un sistema transwell por 24 h. (D) Los experimentos se realizaron como en (C) para el ensayo de invasión de células. K1 (E) fueron tratadas con rhIL-23 durante 48 h en las concentraciones indicadas, seguida de la introducción de una herida. La migración celular en la herida se controló a 24 horas. (F) células K1 fueron tratados con una concentración de 50 ng /ml de rhIL-23 para los puntos de tiempo indicados, seguido por la introducción de una herida. La migración celular en la herida se controló a 24 horas. Cierre de la herida se midió mediante el cálculo de densidades de píxeles en el área de la herida y se expresó como porcentaje de cierre de la herida de las zonas triplicados ± desviaciones estándar en la migración transwell, la invasión y la herida ensayo de curación, los datos se expresan como un porcentaje del control. Los datos representan la media ± SD, n = 3 (** p & lt; 0,01; * P & lt; 0,05).
IL-23 induce la migración y la invasión de las células del cáncer de tiroides a través de
SOCS4
para identificar el papel de la IL-23 en la expresión de SOCS4, K1 fueron estimuladas con la proteína IL-23 durante 24 horas a la concentración de 50 ng /ml. Los supresores de la señalización de citoquinas (
SOCS4
) ARNm y proteínas se detectaron mediante PCR en tiempo real y Western Blot, respectivamente. Los resultados mostraron que la IL-23 suprime
SOCS4
la expresión de ARNm y de la proteína en las células K1 (figura 2A). Resultados similares se obtuvieron también en la línea celular WRO (Fig 2B). Para determinar si SOCS4 participa en la migración mediada por IL-23 y la invasión de células de cáncer de tiroides, se construyó 4 ARN de horquilla corta-SOCS4 específico humano (shRNA). En tiempo real PCR resultados mostraron que los plásmidos#2 shRNA podrían notablemente inhibir la expresión de SOCS4 en K1, mientras que los otros plásmidos shRNA tuvieron poco efecto sobre la expresión de SOCS4 (Figura 2C). los niveles de proteína SOCS4 mostraron una tendencia similar a la determinada por Western blot (Figura 2D). En los experimentos de migración celular, la sobreexpresión de
SOCS4
inhibió la migración inducida por IL-23 en células K1 (Fig 2E). Por el contrario, la caída de
SOCS4
mayor expresión de migración inducida por IL-23 en células K1 (Fig 2F). Los grados de inducción se correlacionaron con las eficiencias de
SOCS4
caída por cada plásmido shRNA (Figura 2F). Se obtuvieron resultados similares con transwell experimentos de invasión (Fig 2G y 2H). Desde SOCS4 regula negativamente la migración, el próximo analizado el papel de SOCS4 en la proliferación celular de células de cáncer de tiroides. Los resultados de ensayo de MTT indican que la proliferación de células K1 se apenas se ve afectado por la expresión de SOCS4. Además, la sobreexpresión o Desmontables de SOCS4 y el tratamiento con IL-23 no podría afectar a la proliferación celular de células de cáncer de tiroides (S3 FIG). Estos resultados sugieren que la activación de la migración regulada-IL-23 y la invasión puede requerir SOCS4. K1
(A) se trataron con 50 ng /ml de rhIL-23 para 48 h.
SOCS4
los niveles de ARN se cuantificaron mediante qRT-PCR (panel izquierdo) y los niveles de proteína de SOCS4 fueron detectados por Western blot (panel derecho). (B) Los experimentos con células WRO se realizaron como en A. K1 (C, D) se transfectaron con diferente
SOCS4
shRNA (shRNA#1,#2 shRNA, shRNA#3 y#4 shRNA) o shCtrl como simulacro. Después de 48 h,
SOCS4
niveles de mRNA fueron medidos mediante qRT-PCR (C) y Western Blot (D). K1 (E) se transfectaron con el plásmido indicado, luego se trató con rhIL-23 (50 ng /ml) durante 48 h y se les permitió migrar hacia suero durante 24 h (panel superior). Los niveles de proteína de SOCS4 fueron detectados por Western blot (panel inferior). (F) Las células fueron transfectadas con indicado shRNA-SOCS4 y los experimentos se realizaron como en (E). (G, H) se llevaron a cabo los experimentos de ensayo de invasión de células en condiciones similares como se describe en (E) y (F). En el tiempo real RT-PCR experimentos, el control fue designado como 1. Todos los experimentos se repitieron al menos 3 veces con resultados similares. Los gráficos de barras representan la media ± SD, n = 3 (** p & lt; 0,01; * P & lt; 0,05).
microARN-25 regula a la baja
SOCS4
expresión atacando directamente a su 3'-UTR
para analizar los miRNAs que pueden atacar la 3'-UTR de
SOCS4
, utilizamos 3 bases de datos en línea, TargetScanHuman, miRDB, y miRWalk2.0, para buscar potencial candidatos. Catorce de los miRNAs potenciales comunes fueron encontrados en las 3 bases de datos. Para determinar el efecto de los miRNAs predicho en la expresión de
SOCS4
, el
SOCS4
3'-UTR se clonó en un plásmido indicador de luciferasa de luciérnaga. Los ensayos de actividad de luciferasa indicaron que 6 miRNAs inhibieron la actividad de la luciferasa SOCS4 por debajo del 50% en comparación con el miR-Ctrl (S4A figura). A continuación se investigó que miRNAs fueron activadas por la migración inducida por IL-23 y la invasión. K1 se trataron con proteína de IL-23 a 50 ng /ml durante 48 h. Los resultados de PCR en tiempo real demostraron que entre los miRNAs que podrían atenuar
SOCS4
actividad de la luciferasa, la expresión de miR-25 se indujo significativamente (Fig S4B)
.
A partir de nuestros datos la hipótesis de que miR-25 puede jugar un papel en la vía de señalización de IL-23 /SOCS4. a continuación, se investigó si el miR-25 regula
SOCS4
expresión mediante la orientación post-transcripcional de su 3'-UTR. Una mutación distinta fue generada en la 3'-UTR de
SOCS4
en los sitios de semillas de coincidencia predichos para probar la interacción entre el miR-25 y
SOCS4
3'-UTR (Figura 3A). La transfección transitoria de células K1 con el tipo salvaje (WT)
SOCS4
3'-UTR, y el miR-25 mímico, conduce a una disminución significativa en la actividad del indicador en comparación con la del control de miR (Fig 3B ). Este fenómeno fue interrumpido cuando las mismas líneas celulares fueron transfectadas con
SOCS4
3'-UTR mutantes (Fig 3B). El inhibidor de miR-25 (miR-25-INH) estimuló significativamente la actividad de la luciferasa de la WT
SOCS4
3'-UTR, sin ningún efecto sobre Mut
SOCS4
3'-UTR en K1 células (figura 3C). El microARN-25 sobreexpresión en células K1 suprimió significativamente tanto en el mRNA y los niveles de proteína de SOCS4 (figura 3D). desmontables Por el contrario, el miR-25 mediada por el inhibidor endógeno de miR-25 aumentó
SOCS4
la expresión del ARNm y la proteína en las células K1 (figura 3E). Para determinar si la regulación a la baja de miR-25 mediada por
SOCS4
expresión es una característica común en las células tiroideas cancerosas, se realizaron experimentos similares en las células WRO (Figura 3F y 3G). En conjunto, estos resultados sugieren que SOCS4 es un objetivo de miR-25 en K1 y células WRO
(A) Las secuencias de sitios de unión de miR-25 dentro de la humana
SOCS4 página 3 '. UTR y los constructos indicadores esquemáticos. En este panel, WT representa los constructos indicadores que contienen todas las secuencias 3'UTR de
SOCS4
.
SOCS4
-MUT representa los constructos indicadores que contienen nucleótidos mutados. (B, C) K1 fueron co-transfectadas con cualquiera de WT o MUT
SOCS4
plásmidos reportero 3'UTR y cualquiera de miR-25 mímica (B) o el miR-25 inhibidor (C). Las actividades de luciferasa se midieron después de 48 h utilizando un kit de ensayo dual-luciferasa y normalizada a luciferasa de Renilla. (D) células K1 se transfectaron con miR-25 imitan o controles para 48 h.
SOCS4
ARNm (panel izquierdo) y proteínas (panel derecho) fueron detectados por QRT-PCR y Western Blot, respectivamente. (E) Las células fueron transfectadas con miR-25 inhibidor o control y los experimentos se realizaron como en D. (F, G) se utilizaron células WRO y los experimentos se realizaron como en D y E. Todos los experimentos se repitieron al menos 3 veces con resultados similares. Los gráficos de barras representan la media ± SD, n = 3 (** p & lt; 0,01; * P & lt; 0,05).
microARN-25 promueve la motilidad de las células del cáncer de tiroides por la orientación
SOCS4
Dado que el miR-25 puede suprimir
SOCS4
expresión secuencia específica de unión a su 3'-UTR, la hipótesis de que el miR-25 puede afectar a la migración y la invasión del cáncer de tiroides a través de SOCS4. Para probar la hipótesis, K1 fueron co-transfectadas con el
SOCS4
vector de expresión (o vector vacío) y el MIR-25 imita (o miR-Ctrl). Transwell ensayos de migración demuestran que el miR-25 promueve la migración de células K1 y la migración celular inducida por el miR-25 es revocada por
SOCS4
sobreexpresión (figura 4A). Además, se observó que la caída de
SOCS4
puede mejorar significativamente el efecto de miR-25 sobre la migración celular (Figura 4B). Se obtuvieron resultados similares en los ensayos de invasión y la herida ensayo de curación (Fig 4C-4F). El efecto de la vía de señalización de miR-25 /SOCS4 sobre la migración de las células del cáncer de tiroides se evaluó utilizando el inhibidor de miR-25. Como se muestra en la figura 4G, miR-25 inhibidor inhibe de manera significativa la migración de las células K1. Además, el inhibidor de miR-25 y la
SOCS4
vector de expresión que inhibe de forma sinérgica la migración de células K1 (figura 4G). Por el contrario, los altos niveles de migración estaban presentes en las células K1 cuando
SOCS4
fue atropellado por shRNA-SOCS4#2 (figura 4H). Resultados similares fueron obtenidos en ensayos de invasión y de la herida ensayo de curación (Figura 4E-4L). Estos resultados sugieren que la inhibición de
SOCS4
expresión es responsable de la capacidad de miR-25 para promover la invasión celular y la migración.
(A, B) K1 fueron co-transfectadas con el indicado miR-RNA imitador y el plásmido (a) o shRNA (B) durante 48 h y se dejó migrar hacia suero durante 24 h. (C, D) los experimentos de ensayo de invasión de células se realizaron con las mismas condiciones que en A y B. (E, F) de la herida curación experimentos de ensayo se realizaron con las mismas condiciones que en A y B. (G, H) Las células se transfectaron con miR-25 inhibidor o control y los experimentos se realizaron como en a y B. (i, j) los experimentos de ensayo de invasión de células se realizaron con las mismas condiciones que en G y H. (K, L) la curación de heridas experimentos de ensayo se realizaron con las mismas condiciones que en G y H. gráficos de barras representan la media ± SD, n = 3 (** p & lt; 0,01; * P & lt; 0,05).
IL-23 estimula miR 25 expresión en las células del cáncer de tiroides
para identificar el papel de la IL-23 en la expresión de miR-25, K1 fueron estimuladas con la proteína IL-23 humana a diferentes concentraciones durante 48 h. MicroARN-25 niveles fueron detectados por PCR en tiempo real. Los resultados muestran que miR-25 niveles son upregulated por la proteína IL-23 de una manera dependiente de la dosis (Fig 5A). Consistentemente, K1 fueron tratados con la proteína IL-23 en diferentes puntos de tiempo, a una concentración de 50 ng /ml. Los resultados de los análisis en tiempo real PCR demuestran que el miR-25 niveles aumentan a medida que aumenta el tiempo (Figura 5B). El papel de la IL-23 en miR-25 expresión se confirmó mediante la repetición de los experimentos utilizando células WRO (Fig 5C y 5D). Estos resultados sugieren que la IL-23 activa la expresión de miR-25.
microARN-25 niveles fueron cuantificados por PCR en tiempo real y los experimentos se realizaron como se describe en la figura 1. Los niveles de expresión se normalizaron a U6 snRNA. Los datos representan la media ± SD, n = 3 (** p & lt; 0,01; * P & lt; 0,05) guía empresas
microARN-25 juega un papel importante en la IL-23 mediada por
SOCS4.
la inhibición y la migración celular y la invasión
Para definir el papel de miR-25 en la regulación a la baja de la IL-23 mediada por
SOCS4
expresión, K1 se transfectaron con cualquiera de miR-25 imita o miR-Ctrl y tratados con o sin la proteína IL-23 durante 48 h. Los resultados de PCR en tiempo real y Western blot análisis muestran que la transfección con miR-25 imita aumenta la inhibición de IL-23 mediada por
SOCS4
mRNA y expresión de la proteína (Fig 6A). Por el contrario, altos niveles de
SOCS4
ARNm y proteínas están presentes en las células K1, cuando la expresión de miR-25 se inhibe por el inhibidor de miR-25 (Fig 6B). También se examinó si el miR-25 está implicada en el cáncer de tiroides línea celular de la motilidad mediada por IL-23. Usando transwell ensayos de migración e invasión, puso de manifiesto que el miR-25 sobreexpresión estimula la activación de IL-23 mediada por la migración y la invasión (Figura 6C y 6D), y la caída de miR-25 expresión inhibe la activación de la IL-23 mediada por la migración y la invasión (Fig 6E y 6F). Resultados similares se obtuvieron también en el ensayo de curación de la herida (Fig 6G y 6H) .Taken conjunto, estos datos sugieren que miR-25 es el componente clave que participa en la migración de células del cáncer de tiroides mediada por IL-23 y la invasión a través de la inhibición de la
SOCS4
expresión.
K1 (a) se transfectaron con el plásmido indicado, luego se trató con rhIL-23 (50 ng /ml) durante 48 h. SOCS4 ARNm (panel izquierdo) y proteínas (panel derecho) fueron detectados por QRT-PCR y Western Blot, respectivamente. (B) Las células se transfectaron con miR-25 inhibidor o control, y los experimentos se realizaron como en A. (C, D) K1 se transfectaron con miR-25 imitador (C) o un inhibidor de (D) y los controles, después se trataron con rhIL-23 (50 ng /ml) durante 48 h y se dejó migrar hacia suero durante 24 h. (E, F) Los experimentos de ensayo de invasión de la célula se realizaron con las mismas condiciones que en C y D. (G, H) cicatrización de heridas Experimentos de ensayo se realizaron con las mismas condiciones que en C y D. Todos los experimentos se repitieron al menos 3 veces con resultados similares. Los gráficos de barras representan la media ± SD, n = 3 (** p & lt; 0,01; * P & lt; 0,05) guía empresas
La expresión de IL-23, miR-25 y
SOCS4
en tejidos de cáncer de tiroides
Para validar el papel de la IL-23, miR-25 y
SOCS4
en el cáncer de tiroides, la expresión de IL-23, miR-25 y se analizaron SOCS4 en 35 pares de PTC clínica, 26 pares de FTC clínica, y 22 muestras normales de la tiroides. Como se muestra en la figura S5A-S5C, la expresión de
SOCS4
fue menor y el nivel de expresión de IL-23 y miR-25 fue mayor en las muestras de PTC y del FTC que las muestras normales de la tiroides. Además, los altos niveles de IL-23 se correlacionaron con altos niveles de miR-25 (Fig S5D). Curiosamente, los niveles bajos de
SOCS4
expresión se correlacionaron con altos niveles de IL-23 y miR-25 expresión en muestras de PTC y FTC (S5E y S5F FIG). Estas observaciones sugieren fuertemente que las alteraciones de la IL-23, miR-25 y la expresión SOCS4 podrían estar implicados en la progresión del cáncer de tiroides.
Discusión
En este estudio, se define una nueva vía de señalización implicada en el control de la migración de células del cáncer de tiroides y la invasión. En primer lugar, hemos demostrado que la IL-23 regula positivamente la expresión de miR-25, así como downregulated
SOCS4
expresión en la migración celular y la invasión del cáncer de tiroides. Además, también mostramos que el miR-25 promueve la migración celular y la invasión del cáncer de tiroides por la orientación SOCS4. Por último, nuestros datos sugieren que miR-25 está implicado en la IL-23 asociada a
SOCS4
expresión y la migración celular y la invasión.
migración de células tumorales y la invasión es un proceso muy complicado en el que el cáncer células repartidas desde el tumor primario, sobreviven en la circulación, y crecen en sitios distantes en el cuerpo [28]. Cada proceso está determinado por la capacidad de migración y la invasión de las células tumorales y el microentorno del tumor local que proporcionan un entorno favorable para las células tumorales para sobrevivir y metástasis [29]. Investigaciones recientes han demostrado que la alta expresión de los niveles de IL-23, que pueden ser detectados en el microambiente, podría ayudar a facilitar la metástasis tumoral. Por ejemplo, la IL-23 promueve la metástasis de carcinoma hepatocelular mediante la expresión de MMP9-upregulated NF-kB [9]. IL-23 es altamente expresado en los astrocitos metástasis-asociados, y IL-23 induce la progresión de la metástasis de melanoma cerebro [8]. IL-23 desempeña un papel fundamental en el desarrollo de cáncer de esófago a través de una transición epitelial-mesenquimal [7]. IL-23 puede aumentar la proliferación y la invasión de células de carcinoma de colon [10]. Sin embargo, el papel de la IL-23 en la migración celular y la invasión del cáncer de tiroides es aún desconocido. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que demuestra los efectos directos de la IL-23 sobre la migración y la invasión de células de cáncer de tiroides. Curiosamente, un estudio reciente demostró que IL-23 regula la proliferación de células de cáncer de pulmón [30]. No obstante, a diferencia de las células de cáncer de pulmón, no hemos encontrado evidencia para apoyar que la IL-23 induce la proliferación de células de cáncer de tiroides (S1) Fig. Especulamos que puede haber algunas diferencias intrínsecas entre cáncer de tiroides y cáncer de pulmón. Por otra parte, IL-23 promueve la migración y la invasión de células de cáncer de tiroides.
Actualmente, dos informes han implicado el papel potencial de SOCS4 en el cáncer. Un estudio utilizó un doble análisis combinación matriz para demostrar que SOCS4 es una novela gástrico gen supresor del cáncer [31]. El otro estudio comparó las diferencias de expresión de
SOCS1-7
entre el tejido de cáncer de mama y el tejido de fondo de mama [32]. Alta expresión de
SOCS4
se asocia significativamente con un estadio tumoral antes y un mejor resultado clínico en cáncer de mama humano [32]. En este estudio, se observó que los niveles de SOCS4 están disminuidos en la migración inducida por IL-23 y la invasión de células de cáncer de tiroides (Fig 2). El tratamiento con IL-23 dio como resultado la reducción de los niveles de expresión de
SOCS4
en células de cáncer de tiroides (Fig 2). A través de la sobreexpresión y desmontables experimentos, se demuestra que
SOCS4
regula negativamente la migración y la invasión inducida por IL-23 (Figura 2). Recientemente, varios estudios han demostrado evidencia de que la familia SOCS tiene una fuerte supresión de tumor papel en varios tipos de tumores sólidos y hematológicos [32,33].