Extracto
Antecedentes
sialilación de la superficie celular se está convirtiendo en una característica importante de la metástasis de las células cancerosas. expresión sialiltransferasa Se ha informado que ser alterado en los tumores y puede dar cuenta de la formación de antígenos tumorales sialilados. Nos hemos centrado en la influencia de la alfa-2,3-sialiltransferasa ST3Gal III en los pasos clave del proceso tumorigénico de páncreas.
Metodología /Principales conclusiones
ST3Gal III sobreexpresan líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas Capan- 1 y MDAPanc-28 se generaron. Ellos mostraron un aumento del antígeno asociado a tumor sialil-Lewis
x. capacidad de unión E-selectina los transfectantes 'fue proporcional a la superficie de la célula sialil-Lewis
x niveles. migración celular correlaciona positivamente con ST3Gal III y sialil-Lewis
x niveles. Por otra parte, la inyección intraesplénica de la ST3Gal III transfectaron células en ratones desnudos atímicos mostraron una disminución en la supervivencia y la formación de metástasis superior en comparación con las células simuladas.
Conclusión
En resumen, la sobreexpresión de ST3Gal III en estas líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas subraya el papel de esta enzima y de su producto en las principales etapas de la progresión tumoral, tales como la formación de adherencias, la migración y la metástasis
Visto:. Pérez-Garay M, Arteta B, L Pagès, de Llorens R, de Bolos C, Vidal-Vanaclocha F, et al. La motilidad celular (2010) α2,3-sialiltransferasa ST3Gal III Modula el cáncer pancreático y adhesión
in vitro
y aumenta su potencial metastásico
En Vivo
. PLoS ONE 5 (9): e12524. doi: 10.1371 /journal.pone.0012524
Editor: Terence Lee, Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: May 7, 2010; Aceptado: 31 de julio de 2010; Publicado: 1 de septiembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Pérez-Garay et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la Marató de TV3 fundación (subvención 050.932, concedida a RP), Español Ministerio de Ciencia e Innovacion (BIO conceder 2007-61323, otorgado a RP), el Gobierno de Cataluña (subvención 2005SGR00065, adjudicado a RL), la Comision interministerial de Ciencia y Tecnología (CICYT) del Gobierno español en Madrid (sin. SAF2006-09341, adjudicado a FVV) y el Gobierno del País Vasco (no. IT-487-07 otorgado a FVV). M.P.-G. Gracias Fundación La Marató de una beca predoctoral y la Universidad de Girona para una beca de movilidad de corta duración. Los donantes tienen ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
sialilación de la superficie celular se está convirtiendo en una característica importante de la metástasis de las células cancerosas. Los ácidos siálicos y sus derivados son ubicuos en las posiciones terminales de glicoconjugados. Estos azúcares ácidos imparten carga neta negativa y están en una posición para modular una amplia variedad de eventos en la célula-célula, célula-matriz y las interacciones célula-molécula [1]. La transferencia de los ácidos siálicos a partir de ácido cystidine-5-monophospho-N-acetilneuramínico (CMP-NeuAc) a las posiciones terminales de los grupos carbohidrato de la glicoproteína y glicolípidos es catalizada por sialiltransferasas [2].
sialiltransferasas humanos son una familia de 20 intracelular diferente, Golgi glicosiltransferasas unidas a la membrana; agrupados en tres subfamilias [3]. Alfa-2,6-sialiltransferasas median la transferencia de ácido siálico con una alfa-2,6 vinculación con Gal terminal (ST6Gal I-II) [4], [5] o residuos GalNAc (ST6Gal NAc I-VI). Alfa-2,8-sialiltransferasas median la transferencia de ácido siálico con una alfa 2,8-ligamiento (ST8 Sia I-IV). Alfa-2,3-sialiltransferasas median la transferencia de ácido siálico con una alfa-2,3 vinculación a los residuos Gal terminales. ST3Gal I-II y IV catalizar la transferencia al residuo Gal situado en estructuras Galβ1-3GalNAc terminales; ST3Gal IV y VI de ácido siálico de transferencia (con alfa 2,3-enlace) al residuo Gal situado en estructuras Galβ1-4GlcNAc terminales; ST3Gal V actúa sobre el residuo Gal situado en terminales estructuras Galβ1-4Glc-Cer y, finalmente, ST3Gal III cataliza la transferencia de ácido siálico con una alfa-2,3 vinculación a los residuos Gal terminales situados a ambos estructuras Galβ1-4GlcNAc Galβ1-3GlcNAc o [6].
los cambios en la expresión de sialiltransferasa específica se han notificado a ser alterado en varios tumores y puede dar cuenta de la formación de antígenos tumorales sialilados, tales como sialil-Lewis x, sialyl- Lewis a, sialil-T y sialyl- Tn. En el carcinoma de conducto biliar extrahepático niveles ST3Gal III correlacionados con el avance del tumor, la diferenciación y la metástasis [7]. En el cáncer de mama, la sialiltransferasa más expresado era ST3Gal III que se correlacionaban positivamente con el tamaño del tumor y el número de nodos axilares; y la relación por otra parte alta ST3Gal III /ST6Gal I se correlaciona con una supervivencia general más corta y mal pronóstico [8], [9]. Además, ST6GalNAc V Recientemente se ha informado de mediar metástasis cerebral de células de cáncer de mama [10]. En el cáncer de vejiga ST3Gal I juega el papel principal en la sialilación del antígeno T y su sobreexpresión parece ser parte de la transformación oncogénica inicial [11]. En el carcinoma de células escamosas del cuello uterino, ST6Gal I y ST3Gal III niveles de expresión fueron significativamente superiores en pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos, en comparación con aquellos sin metástasis [12], [13] y ST3Gal III, ST3Gal IV y ST6Gal I se incrementaron en la neoplasia intraepitelial cervical . En el carcinoma renal humano una baja regulación de ST3Gal IV mRNA puede ser uno de los factores asociados con su progresión maligna [14]. En el cáncer de colon ST6Gal I y ST3Gal III aumentaron su expresión en muestras de carcinoma [15]. ST3Gal III se incrementó un lugar destacado en los tejidos de cáncer en comparación con la mucosa no maligna colorrectal [16] y una elevación de la actividad ST6Gal I se observó en los tejidos malignos y de transición [17]. En el cáncer gástrico, altos niveles de ST3Gal III A en el tejido tumoral se correlacionaban con la recurrencia del tumor secundario [18].
Aunque la alfa-2,3 sialiltransferasa-expresión ST3Gal III se correlaciona con la malignidad del tumor en varios carcinomas de su función mecánica no se ha evaluado completamente. ST3Gal III está implicado en la biosíntesis de los antígenos sialil-Lewis, que se sobreexpresan en el adenocarcinoma pancreático (PDAC) [19], [20], [21], [22], [23], [24], y se correlacionan con su mal pronóstico [25], [26], [27], [28]. En el presente trabajo, nuestro objetivo ha sido investigar la influencia específica de la sialiltransferasa-alfa-2,3 ST3Gal III en algunos de los pasos clave de la progresión PDAC tales como la adhesión, la migración y la metástasis. Para ello, hemos elegido dos líneas celulares de cáncer de adenocarcinoma pancreático Capan-1 y MDAPanc-28, con diferentes ST3Gal III y los niveles de expresión del antígeno sialil-Lewis, y ha generado ST3Gal III sobreexpresión de clones. ST3Gal III aumento de la expresión se relaciona con un aumento sialil-Lewis
x nivel de superficie y se conduce a un aumento de E-selectina capacidad y la migración de células de unión. Además, la inyección intraesplénica en ratones desnudos atímicos de las células overepressing ST3Gal III mostró una disminución en los ratones supervivencia y la formación de metástasis superior. En resumen, el aumento de expresión de ST3Gal III en esas líneas celulares de adenocarcinoma de páncreas pone de relieve el papel de esta enzima y de su producto en las principales etapas de la progresión tumoral tales como la adhesión, la migración y la metástasis.
Resultados
sobreexpresión estable de ST3Gal III en Capan-1 y MDAPanc-28 células
Para explorar la función mecánica de ST3Gal III en la progresión del adenocarcinoma de páncreas, el gen ST3Gal III de rata, que exhibe especificidad aceptor prácticamente idéntica y la actividad enzimática como humanos ST3Gal III de genes [29], se utilizó. Así, las células Capan-1 y MDAPanc-28 se transfectaron con el gen de pcDNA 3.1 vector de codificación de rata ST3Gal III. células parentales fueron transfectadas de forma concomitante con el vector pcDNA3.1 vacío. Varios clones celulares estables se seleccionaron en presencia de geneticina y la sobreexpresión ST3Gal III ARNm fue analizado por PCR semi-cuantitativa (datos no mostrados). Se seleccionaron los clones ST3Gal III de ARNm que sobreexpresan, C31 y C32 (para el modelo Capan-1) y la M33 y la M34 (para el modelo MDAPanc-28) para estudios posteriores. Como controles, líneas celulares de sus padres (Capan-1 y MDAPanc-28) y los clones transfectadas de manera simulada (CP para Capan-1 y MP para la MDA-Panc 28) fueron utilizados. expresión ST3Gal III mRNA se cuantificó mediante PCR cuantitativa (qPCR) (Figura 1). Capan-1 en las células parentales tenían 3 veces más alta (
P & lt; 0,001
) expresión ST3Gal III de MDAPanc-28 células de los padres. Respecto al modelo Capan-1, la expresión de ARNm ST3Gal III fue 140 veces más alta (
P & lt; 0,001
) en C31 clon y 100 veces más alta (P & lt; 0,001) en C32 clon que en Capan-1 y CP las células de control. Para el modelo MDAPanc-28, la expresión de ARNm ST3Gal III era 7 veces más alta (
P & lt; 0,001
) en M34 clon y 3,6 veces más alta (P & lt; 0,001) en M33 clon que tanto en las células de control, MDAPanc -28 y MP. Evaluación de la actividad sialiltransferasa en general se realizó mediante ensayo de inmunoabsorción glicosilación (GISA) como se describe anteriormente [24]. Como se esperaba, se detectó un aumento general de la actividad sialiltransferasa en las células transfectadas en comparación con sus controles correspondientes, siendo de 3,2 veces más alta en los ST3Gal III clones que sobreexpresan Capan-1
frente
CP y Capan-1 y 1,3 veces mayor en los MDAPanc-28 clones que sobreexpresan ST3Gal III
frente
MP y MDAPanc-28
MDAPanc-28 células de los padres, MP:. MDAPanc-28 células simuladas, M34 y M33: MDAPanc-28 células transfectadas con el gen de ST3Gal III. Capan-1: células parentales, CP: Capan-1 células simuladas, C31 y C32: células Capan-1 transfectadas con el gen ST3Gal III. Los datos representan la media ± DE de 3 experimentos separados, cada uno en seis réplicas (n = 18). * Significativamente diferente (
P & lt; 0,001
).
ST3Gal III aumentó la expresión de novo de SLex por la competencia enzimática
La superficie celular patrón de expresión de glicanos para ambos modelos era estudiadas por citometría de flujo utilizando anticuerpos monoclonales específicos contra los antígenos de Lewis y lectinas específicas (resultados mostrados en la Figura 2). El análisis de Tipo II Lewis antígenos en el modelo de Capan-1 (Figura 2A) reveló que las células Capan-1 y CP tenían niveles de alta medianas del Le
x, SLE
x y antígenos H2 y los altos niveles de Le
y antígeno. Cuando se compara con los controles, C31 y C32 clones muestran un gran aumento en el LES
x expresión a expensas de perder completamente la expresión de antígenos no sialilada (Le
x, H2 y Le
y). Además, acompañando al incremento en el LES
x, se observó una disminución en ácido α2,6-siálico, detectado por
Sambucus nigra aglutinina
(SNA).
Maackia amurensis aglutinina gratis (MAA) no mostraron diferencias entre los clones, probablemente debido al hecho de que es incapaz de unirse a la LES
x estructura (datos no mostrados). Tipo I Lewis antígenos SLe
a, Le
a, Le
b y H1 no se detectaron en el modelo Capan-1 (datos no presentados). Por lo tanto, estos resultados evidenciaron una competición enzimática múltiples para las cadenas de tipo II. El análisis de MDAPanc-28 modelo (Figura 2B) mostró que las células de control MDAPanc-28 y MP tenían muy baja SLe
x expresión y la expresión de ácido siálico α2,6-alta y también carecían de antígenos de tipo I de Lewis. Cuando M33 y M34 clones se compararon con los controles, un aumento en el LES
x con una disminución simultánea en ácido α2,6-siálico también se detectó. Como el anterior, MAA no mostró diferencias entre los clones probables, ya que no reconoce SLe
x (datos no mostrados). Desde ST3Gal III transfectaron clones C31 y C32 comportó de manera similar en el modelo de Capan-1, así como el M33 y M34 ST3Gal III transfectadas clones en el modelo MDAPanc-28, la siguiente
in vitro
y
in vivo se llevaron a cabo estudios de
solamente con los más altos
x clones que expresan ST3Gal III y SLE: C31 para el modelo Capan-1 y M34 para el modelo MDAPanc-28
Figura 2A.. Capan-1 (esquema continuo de puntos: .........), CP (espaciado de puntos de esquema:.....), C31 (contorno en negrita: _______), C32 (contorno liso: ______). La Figura 2B. MDAPanc-28 (esquema continuo de puntos: .........), MP (espaciados contorno de puntos:.....), M34 (contorno en negrita: _______), M33 (contorno liso: ______). Los experimentos se realizaron por triplicado. Se muestran los histogramas de citometría de representación. Anti-Le
x MAb se une a Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; contra el LES-
x MAb se une a NeuAcα2-3Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; anti-H2 MAb une a [Fucα1,2] Galβ1,4GlcNAc-; anti-Le
y Mab se une a [Fucα1,2] Galβ1,4 [Fucα1,3] GlcNAc-; SNA lectina (
Sambucus nigra
aglutinina) se une a estructuras NeuAcα2-6Galβ-.
ST3Gal III mejora la adherencia de páncreas células de adenocarcinoma de rh-E-selectina
E -selectin es una molécula de adhesión celular expresado en células endoteliales activadas que reconoce y se une a los determinantes de carbohidratos específicos, como el LES
x y LES
a presente en glicoconjugados de superficie [30]. Se llevaron a cabo ensayos de unión a rh-E-selectina para analizar si la diferencia de patrón de la expresión del antígeno Lewis fue capaz de inducir cambios en la adhesión (resultados mostrados en la Figura 3). Ambos modelos mostraron diferentes patrones de adhesión a la rh-E-selectina. MDAPanc-28 células de los padres muestran menor adhesión a rh-E-selectina de Capan-1 en las células de los padres, lo cual era consistente con el menor nivel de expresión de ST3Gal III y LES
x de MDAPanc-28 en comparación con las células Capan-1. En el modelo de Capan-1 (Figura 3A) del clon de sobreexpresión de ST3Gal III, C31, se triplicó la adherencia (
P & lt; 0,001
) a RH-E-selectina en comparación con los controles correspondientes Capan-1 y CP. Para confirmar que SLe
x expresión inducida por ST3Gal III provocó la unión del regulada hasta la E-selectina, las células se incubaron previamente con la lucha contra el LES-
anticuerpo monoclonal x (MAB) y la unión de E-selectina se inhibió . En el modelo de MDAPanc-28 (Figura 3B), el clon de ST3Gal III sobreexpresan, M34, se cuadruplicó (
P & lt; 0,001
) la adhesión a rh-E-selectina en comparación con los controles correspondientes MDAPanc-28 y MP . Cuando las células se incubaron previamente con el anti-SLe
x MAb la unión de la E-selectina fue completamente abrogada. Estos resultados demostraron que, en estos modelos, los niveles de ST3Gal III modulan la
in vitro
unión a rh-E-selectina a través SLe
x expresión.
Capan-1 en las células variantes (figura 3a) y MDAPanc-28 células variante (Figura 3B), previamente incubadas con PBS-1% BSA (barras claras) o anti-SLe
x MAb (barras oscuras), se añadieron a microplacas de 96 pocillos recubierta con rh e % de BSA -selectin o PBS-1 (control negativo). Las células adherentes se estiman con un ensayo colorimétrico basado en MTT. Los resultados se expresan como la unión específica a E-selectina (OD 570 nm de las células delimitadas a E-selectina - OD 570 nm de las células unidas a PBS-1% BSA)
frente
células se incubaron previamente o no con anti -SLe
x MAb. Los datos representan la media ± DE de 3 experimentos separados, cada uno en cinco réplicas (n = 15). * Significativamente diferente (
P & lt; 0,001
).
El efecto de diferentes citoquinas en la adhesión de las células de cáncer de páncreas a células endoteliales sinusoidales hepáticas
(HSE)
Dado que los niveles
x expresión ST3Gal III y LES eran directamente proporcional a
vitro
adhesión rh-e-selectina en, la unión de células de cáncer pancreático a las células de HSE de cultivo primario se evaluó. El modelo Capan-1 fue seleccionada para este experimento, debido a su mayor adhesión a rh-E-selectina. En primer lugar, se determinó la adhesión específica de Capan-1 en las células parentales para HSEC estimulado con TNF-α, IL1-β o lipopolisacárido (LPS) durante 16 horas antes del ensayo (los resultados se muestran en la Figura 4A). El tratamiento con TNF-α y IL1-β aumentó considerablemente el número de células adherentes, y IL1-β resultó ser los mejores estímulos para nuestro modelo. Cuando la incubación con anti-E-selectina MAb, el aumento en la adhesión fue completamente abrogada. Esos datos mostraron que las células de HSE de citoquinas pre-tratamiento, especialmente IL-1β, promovió la expresión de E-selectina, lo que provocó un aumento de Capan-1 de adhesión
células de HSE se incubaron con. & Lt; Sel & gt; = Anti-murino CD62 E (selectina E) MAb o & lt; IgG & gt; = Anticuerpo de control de isotipo correspondiente. Parental células Capan-1 se marcaron con calceína y se añadieron a las células de control HSE, TNF-α estimula las células de HSE, LPS estimula las células de HSE o IL-1β estimula las células de HSE. Los resultados se expresan como la adhesión específica% a las células de HSE [78]. Los datos representan la media ± DE de 3 experimentos independientes, cada uno en tres réplicas (n = 9). * Significativamente diferente (
P & lt; 0,001
) al comparar anti-E-selectina incubó HSEC con las células control.#Significativamente diferente (
P & lt; 0,001
) al comparar los tratamientos. ensayo de adhesión celular del tumor a las células de HSE de cultivos primarios (Figura 4B). Capan-1 células variantes se marcaron con calceína y se añaden a IL-1β estimula las células de HSE o - control de las células de HSE no estimuladas (). & Lt; Sel & gt; = Anti-CD62 murino E (E-selectina) MAb se añadió a las células IL-1 o HSE - células de HSE antes de la adición de las células tumorales. * Significativamente diferente (
P & lt; 0,001
) al comparar Capan-1, CP, y células C31.#Significativamente diferente (
P & lt; 0,001
). Cuando la comparación de cada clon (Capan-1, CP y C31) de adherencia para los diferentes tratamientos con células de HSE
ST3Gal III adhesión de células tumorales aumenta a las células de HSE
a continuación se determinó la adhesión de diferentes ST3Gal III y LES
x los niveles de expresión de células Capan-1 a las células IL-1ß pre-tratadas o controlar HSE (resultados que se muestran en la Figura 4B). células Capan-1 y de control CP mostraron una adhesión basal para células de HSE, que aumentaron significativamente en células de HSE tratadas previamente IL-1ß y volvió a los niveles basales en células de HSE preincubaron mAb anti-E-selectina. C31 mostró una adherencia basal para células de HSE (mayor que las células Capan-1 y de control CP), que aumentaron significativamente en células de HSE tratadas previamente con IL-1 y también volvió a los niveles basales en anti-E-selectina MAb preincubaron células de HSE. Esos datos mostraron que la E-selectina jugó un papel importante la mediación de la adhesión a las células de HSE, aunque existía una adherencia basal no dependiente de la E-selectina (mayor de C31 que para las células de control). Por otra parte, la alta ST3Gal III y LES
x expresan las células C31 tenían una mayor adhesión a las células de HSE que medio ST3Gal III y LES
x expresan las células de control.
ST3Gal III expresión aumentó la migración de células
para investigar si los clones que sobreexpresan ST3Gal III podrían conducir a la adquisición de un fenotipo celular más migratoria, se evaluó la migración celular en el colágeno de tipo I usando un ensayo de migración transwell (resultados mostrados en la Figura 5). Ambos modelos celulares mostraron diferentes capacidades migratorias, con el modelo Capan-1 siendo nueve veces más migratorias que el modelo MDAPanc-28. Respecto al modelo Capan-1 (Figura 5A), el ST3 Gal III y LES
x clon de sobreexpresión de C31 exhibieron doble (
P & lt; 0,001)
capacidades de migración de las células de control que Capan-1 y CP. Para el modelo MDAPanc-28 (Figura 5B), la ST3Gal III y LES
x clon M34 que sobreexpresa aumento de la migración por cuatro con respecto a las células de control MDAPanc-28 y MP. Los resultados demostraron una correlación positiva entre ST3Gal III y LES
x niveles y capacidades migratorias.
Capan-1 en las células variantes (Capan-1, CP y C31)
(
Figura 5A
) Opiniones y MDAPanc-28 células variantes (MDAPanc-28, MP y M34)
(
Figura 5B
) se sembraron
a 8 micras-poros de tipo insertos recubiertos I-Collagen, colocados en la parte superior de los pocillos que contenían DMEM-FBS al 1% y se incubaron a 37 ° C (6 h de Capan-1 modelo y 18 h para el modelo MDAPanc-28). Las células no migradas fueron eliminados y células migraron fijos, se tiñeron y se contaron. Los resultados se expresan como células migradas por pocillo. Los datos representan la media ± SD de los valores obtenidos en 3 experimentos separados, (n = 9). * Significativamente diferente (
P & lt; 0,001
).
ST3Gal III sobreexpresión aumenta la génesis tumoral y disminuye la supervivencia en ratones desnudos atímicos
Desde el
in vitro
resultados descritos anteriormente sugieren un papel importante para el gen ST3Gal III en la progresión tumoral,
in vivo se realizaron
ensayos para estudiar si ST3Gal III podría ser importante en la metástasis tumoral. En primer lugar, se sometieron a ensayo la formación de metástasis y la supervivencia de los ratones desnudos atímicos después de la inyección intraesplénica con diferentes cantidades de las células parentales Capan-1 y MDAPanc-28. En nuestras manos, cuando 1,5 × 10
6, 3 × 10
6 y 5 × 10
se inyectaron 6 células Capan-1, los ratones nude murió de la formación de émbolos, probablemente debido a la Capan-1 tamaño y la capacidad de agregación. La inyección de 1 × 10
6 células Capan-1 no formó émbolos y los tumores generados bazo, aunque sin metastásico se concentra. Desde MDAPanc-28 células son 4-5 veces más pequeño que las células Capan-1, 7 × 10
se inyectaron 6 MDAPanc-28 células intraesplénicamente en ratones desnudos, lo que generó pequeña metastásica macroscópica se centra en 2/3 de los ratones, 20 -22 semanas más tarde. Por lo tanto, se eligieron las células MP y M34 para estudiar la influencia de ST3Gal III sobreexpresión en la formación de metástasis y la supervivencia de ratones nude. Crecimiento exponencial 7 × 10
6 células viables MP y M34, que comparten las mismas características morfológicas, se inyectaron en el bazo de ratones desnudos atímicos (n = 8 /grupo) y análisis de supervivencia se realizó mediante el método de Kaplan-Meier ( la Figura 6). Los ratones inyectados con células que sobreexpresan ST3Gal III (M34) mostraron una gran disminución en la supervivencia (
P = 0,019
) en comparación con los ratones inyectados con células de control MP. La mayor parte de la M34 inyectaron ratones (5/8) murieron después de 103-110 días después de la inyección, mientras que MP inyecta ratones sobrevivieron hasta el final del estudio (190 días). Todo M34 inyecta ratones se practicó la necropsia y el análisis mostró tumores de bazo en 62,5% de ellos (5/8) y varios metastásica macroscópica se centra en el intestino, el diafragma, el riñón, los ganglios o glándulas suprarrenales en 75% de los ratones (6/8) . Todo MP inyecta ratones se practicó la necropsia (día 103, 138, 161 y 190 después de la inyección) y ninguno de ellos (8/8) mostraron evidencia de cualquiera de los tumores de bazo o metástasis macroscópica. Por lo tanto, la sobreexpresión de ST3Gal III en células MDAPanc-28, que conducen a una mayor expresión de LES
x y una mayor adhesión y migración, podría estar directamente correlacionada con una disminución en la supervivencia cuando se inyectan en ratones desnudos. Además, dotado células con una mayor capacidad de formación de tumores y el potencial metastásico cuando se inyecta por vía intraesplénica.
Cells (7 × 10
6) se inyectaron intraesplénicamente en ratones desnudos en el día 1 del experimento. Los ratones fueron examinados diariamente y se sacrificaron cuando miraron enfermo. Las diferencias entre grupos se evaluaron mediante el log-rank test (
P = 0,019
; n = 7-8 /grupo).
Discusión
Nuestra anterior estudios mostraron que la actividad de alfa-2,3-sialiltransferasa correlacionada con sialil Lewis expresión de antígenos en la superficie celular de cáncer de páncreas [24]. Hemos extendido nuestra en ella investigaciones para estudiar específicamente la función mecánica de ST3Gal III en la adquisición de adhesivo, capacidades migratorias y metastásicos en líneas celulares de cáncer de adenocarcinoma de páncreas. Hemos encontrado que: 1) ST3Gal III de ARNm de los niveles de expresión correlacionados con LES
expresión en la superficie x; 2) sialilación inducida ST3Gal III aumenta la adherencia del cáncer pancreático a células de HSE pre-estimulado IL1-beta rh-E-selectina y, a través de SLe
x-E-selectina interacción; 3) una correlación positiva entre la migración y el ST3Gal III y LES
x expresión; y 4) la inyección intraesplénica de ST3Gal III overexpressing líneas celulares en ratones desnudos atímicos indujo un aumento en la génesis tumoral y una disminución en la supervivencia.
clones que sobreexpresan ST3Gal III (C31, C32, M33 y M34) muestran un aumento de la SLe
x expresión en comparación con los controles correspondientes (células no transfectadas, Capan-1 y MDAPanc-28, y las células transfectadas con el vector vacío, CP y MP). Aunque sustrato de tipo I se considera aceptor preferido ST3Gal III, el sustrato de tipo II es también un buen aceptor. Los estudios enzimáticos llevados a cabo con el fin de caracterizar la actividad ST3Gal III mostraron que el Tipo I y Tipo II sustratos aceptores llevó a bastante similar V
valores máximos, mientras que K
m valores eran mucho más altos para el tipo II. Como consecuencia, las tasas de incorporación fueron aproximadamente dos veces para el tipo I que para las estructuras de tipo II [31]. Resultados similares se obtuvieron en trabajos posteriores en el estudio [32], [33] o sintéticos aceptantes especificidades naturales [34], [35], [36], [37], [38]. Teniendo en cuenta que las líneas celulares utilizadas en este estudio no expresan tipo antígenos de Lewis I y que ST3Gal III puede actuar tanto en tipo I y II sustratos, la sobreexpresión de ST3Gal III actuó sobre los precursores de tipo II que conduce a un aumento de la expresión del LES
x. Recientemente, y de acuerdo con nuestros resultados, se ha descrito que la sobreexpresión de ST3Gal III en células de carcinoma gastrointestinales también dio como resultado en el LES
x aumento determinante [39]. Además, estos autores describen que los niveles de mRNA de ST3Gal III correlacionado con el aumento SLe
x niveles de expresión en células confluentes, pero no con los niveles de mRNA de ST3Gal IV y ST3Gal VI, que son las enzimas que han sido reportados para actuar preferentemente Tipo de cadenas II. En conjunto, estos datos refuerzan el papel de la ST3Gal III en la biosíntesis de LES
x en estas células de carcinoma. Junto con LES
aumento x, una disminución en ácido α2,6-siálico se observó en ambos modelos. Además, C31 y C32 mostraron una pérdida completa de la no sialilada Tipo II antígenos de Lewis (Le
x, H2 y Le
y). Estos resultados se explican probablemente por la competencia enzimática múltiples para las cadenas de tipo II. Por un lado, no había competencia entre alfa-1,2-fucosiltransferasas, alfa-1,3 (4) fucosiltransferasas y alfa-2,3-sialiltransferasas [23], [40], [41], y por el otro entre alfa-2,3-sialiltransferasas y alfa-2,6-sialiltransferasas [6], [31], [42].
Los mecanismos moleculares que regulan la metástasis del tumor de páncreas son aún poco conocidos. Un paso crucial es la unión de las células tumorales a las células endoteliales activadas, lo que implica su adhesión endotelial selectinas que reconocen determinantes de oligosacáridos expresados en células de cáncer de superficie. SLe
x se ha informado para participar en los primeros pasos de la extravasación a través de la interacción con E-selectina, facilitando la laminación y la unión de las células tumorales a las células endoteliales [27] [28], [43], [44, ], [45]. células una correlación directa entre los niveles de ST3Gal III, SLE
x niveles y la adhesión de células de cáncer de colon a IL-1β humana activada endoteliales de vena umbilical (HUVEC) se ha descrito [46]. SLe
x han sido también informó que expresan las células de cáncer de colon para adherirse a las células endoteliales sinusoidales hepáticas a través de E-selectina LES-
x la interacción [47]. Por otra parte, varios trabajos reportaron una correlación entre SLe
x, y la adhesión a la citoquina estimulada en HUVEC H7721 hepatocarcinoma [48], [49], [50], [51] y en células de adenocarcinoma de pulmón [52]. De acuerdo con estos datos, nuestros resultados mostraron una correlación directa entre la adherencia adenocarcinoma pancreático en
in vitro
rh-E-selectina y niveles ST3Gal III en las células tumorales pancreáticas, a través de SLe
x. Por otra parte, en el estudio de la adhesión de células de adenocarcinoma pancreático a las células endoteliales sinusoidales hepáticas,
x sobreexpresan células C31 ST3Gal III y SLE demostraron una mayor capacidad para adherirse a IL-1β estimulada células de HSE en comparación con los controles. células HSE pre-tratamiento con IL1-β y las citocinas TNF-α aumentó significativamente Capan-1 de adhesión celular a las células de HSE y volvió a los niveles basales en células de HSE preincubó anti-E-selectina. Estos resultados son consistentes con el trabajo anterior informa de que la expresión de E-selectina es bajo o ausente en células de HSE en condiciones normales, pero pueden ser de hasta reguladas por citoquinas [53], por los hepatocitos [54] o como una respuesta a las células tumorales metastásicas [ ,,,0],55]. La adhesión de ST3Gal III y LES
x sobreexpresan las células C31 a las células no estimuladas de HSE fue significativamente mayor en comparación con las células control Capan-1 y CP. Esta adhesión no se revirtió cuando pre-incubación de las células de HSE con anti-E-selectina, lo que podría explicarse por un no-E-selectina dependiente, pero SLe
x mediada, la adhesión de células de cáncer pancreático a las células no estimuladas de HSE . Esta interacción podría estar mediada por otra SLe
x de la célula de unión a moléculas de adhesión tales como P-selectina [55], [56] o I-tipo lectinas. De hecho, un estudio anterior informó de la unión de ST3Gal III que sobreexpresan las células de cáncer de colon a HUVEC no activado, lo que sugiere este no-E-selectina SLe dependiente
x adhesión mediada podría ser debido a las lectinas de tipo i [46].
Para nuestro conocimiento, este es el primer informe sobre una correlación positiva entre la migración celular y ST3Gal III y LES
x niveles de expresión en células de adenocarcinoma de páncreas. A pesar de la ausencia de estudios sobre células de cáncer pancreático, algunas investigaciones apoyan nuestros hallazgos. Cuando estaba deprimido la expresión de ácido siálico α2,3-superficie de la célula tumoral en la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 (mediante la inhibición de la actividad α2,3-sialiltransferasa celular con soyasaponin I), la migración de células disminuyó significativamente [57]. ST3Gal III sobreexpresión en la línea celular de glioma U-374 aumento de la expresión de ácido siálico α2,3-ligado en la superficie celular y dio lugar a un
vitro
fenotipo más en invasiva [58]. Además, las células de hepatocarcinoma H7721 mostraron una correlación directa entre la cantidad de superficie SLe
x expresión y la migración [50], [51], [59]. Por otra parte, SLE
x era crucial para la migración H7721, ya que la migración fue inhibida por anti-SLe
x MAb y después de la eliminación de residuos de ácido siálico [60]. La migración celular es un proceso de múltiples pasos que desempeña un papel fundamental en la metástasis. La respuesta inicial de las células migratorias a un agente de migración de promoción es para polarizar y extender salientes. Estos salientes son estabilizadas por moléculas de adhesión de la matriz extracelular, tales como las integrinas, y sirven como sitios de tracción para la migración como la célula se mueve hacia adelante sobre ellos [61]. Hay un creciente cuerpo de evidencia que demuestra que las capacidades de migración de las influencias de sialilación mediante la modulación de la función de la integrina [58], [62], [63], [64]. Por lo tanto, la hipótesis de que ST3Gal III podría estar influyendo en la migración celular mediante la alteración de la integrina sialilación. Un aumento en ácido α2,3-siálico en la superficie de células C31 y M34 también podría alterar los niveles de sialilación de sus integrinas, modulando su adhesión de la matriz extracelular.