Extracto
Antecedentes
Aunque el tratamiento multimodalidad puede inducir la alta tasa de remisión en muchos subtipos de linfoma no Hodgkin (LNH), una proporción significativa de pacientes con recidiva de la enfermedad incurable. El efecto de la médula ósea humana (BM) células madre mesenquimales (MSC) en el crecimiento de las células tumorales es controversial, y no hay información específica disponible sobre el efecto de BM-MSC sobre la NHL.
Metodología /Principales conclusiones
El efecto de BM-MSC se analizó en dos
in vivo y modelos de los linfomas no Hodgkin difundidos con un indolente (EBV
- Burkitt tipo BJAB, la mediana de supervivencia = 46 días) y un agresivo (VEB
+ B SKW6.4 linfoblastoide, la supervivencia media = 27 días) el comportamiento en ratones nude-SCID. Intraperitoneal (ip) de MSC (4 días después de la inyección intraperitoneal de células de linfoma) aumentó significativamente la supervivencia global en una proporción de 1:10 MSC:lymphoma óptima en ambos modelos de xenoinjertos (BJAB + MSC, la supervivencia media = 58,5 días; SKW6.4 + MSC, la supervivencia media = 40 días). Tras la inyección MSC, i.p. masas tumorales desarrollan más lentamente y, en la observación histopatológica, mostraron una infiltración masiva del estroma acoplado a una extensa necrosis intra-tumor. En
in vitro
experimentos, se encontró que: i) el MSC /linfoma co-cultivos moderadamente afectado la supervivencia de células de linfoma y se caracterizaron por una mayor liberación de citoquinas pro-angiogénicos con respecto al MSC, o linfoma, las culturas; ii) MSC inducir la migración de células endoteliales en transwell ensayos, pero promueve la apoptosis de células endoteliales en células MSC /endotelial co-cultivos directos.
Conclusiones /Importancia
Nuestros datos demuestran que BM-MSC exhibir actividad anti-linfoma en dos distintos modelos de xenoinjertos de ratones SCID de NHL diseminada
Visto:. Secchiero P, S Zorzet, Tripodo C, Corallini F, E Melloni, Caruso L, et al. (2010) la médula ósea humana mesenquimales células madre Exhibidores actividad anticancerígena en ratones SCID con xenoinjertos de linfoma de no Hodgkin diseminada. PLoS ONE 5 (6): e11140. doi: 10.1371 /journal.pone.0011140
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 23 de febrero, 2010; Aceptado: 24 de mayo de 2010; Publicado: 16 Junio 2010
Derechos de Autor © 2010 Secchiero et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Associazione Ricerca contro il Cancro subvención Italiana per la (AIRC) y por la Fundación Carife. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar del hecho de que el tratamiento multimodalidad, incluyendo la quimioterapia de combinación, la radiación, y los anticuerpos monoclonales específicos de la diana, como el rituximab, puede inducir la alta tasa de remisión en muchos subtipos de linfoma no Hodgkin (LNH), una proporción significativa de los pacientes con recaída de la enfermedad incurable. Por lo tanto, los tratamientos efectivos para NHL siguen siendo un grave necesidad médica no satisfecha, también teniendo en cuenta que la incidencia de NHL sigue aumentando [1]. Las formas más frecuentes de linfoma no Hodgkin son tumores malignos de células B, de los cuales el linfoma folicular (FL) y el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) constituyen la mayoría [2]. El linfoma de Burkitt es una forma menos frecuente de NHL caracterizan por el desplazamiento del oncogén c-myc a la cadena pesada región del promotor /potenciador de Ig [3]. La acumulación de pruebas ha demostrado que, de manera similar a los tumores sólidos, el componente de células del estroma en el LNH no se forma por personas inocentes en el proceso neoplásico, pero está compuesto por los tipos de células que podría activamente influencia y promover el crecimiento de las células transformadas adyacentes [4 ] - [9]. Sin embargo, el efecto de la médula ósea humana (BM) células madre mesenquimales (MSC), que se consideran las células madre del estroma progenitoras dentro de la BM, sobre el crecimiento de células tumorales es controvertido.
MSC están generalmente aislado de la fracción mononuclear adherente de aspirados BM, puede proliferar durante muchos pases en cultivo y tienen varias propiedades que hacen una opción atractiva como agentes terapéuticos celulares hacen. De hecho, son relativamente no inmunogénico, aunque el mecanismo de su privilegio inmune no se entiende bien y es un objeto de intenso estudio [10] - [12]. Debido a estas propiedades, el MSC presentar un potencial considerable terapéutico en enfermedades degenerativas [13], [14]. Por otro lado, con respecto a su potencial uso terapéutico en enfermedades neoplásicas, algunos estudios han sugerido que el MSC transferida adoptivamente podría favorecer el injerto de tumor y la progresión
in vivo
[9], [12], [15]. Los efectos perjudiciales podrían derivar de diferentes características MSC. De hecho, MSC migrar específicamente a los sitios de la tumorigénesis activo, donde podrían integrar el nicho tumor especializada, contribuir al desarrollo de fibroblastos y miofibroblastos asociados a tumores [16] - [18], estimular la angiogénesis [18] - [20], y promover el crecimiento y la resistencia a los medicamentos de ambos tumores sólidos y neoplasias malignas hematológicas [18], [21] - [26]
sobre estas bases, en el presente estudio hemos investigado el efecto de la administración MSC derivados de BM. en dos modelos de diseminada NHL, establecido por intra-peritoneal (ip) de inyección en ratones nude-SCID de EBV
- Burkitt de tipo BJAB y EBV
+ B líneas celulares linfoblastoides SKW6.4, caracterizado por un indolente ( BJAB) y un comportamiento agresivo (SKW6.4). Contrariamente a nuestras expectativas, hemos encontrado que BM-MSC prolongó significativamente la supervivencia de xenoinjertos de linfoma de rodamiento.
Resultados
Caracterización de los modelos de xenoinjertos BJAB y SKW6.4
SCID Los ratones fueron ip inyectado con un número óptimo de pre-determinado (2 × 10
6) de linfoma (BJAB o SKW6.4) células. xenoinjertos BJAB se caracterizaron por tumores peritoneales, que comenzaron a ser palpable y medible por observación externa a los 18-20 días después de la inyección y de manera constante progresaron hasta que la muerte los ratones (Figura 1A). Por otro lado, en xenoinjertos de SKW6.4, una masa de células tumorales era apenas palpable en cualquier punto de tiempo examinado. El examen histopatológico de las masas peritoneales mostraron que tanto BJAB- y tumores SKW6.4 derivados tienen un patrón sólido de crecimiento de CD20
+ células linfoblastoides (Figura 1A). se observó la difusión variable de CD20
+ células linfoblastoides en los ganglios linfáticos y el bazo, mientras que la médula ósea y los riñones eran por lo general no afectado (Figura 1B). Por otra parte, ambos xenoinjertos de linfoma de rodamiento y, en particular xenoinjertos SKW6.4, exhibido con frecuencia la infiltración masiva de aislado o CD20
+ células linfoblásticas en el hígado (Figura 1B).
ratones SCID fueron por vía intraperitoneal inyectado con BJAB o células SKW6.4 (2 × 10
6). A, BJAB, pero no SKW6.4 xenoinjertos fueron caracterizados por tumores peritoneales medibles por observación externa. La flecha muestra la frontera exterior de la masa tumoral. En las inserciones, aspecto macroscópico de las masas peritoneales y histológicos H & amp; E se muestran coloraciones y CD20 (ampliación original, 20 ×). B, examen histopatológico de secciones de tejidos obtenidos a partir de necroptic SKW6.4 xenoinjerto que muestran ausentes (riñón y médula ósea), aislado (flechas; bazo y el hígado) o masivas (de los ganglios linfáticos y el hígado) infiltración de CD20
+ células linfoides humanas. Aumento original, 20 aumentos. C, el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier de los modelos de xenoinjertos NHL. El porcentaje de supervivencia de los ratones inyectados con BJAB (n = 15) o SKW6.4 (n = 15) las células se midió desde el día de la inyección de células de linfoma hasta que el día de la muerte. Asterisco,
p
. & Lt; 0,01
Es de destacar que, a pesar de las grandes masas peritoneales en BJAB con respecto a los ratones de xenoinjerto SKW6.4, la supervivencia media de SKW6.4 xenoinjertos fue significativamente (p & lt; 0,01) más corto (27 días) en comparación con la de xenoinjertos de BJAB (47 días; Figura 1C).
inyección de MSC derivadas de BM prolonga significativamente la supervivencia de ambos BJAB y SKW6.4 xenoinjertos
Para determinar el efecto de la humana BM-MSC sobre la supervivencia de xenoinjertos de linfoma, grupos de ratones SCID fueron ip inyectados con células SKW6.4 BJAB o y, después de 4 días, con el MSC en una proporción de 10:01 lymphoma:MSC. Un grupo de ratones se inyectó con MSC solo, como control. de xenoinjerto en ratones tratados con BJAB + MSC y SKW6.4 + MSC mostraron una disminución significativa (p & lt; 0,01) aumento de la supervivencia en comparación con el respectivo BJAB (Figura 2A) o xenoinjertos SKW6.4 (Figura 2B). Es de destacar que el aumento de la cantidad de MSC inyectado a una relación de 02:01 lymphoma:MSC no mejoró la supervivencia global de los xenoinjertos BJAB (Figura 2A). Además, en el modelo de xenoinjerto de BJAB, lo que permitió la medición precisa de la masa del tumor por inspección externa, encontramos que la mejora en la supervivencia fue acompañado de una disminución significativa (p & lt; 0,05) retardo del crecimiento del tumor en ratones inyectados con BJAB + MSC con respecto con los ratones inyectados con BJAB sola (Figura 2C).
ratones SCID fueron ip inyectado con (n = 10) células BJAB (n = 10) o SKW6.4 y, después de 4 días, con MSC en una proporción de 10:01 lymphoma:MSC. Como control, un grupo de ratones se inyectó (n = 10) con MSC solo. El análisis de Kaplan-Meier de los modelos de xenoinjertos de la NHL, la comparación de la supervivencia de los ratones inyectados con BJAB ± MSC (A) o SKW6.4 ± MSC (B). En los ratones de xenoinjerto BJAB, los resultados obtenidos en un grupo de ratones (n = 10) inyectado con MSC en una proporción de 02:01 lymphoma:MSC también se muestran (A). El porcentaje de supervivencia se midió desde el día de la inyección de células de linfoma hasta que el día de la muerte. Asterisco,
p Hotel & lt; 0,05 con respecto a los ratones BJAB o SKW. C, tumores peritoneales se midió cada semana, hasta la muerte del animal, tal como se describe en el Material y Métodos section.Results son medias ± SD. Asterisco,
p
. & Lt; 0,05
El examen histopatológico del tejido tumoral de los ratones SCID de xenoinjertos mostraron sorprendentemente distintas características entre las masas peritoneales desarrollados después de la inyección con células de linfoma o células de linfoma + MSC. Estos análisis se llevaron a cabo principalmente en el modelo de xenoinjerto de BJAB debido al tamaño grande de las masas, pero se observaron características histopatológicas similares también en los xenoinjertos SKW6.4. Como se muestra en la Figura 3A, los tumores BJAB exhibieron un patrón sólido de crecimiento con una malla discreta del estroma, confirmado por tinción con tricrómico de Masson, y pocos vasos intra-tumorales, como se detecta por CD31 tinción inmunohistoquímica, una situación histopatológico que recuerda a la observada en la mayoría de LNH humana [27]. Por otro lado, las masas tumorales desarrolladas en ratones co-inyectados con BJAB y células MSC mostraron un aspecto completamente diferente, caracterizado por: las áreas que contienen puentes estromales mezcladas con láminas de células BJAB, como claramente documentada tanto por H & amp; E y tinciones tricrómico de Masson, y las células estrelladas mesenquimales intra-tumorales caracterizan a menudo por la positividad a a-SMA (Figura 3B). De particular interés fue el hallazgo de que los ratones co-inyectados con BJAB + MSC mostró varios focos intra-tumoral de necrosis (Figura 3B), y láminas de células BJAB con focos de necrosis a menudo eran coincidentes con las áreas que contienen α-SMA
+ estroma las células (Figura 3B)
Secciones de masas peritoneales de BJAB (A) y BJAB + MSC (B) los ratones de xenoinjerto se analizaron después de H & amp;. e y tinciones tricrómico de Masson y immunophenotypical análisis realizados con anticuerpos anti-CD31 o anti-αSMA, como se indica. En H & amp; E, secciones de tinción asteriscos indican pequeños focos de necrosis en las masas tumorales (B). En las secciones teñidas con tricrómico de Masson, las fibras de colágeno son de color azul (puntas de flecha) y la evidencia de una delgada y discreta malla estromal entre el patrón sólido del tumor en A, o una arquitectura del estroma más difuso y gruesa en B. CD31
+ endotelial células y células parecidas a miofibroblastos α-SMA son de color marrón (flechas en a y B). aumento original × 20.
El
in vitro
co-cultivo con MSC afecta marginalmente la supervivencia de células de linfoma /proliferación, mientras que promueve la liberación de citoquinas angiogénicos
para determinar si la actividad anti-linfoma de MSC observó
in vivo
se debió a un efecto inhibidor directo de MSC en células de linfoma, hemos probado si el MSC podría modular la supervivencia /crecimiento de células BJAB y SKW6.4 en un
in vitro
sistema de co-cultivo in. La viabilidad celular de los cultivos BJAB mostró una disminución moderada pero significativa (media ± SD: 20 ± 6%, p & lt; 0,05), acoplado a la inducción de apoptosis, cuando BJAB se co-cultivaron en la presencia de células MSC, en una proporción lymphoma:MSC de 10:01 (Figura 4A). En los otros niveles de la mano, la viabilidad celular y la apoptosis de SKW6.4 culturas, eran totalmente afectado por la presencia de MSC (Figura 4A). Además, con el fin de comparar la liberación de citoquinas pro-angiogénicos (Tabla S1), se realizó basada en anticuerpos matriz de análisis de proteínas de sobrenadantes de cultivo de: i) células de linfoma SKW6.4, ii) MSC, iii) SKW6.4 /MSC co-cultivadas en contacto directo; iv) SKW6.4 /MSC co-cultivaron en placas Transwell. Como era de esperar, MSC produce niveles significativos de varias citocinas pro-angiogénicos, algunos de los cuales (angiogenina, IL-8, CCL2 y VEGF) fueron significativamente hasta reguladas por la presencia concomitante de las células SKW6.4 (Figura 4B). Ambos co-cultivos directos e transwell linfoma /MSC fueron igualmente eficaces en la promoción de la liberación de citoquinas. Las cantidades de IL-8 y VEGF se midieron además por ELISA (Figura 4C) y los resultados fueron consistentes con los de la matriz de análisis de proteínas (Figura 4B). Como se muestra en la Figura 4C, también debe tenerse en cuenta que una disminución significativa (p & lt; 0,05) aumento de la liberación de IL-8 y VEGF, con respecto a MSC solo, se observó tanto en MSC /SKW6.4, así como en MSC /BJAB co-cultivos.
células BJAB y SKW6.4 se cultivaron en ausencia o presencia de MSC, en una proporción de 10:01 lymphoma:MSC. A, Después de 96 horas de cultivo, la apoptosis de células de linfoma se analizó mediante doble tinción con anexina V /PI. B, Los sobrenadantes de cultivo se recogieron a partir de: células de linfoma SKW6.4 solos, solos MSC, SKW6.4 /MSC directos co-cultivos y SKW6.4 /MSC transwell co-cultivos. La liberación de citoquinas pro-angiogénicos se evaluó en los sobrenadantes de cultivo mediante el uso de una matriz de angiogénesis humana proteoma perfiles. Los círculos en las membranas destacan cuatro citoquinas (angiogenina, IL-8, CCL2 y VEGF) liberados por el MSC, que son significativamente hasta reguladas por la presencia concomitante de las células SKW6.4. Se obtuvieron resultados similares a partir de tres experimentos independientes y los resultados de uno de ellos se muestran. El gráfico de barras muestra los resultados de los análisis densitométricos de las membranas. Las abreviaturas de las citoquinas analizadas se definen en la Tabla S1. Asterisco, p & lt; 0,05. C, se midieron los niveles de IL-8 y VEGF en los sobrenadantes de cultivo de los cultivos indicados por ELISA. se reportan los datos como media ± DE de cuatro experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. Asterisco, p. & Lt; 0,01
MSC inducir la migración de células endoteliales y promover la apoptosis de las células endoteliales en directo MSC /endotelial contacto celular
Desde MSC liberar un potente cóctel de pro-angiogénicos factores [28] - [30], hemos examinado la capacidad de la próxima MSC para impulsar la migración de las células endoteliales. Como se muestra en la Figura 5A, los cultivos de MSC ejercieron una potente (p & lt; 0,01) la actividad pro-migratorio en las células endoteliales, tal como se evaluó en ensayos Transwell. Basándose en estas observaciones, en el último grupo de experimentos que hemos investigado el efecto de una interacción directa entre MSC y células endoteliales. Para este propósito, subconfluentes HUVEC se sembraron en placas de 6 pocillos, y el día siguiente, se añadieron a una relación de MSC cell:MSC endotelial de 05:01. En un conjunto de experimentos, antes de la adición de MSC, HUVEC fueron cargados con los carbocianina DiI fluorichrome [31], teniendo en cuenta que la transferencia de DiI de diferentes tipos de células se ha descrito. MSC /HUVEC o-cultivos fueron entonces controlados cada día por examen morfológico (bajo un contraste de fase invertida y microscopio de fluorescencia) y la cuantificación de la fluorescencia en general en comparación con cultivos de solamente HUVEC (Figura 5B). Como era de esperar, en el día 1, la fluorescencia se limita a células endoteliales, mientras que MSC eran completamente negativas. Con el tiempo hemos observado acontecimientos de fluorescencia difusa tinción de MSC, lo que indica que el MSC había fusionado a la red de células endoteliales (Figura 5B). En paralelo, en la circular MSC /HUVEC co-cultivos, documentamos un colapso progresivo de la monocapa de células endoteliales, con la prevalencia de las células endoteliales muertas cerca del MSC y un aumento significativo de las células apoptóticas, cuantificado por Anexina-V /PI doble tinción ( Figura 5B-C). Por desgracia, en estas series de experimentos no se pudo llevar a cabo experimentos tripartitos con la adición también de células de linfoma, por problemas técnicos, principalmente debido a las diferencias en los requisitos de medios de cultivo.
En A, la migración HUVEC se evaluó en placas Transwell hacia el MSC, se siembra (72 horas antes) en la cámara inferior de las placas transwell, frente al medio de control. se muestran 10 × fotografías de aumento de filtros manchados representativos; áreas más oscuras son debido a una mayor densidad celular. El número medio de células que migran por campo se evaluó contando al menos cuatro campos aleatorios de alta potencia por filtro. Los resultados son la media ± SD de tres experimentos cada uno realizado por duplicado. En B y C, subconfluentes HUVEC se sembraron en ausencia o en presencia de MSC (relación cell:MSC endotelial de 5:01). Imágenes por microscopía de fluorescencia y contraste de fase muestran la disminución significativa de la densidad de células endoteliales tras la adición de MSC a los cultivos. B, Las imágenes representativas que muestran rojos Dil-etiquetados células endoteliales, tal como aparecen en HUVEC culturas (recuadro), y el MSC, que adquieren la coloración después de 4 días de co-cultivos con HUVEC marcado. aumento original × 20. fluorescencia cultura general de HUVEC y HUVEC + MSC se cuantificó con un lector de placas de fluorescencia. C, La presencia de células muertas en imágenes representativas por microscopía de contraste de fase se indica por asteriscos. aumento original × 20. apoptosis de las células En general se evaluó mediante tinción con anexina V /PI. Los datos en B y C son la media ± SD de tres experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. Asterisck,
p
. & Lt; 0,05
Discusión
Anterior
in vivo
estudios han evaluado el efecto de MSC en modelos animales de hematológicos neoplasias malignas confinadas en gel dispositivos subcutáneos [14], [15], [32]. Teniendo en cuenta que la mayoría de los NHL avanza principalmente como una malignidad sistémica, en este estudio hemos desarrollado y descrito dos modelos animales que nos permitieron la investigación de la actividad de MSC contra NHL en xenoinjertos de portadores de tumores diseminados. De hecho, después de i.p. inyección, las células de linfoma y BJAB SKW6.4 malignas formadas masas tumorales, con diseminación frecuente de hígado y los ganglios linfáticos abdominales.
El principal hallazgo de este estudio es que una sola inyección MSC, en la proporción de células MSC:tumor tan bajo como 1:10, prolongó significativamente la supervivencia en animales con indolente (BJAB) y los linfomas (SKW6.4) agresivos. Esta observación fue particularmente alentador ya que se obtuvo en xenoinjertos que llevan NHL difundidos, que, en nuestra opinión, son más relevantes que los modelos subcutáneos NHL empleadas en los estudios anteriores [14], [15], [32]. De nota, aumentando el número de MSC, hasta proporción de células MSC:tumor de 01:02, no dio lugar a una mejora significativa de la eficacia terapéutica de MSC. La inyección de MSC retrasa el desarrollo de las masas tumorales peritoneales de los xenoinjertos de NHL, y al análisis necrópsico, las muestras de tumor se desarrolló en ausencia o presencia de MSC mostraron diferencias histológicas significativas, que pueden ser recapitulado como sigue: mientras BJAB- y /o masas peritoneales SKW6.4 derivados mostraron la red capilar débil típico también se describe en el NHL humano [27], la presencia de MSC promovido un aumento difuso de α-SMA
+ incorporación de células en todo el compartimiento del estroma en la varianza de la escasa SMA
+ patrón perivascular observó principalmente en la ausencia de MSC. Además, las zonas de necrosis masivas intra-tumoral se observó preferentemente en el linfoma + MSC inyectaron animales y cuenta probable para las masas tumorales reducidos que caracterizan estos ratones con respecto a los animales inyectados con células de linfoma solo.
En el intento de dilucidar el mecanismo (s) por el cual el MSC ejercen actividad anti-linfoma
in vivo
, hemos realizado una serie de
in vitro
experimentos en los sistemas de co-cultivo. Los resultados derivados de estos experimentos tienden a excluir un efecto citotóxico directo significativo de MSC en células de linfoma, desde el MSC moderadamente inhibido la viabilidad de BJAB, pero no mostró ningún efecto apreciable sobre la supervivencia de las células SKW6.4 /crecimiento. De interés, la capacidad de los cultivos de MSC de secretar altos niveles de citoquinas angiogénicas, tales como VEGF, IL-8, la angiogenina y CCL2, fue significativamente (p & lt; 0,01) mejorado por la presencia concomitante de las células de linfoma. En consonancia con su capacidad de liberación de varias citoquinas pro-angiogénicos, MSC promovido potentemente la migración de células endoteliales en transwell ensayos. Sin embargo, cuando MSC fueron directamente co-cultivadas con células endoteliales, se observó una inducción significativa de la apoptosis de células endoteliales. A este respecto, nuestros resultados actuales están de acuerdo con los de otros autores que han demostrado que el MSC en determinadas circunstancias podría ejercer la actividad anti-angiogénica en sarcomas altamente vascularizados Kaposi [33], así como en cultivos de células endoteliales normales
in
vitro [34]. Por lo tanto, aunque no hemos podido documentar la relevancia de estos
in vitro
datos en nuestros modelos animales, nuestros hallazgos sugieren la existencia de una compleja interacción entre el MSC, células de linfoma y células endoteliales, que se caracteriza por: i) una liberación significativa de pro-angiogénicos citoquinas pro-migratorias /por el MSC, que se ve reforzada por la presencia de células de linfoma; ii) una potente actividad quimiotáctica de MSC en las células endoteliales, seguido de una actividad citotóxica de las MSC en las células endoteliales, lo que requiere el contacto de células MSC /endotelial.
También son conscientes de que la extrapolación de un modelo animal dado a clínicamente relevantes situaciones deben ser consideradas con extrema precaución. En particular, hay que recordar que una limitación importante de nuestro estudio es representado por el hecho de que la respuesta inmune anti-tumoral no es valiosa en nuestro modelo SCID, pero probablemente es importante en el efecto general de MSC sobre el crecimiento del tumor. De hecho, se ha demostrado que el efecto inmunosupresor de MSC podría favorecer el crecimiento del tumor en los animales alogénicas [12]. Aunque algunos datos controvertidos están presentes en el papel del MSC en el desarrollo del cáncer y /o la terapia [35], [36], varias conclusiones novedosas se pueden resumir de nuestro estudio: i) el
in vitro
interacción en la de BM MSC -derivado y células de linfoma poco predice el
in vivo
efecto de MSC sobre la supervivencia de los animales portadores de xenoinjertos; ii) MSC modular significativamente la red del estroma de los linfomas
in vivo
, al aumentar el número de células α-SMA-positivas y la inducción de un aumento de la necrosis intratumoral; iii) el MSC promover la migración de células endoteliales
in vitro
seguido de la muerte de las células endoteliales tras el contacto de células MSC /endotelial directa.
Materiales y Métodos
Las células
líneas de células SKW6.4 y BJAB se obtuvieron de DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Alemania) o adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), y se cultivaron en RPMI-1640 que contiene 10% fetal de suero bovino (FBS; Gibco BRL, Gaithersbrg, MD). MSC derivados de BM y de la vena umbilical humana células endoteliales humanas (HUVEC) fueron adquiridos de Lonza (Walkersville, MD). BM-MSC se cultivaron de forma rutinaria en el MSC-Medio de Crecimiento (MSC-GM, Lonza). HUVEC se cultivaron en placas de cultivo tisular recubiertas con gelatina 0,2% en medio de crecimiento endotelial M199 suplementado con 20% FBS, 10 mg /ml de heparina, y 50 mg /ml ECGF (todos de Lonza) como se describe anteriormente [37]. En todos los experimentos, MSC y HUVEC fueron utilizados entre el 3
ª y 6
º paso
in vitro.
modelos de xenoinjertos de ratón NHL
Femenino CB -17 ratones SCID (4 semanas de edad) se obtuvieron de Charles River Laboratories (Hollister, CA) y se mantuvieron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio. Los animales fueron alojados en jaulas micro-aislador con acceso libre a comida y agua. Los procedimientos con animales y su cuidado se realizaron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales Institucional de la Universidad de Trieste (número de autorización del Ministerio de Salud 191 Italiano /2008-D). En particular, se puso cualquier esfuerzo para evitar el dolor innecesario de los animales. SKW6.4 o BJAB (2 × 10
6) se recogieron las células, se suspendieron en PBS, y i.p. se inyectan en ratones 6 semanas de edad. Después de 4 días, los ratones linfoma de xenoinjertos fueron distribuidos aleatoriamente en grupos (por lo menos 10 ratones para cada grupo), y por vía intraperitoneal dosifican con vehículo (PBS) o MSC (2 × 10
5 o 1 × 10
6, que corresponde a una relación de lymphoma:MSC de 10:01 y 02:01 respectivamente). En un grupo de ratones SKW6.4 (n = 10), el MSC se inyectaron a los 12 días después de la inyección SKW6.4.
Los animales fueron controlados diariamente para cambios en el peso, los efectos secundarios del tratamiento o signos de cualquier enfermedad. El crecimiento del tumor se determinó mediante mediciones de pinza de dos ejes ortogonales y el volumen del tumor se calculó por la fórmula: (π /6) x
a
2 ×
b
, en la que
una
es la más corta y
b
es el eje más largo; la densidad del tumor se supuso que era igual a uno. La supervivencia se calculó como la duración de la vida útil del animal de la inoculación de células de linfoma hasta la muerte. La necropsia se llevó a cabo para determinar la extensión macroscópica y las características histológicas de las masas peritoneales. Además, los principales órganos, incluyendo el corazón, los riñones, el fémur (de la médula ósea), el hígado, el bazo, los nodos se recogieron para su examen microscópico y evaluar la tendencia de la propagación del injerto.
El análisis histopatológico y immunophenotypical
especímenes de animales se fijaron en 10% de solución tamponada con formalina y embebidos en parafina. Para el análisis morfológico, las secciones de 4 micras de espesor fueron cortadas de los bloques de parafina y teñidas con hematoxilina-eosina. La inmunohistoquímica se realizó por los medios del método de complejo de estreptavidina-biotina-peroxidasa utilizando los siguientes mAbs primaria para: CD20, α-SMA y CD31 (Dako, Glostrup, Dinamarca). 3-3'diaminobenzidine se utilizó como cromógeno (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Para la determinación del contenido de colágeno, las secciones se tiñeron con tricrómico de Masson. Después de las tinciones, los portaobjetos se examinan bajo un microscopio óptico Leica DM2000 y se tomaron microfotografías con una cámara digital Leica DFC320.
Experimentos
Co-Cultura y
Para el linfoma /MSC co-cultivo
vitro
experimentos en, MSC se sembraron en 6 placas de pocillos y el día siguiente, ya sea BJAB o se añadieron células SKW6.4 a los cultivos de MSC en una relación de 10:01 lymphoma:MSC. Co-cultivos se llevaron a cabo durante un máximo de 96 horas, en medio de células de linfoma. En algunos experimentos, co-cultivos se llevaron a cabo mediante el uso de 24-Transwell placas (3.0 micras, tamaño de poro; Corning Costar, Cambridge, MA), con el MSC sembró en las células de linfoma de compartimentos inferiores y añadidos en el compartimiento superior
Para endotelial /MSC co-cultivos, HUVEC se sembraron en placas de 6 pocillos y al día siguiente, se añadieron MSC en una proporción de 05:01 HUVEC:MSC. Co-cultivos se llevaron a cabo durante un máximo de 5 días en medio de HUVEC. En algunos experimentos, antes de la adición de MSC, HUVEC fueron cargados con los DiI carbocianina fluorocromo (1,1'dioctadecyl-3,3,3 ', perclorato 3'tetramethylindocarbocyanine; Molecular Probes, Invitrogen, Merelbeke, Bélgica). DiI es una molécula lipofílica que incorpora en la membrana celular, y tiene las siguientes características espectrales: máximo de absorción a 549 nm y un máximo de emisión a 565 nm. Para este propósito, HUVEC se incubaron con DiI 50 g /ml durante 2 horas antes de realizar MSC: células endoteliales co-cultivos. Se observó la morfología de los cultivos de HUVEC y HUVEC /MSC co-cultivos periódicamente con el tiempo bajo un contraste y la fluorescencia microscopio de fase invertida y la fluorescencia total se cuantificó con un lector de placas de fluorescencia.
ensayo de apoptosis
para el análisis de la apoptosis, las células se doble teñidas con anexina isotiocianato V-fluoresceína (Alexis Biochemicals, Lausen, Suiza) y yoduro de propidio (PI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se analizaron usando un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson , San Jose, CA), como se describe anteriormente [38]. Para evitar la fluorescencia no específica de las células muertas, las células vivas fueron cerrada herméticamente utilizando dispersión frontal y lateral. En particular, para HUVEC y culturas MSC /HUVEC, para analizar el grado de apoptosis en toda la población de células, las células de sustrato-adjunto se recogieron por tratamiento con tripsina y se agruparon con células flotante para la tinción.
array Proteoma perfilador y ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas
los sobrenadantes de cultivo se analizaron mediante el uso de la matriz de la angiogénesis humana proteoma de perfiles (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, cantidades iguales de los sobrenadantes de cultivo se diluyeron y se mezcla con un cóctel de anticuerpos angiogénesis de detección biotinilados y se incubaron con el (captura) las membranas de anticuerpos durante la noche a 4 ° C. Después del lavado de material no unido, las membranas se incubaron con estreptavidina conjugada con HRP. La quimioluminiscencia se utilizó para la detección de la señal. Intensidad de la tinción de puntos se determinaron con el software ImageQuant (Molecular Dynamics) y se expresó como unidades arbitrarias.
ligado a enzimas ensayos de inmunoabsorción (ELISA) para los análisis de IL-8 y VEGF se realizaron utilizando comercialmente disponibles kits de ELISA (R & amp ; D Systems). Los ensayos se realizaron por duplicado y de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los resultados se leyeron a una densidad óptica de 450 nm usando un lector de ELISA Anthos 2010 (Anthos Labtec Instruments, Wals Salzburgo, Austria).
migración celular endotelial ensayo
ensayo de migración celular se realizó en 24 -bien placas Transwell (8,0 micras, tamaño de poro), como se describe anteriormente [39]. MSC se sembraron en medio de cultivo de HUVEC en la cámara inferior de las placas Transwell y, después de 72 horas, 0,25 × 10
5 HUVEC por pocillo se añadieron a las cámaras superiores en 100 l de medio.