Extracto
microambiente tumoral (TME) es un jugador activo en la carcinogénesis y los cambios en su composición modificar el crecimiento del cáncer. fibroblastos de carcinoma asociado a, células madre mesenquimales multipotentes derivadas de la médula ósea (BMMSCs), y células inflamatorias pueden afectar la composición de TME que conduce a cambios en la proliferación, la invasión y la formación de metástasis de células de carcinoma. En este estudio, se confirmó una interacción entre células de la lengua oral de carcinoma de células escamosas (OTSCC) BMMSCs y analizando el patrón de progresión invasión y la expresión génica. En un modelo de invasión mioma organotípicos de 3 dimensiones de la presencia de BMMSCs inhibió la proliferación, pero aumentó la invasión de las células OTSCC. Además, las señales que se originan a partir de células OTSCC regulados hasta la expresión de quimiocinas inflamatorias por BMMSCs, mientras que los productos BMMSC indujeron la expresión de moléculas de invasión ligado conocidos por las células de carcinoma. En particular, después de las interacciones célula-célula, la CCL5 quimiocina se secreta abundantemente de BMMSCs y una función de bloqueo de anticuerpos contra CCL5 inhibida BMMSC mejorada área invasión del cáncer. Sin embargo, el anticuerpo bloquea CCL5 no inhibió la profundidad de la invasión. Además, después de la exposición a BMMSCs, la expresión de ARNm de colágeno tipo I en las células OTSCC fue notablemente hasta reguladas. Curiosamente, también de alta expresión de colágeno tipo I propéptido N-terminal (PINP)
in vivo
correlacionada con la mortalidad específica por cáncer de los pacientes OTSCC, mientras que no hubo asociación entre los niveles de CCL5 de tejido de cáncer y los parámetros clínicos. En conclusión, nuestros resultados sugieren que la interacción entre BMMSC y células de carcinoma de inducir citoquinas y la matriz de la expresión de moléculas, de las cuales alto nivel de la producción de colágeno de tipo I se correlaciona con el pronóstico de los pacientes OTSCC.
Visto: Salo S, C Bitu, Merkku K, P Nyberg, Bello IO, Vuoristo J, et al. (2013) la médula ósea humana mesenquimales células madre inducir la producción de colágeno y la lengua invasión del cáncer. PLoS ONE 8 (10): e77692. doi: 10.1371 /journal.pone.0077692
Editor: Dimas Tadeu Covas, Universidad de Sao Paulo - USP, Brasil |
Recibido: 14 Junio, 2013; Aceptado: 2 Septiembre 2013; Publicado: 21 Octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Salo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio ha sido apoyado por la Academia de Finlandia, la Sociedad de cáncer de Finlandia, la Fundación Sigrid Juselius, la Sociedad finlandesa Dental Apolonia, y las subvenciones de la Fundación Emil Aaltonen. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el microambiente tumoral (TME) se somete a cambios extensos durante el crecimiento del tumor [1] y la progresión de un tumor depende de los elementos del estroma [2]. Las células en el microambiente, incluyendo fibroblastos de carcinoma asociado (CAF), células de médula ósea derivadas de multipotentes estromales mesenquimales (BMMSCs), macrófagos asociados al tumor (TAM) y otras células inflamatorias, así como las células vasculares contribuyen a diversos grados a las características de cáncer y cáncer ecosistema [3] [4]. Ellos producen matriz extracelular, factores de crecimiento, citoquinas, proteasas y sus reguladores, y por lo tanto, proporcionan un microambiente apoyar la proliferación de células cancerosas y la inmortalidad, la inducción de angiogénesis, reprogramar el metabolismo energético, evadir la destrucción inmune, y favoreciendo la invasión y la metástasis [5], [1 , 3,6], [4].
En el cáncer de lengua los componentes de TME tiene un papel elemental en los procesos de invasión y metástasis con un impacto directo en los resultados clínicos de los pacientes [7]. Hemos demostrado que la alta frecuencia de los CAF se asocia con un mal pronóstico en pacientes con cáncer de lengua móvil [8], [9]. CAF también se han demostrado para localizar en el sitio de ganglio linfático metastásico de manera similar a los tumores primarios de lengüeta coincidentes que sugieren la facilitación de metástasis [10]. Nuestro estudio reciente perfila la diafonía molecular entre las células del cáncer oral y TME y presentado que el examen de los componentes conocidos pro-tumorigénicos del infiltrado inflamatorio, como las células T reguladoras, TAM2 (es decir TAM subtipo apoyar la invasión y metástasis) las células, y reguladora de las células T que induce células inmunes, reveló impacto negativo para los pacientes similares a los CAF [11].
BMMSCs se ha demostrado que incorporar en el tejido dañado o inflamado, así como a la casa en los tumores y el sitio de metástasis en el que se integran en el TEM y proporcionar una fuente de células, tales como los CAF [12], [ ,,,0],13] [14], [15] ,, [2]. Las citocinas y factores de crecimiento secretados por las células tumorales junto con los factores endocrinos de tejidos inflamatorios que rodean los tumores atraen BMMSCs a estroma del tumor [16]. BMMSCs se han demostrado para promover la invasión y la metástasis en varios tipos de cáncer, como el de mama, colon y cánceres linfáticos [17], [18], [19]. Sin embargo, el impacto y el papel de BMMSCs en TEM y los mecanismos de sus efectos potenciales en diferentes tumores siguen siendo objeto de controversia [20], [21].
Además de los diversos tipos de células, las proteínas de la matriz extracelular (ECM) en TME también pueden actuar como factores cruciales en el sistema de información dinámica que influyen en el resultado del cáncer [22]. La proteína más abundante en TME es colágeno de tipo I que conduce a la tumor de crecimiento, invasión y propagación del cáncer. En particular, la liberación del propéptido aminoterminal del procolágeno tipo I (PINP) indica el fibro-respuesta proliferativa inducida por tumor [22-24]
.
El objetivo de este trabajo fue investigar el efecto de la BMMSCs y células de carcinoma de interacciones sobre la expresión génica OTSCC, la invasión y la evolución clínica de los pacientes OTSCC. Aquí demostramos que BMMSCs inducida por la invasión de células de carcinoma OTSCC
in vitro
parcialmente a través de la señalización de quimioquinas CCL5 desde su inhibición reduce la zona de invasión. En las células OTSCC la expresión de ARNm de colágeno tipo I fue hasta reguladas por señales derivadas de RCS, y el alto nivel de expresión de tipo I inmunorreactiva procolágeno correlacionados con la mortalidad específica por cáncer de los pacientes OTSCC.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
lengua humana células carcinoma de células escamosas HSC-3 (JCRB 0623; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud de Osaka, Osaka, Japón), SAS ( . JCRB 0260; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud de Osaka, Osaka, Japón) y queratinocitos orales displásicas humanos DOK (Colección Europea de cultivos celulares 94122104, Salisbury, se marchita, Reino Unido) se cultivaron en 1: 1 de DMEM /F-12 (Invitrogen) suplementado con 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina, ácido ascórbico /ml 50 g, 250 fungizona ng /ml, 5 mg /ml de insulina (páncreas bovino), 0,4 mg /ml de hidrocortisona (todos de Sigma-Aldrich), y inactivado por calor 10% de suero bovino fetal (FBS). Para zimografía, suero bovino fetal fue sustituida por 0,5% lactoalbúmina (Sigma-Aldrich). BMMSCs derivadas de la médula ósea humana se obtuvieron originalmente de pacientes operados por fractura de cadera o la osteoartritis. El comité de ética del Hospital Universitario de Oulu aprobó el protocolo del estudio (4 Declaraciones /2000,58 /2009 y 21/2011; Investigación Diario 180/2001 y 12/2004) y los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio . Los BMMSCs utilizados en este estudio se recogieron y se cultivaron como se describe anteriormente [25] [26]. Todos los experimentos se llevaron a cabo con células con un número de paso bajo 3 - 4. fibroblastos gingivales humanos (GF) utilizados en este estudio se obtuvieron a partir de biopsias de encía sana como se describió anteriormente [27]. fibroblastos de carcinoma asociada (CaDEC12) [11] derivados de un espécimen de SCC lengua, así como los fibroblastos orales normales (NOF) [28] se cultivaron en los mismos medios de comunicación como los FC [27]. Todas las células se cultivaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 a 37 ° C. En BMMSC o GF co-cultivos con HSC-3, se usan células de SAS o DOK BMMSC o medios de cultivo GF.
invasión Organotípicos ensayo
El ensayo de invasión organotípicos y la cuantificación de la invasión se realizaron como se describe anteriormente [29]. En los ensayos de monocultivos de 2,0 x 10
5 - 4 x 10
5 HSC-3 o SAS células o 2 x 10
5 células fueron cultivadas DOK en la parte superior del disco mioma de 10 - 14 días. En los ensayos de co-cultivo de 0,5 - 1,5 x 10
5 BMMSCs se añadieron junto con las células cancerosas en la parte superior de los discos mioma (OTSCC: BMMSC relación varió de 2: 1 a 5: 1). Los cortes histológicos de discos mioma se tiñeron con anticuerpo monoclonal pancytokeratin (Dako, clonar AE1 /AE3). El promedio del área de invasión o la profundidad de cualquier otro control de las células cultivadas en monocultivo HSC-3, SAS, DOK o se estableció como 100%. Para la inhibición de la invasión, 50 g /ml de anticuerpo monoclonal contra CCL5 humano se añadieron o isotipo de ratón emparejado IgG normal (Jackson Laboratories) a medios de cultivo celular (amp I +;; D Systems, MAB678), CXCL1 (D Systems, MAB275 amp I +) .
Ensayos de proliferación
La cuantificación de la proliferación en el ensayo de invasión organotípicos se realizó a partir de discos mioma triplicados por línea celular usados. Las secciones histológicas de corte de los discos que representan partes internas del disco se inmunotiñeron con el anticuerpo policlonal contra Ki67 (Abcam,#15580). tasa de proliferación celular se determinó como el porcentaje de células que expresan Ki67 entre todas las células por campo microscópico en la capa de células en la parte superior del disco mioma. Las células cancerosas se marcaron primero con solución de células de seguimiento de Vybrant® CM-Dil (Life Technologies) para la discriminación de las células cancerosas BMMSCs. En total, cuatro campos microscópicos fueron contados por sección (12 campos por muestra). Para el ensayo de proliferación de cultivo de células de 2 x 10
4 HSC-3 células fueron cultivadas como monocultivo o como un co-cultivo con 1 x 10
4 BMMSCs o GFs en cuatro cámara de diapositivas (Lab-Tek) por prueba por 24 h. Los portaobjetos se tiñeron con anticuerpo policlonal contra Ki67 y Alexa Fluor® 488 anticuerpo secundario (Molecular Probes) y contratinción con DAPI. 10 campos microscópicos por portaobjetos de cámara se examinaron y la tasa de proliferación de las células se determinó como un porcentaje de las células Ki67-expresión entre todas las células por campo microscópico.
ensayo de Scratch
Un total de 1 x 10
5 HSC-3 células y 1 x 10
5 BMMSCs o FG se co-cultivaron en medio de cultivo completo FCS al 10% en placas de 24 pocillos (Costar) en pocillos por triplicado hasta confluencia después de lo cual una herida se hizo mediante el uso de una punta de pipeta. Los pocillos se lavaron con medio de cultivo celular y las zonas de heridos se fotografiaron inmediatamente después de la herida (0 h) y de nuevo al final del estudio (20 h) cuando las células se tiñeron con cristal violeta. El tamaño del área de la herida y el cierre de la herida se analizaron con ImageJ (versión 1.45s, http://imagej.nih.gov/ij/). El área de la herida completamente curada se establece en un valor 100.
Zymography
Zymography realizaron como se describe anteriormente [29] se utilizó para detectar la expresión de las metaloproteinasas 2 y 9 (MMP-2 y - 9) en el HSC-3, SAS y DOK medios de cultivo celular después de o /n incubación con 100 ng /ml de CCL5 recombinante (rCCL5) (I + amp; D Systems, Nº 278-RN).
Microarray
HSC-3 células fueron cultivadas como monocultivo o en un co-cultivo con células BMMSC (proporción de células 1: 1) en placas de 6 pocillos en dos experimentos separados para 24 h . Siguiente HSC-3 células fueron ordenados a partir de co-cultivos con FACS (FACScan, Becton Dickinson). ARN fue extraído y purificado a partir de las células con el kit Qiagen RNeasy de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se agruparon para microarrays.
En otra serie de ensayo de co-cultivo, el 80% de cultivos confluentes de HSC-3 se cultivaron en HSC-3 los medios de comunicación con un 2% de SFB durante 24 h. Se recogieron los medios de comunicación, se centrifuga, se transfirió a las culturas BMMSC y se incubaron durante 24 h, después de lo cual se recogieron las células. Se extrajo el ARN como se describió anteriormente a partir de tres conjuntos de co-cultivo separadas.
Affymetrix GeneChip Human matrices se utilizaron para el análisis de microarrays. Los procedimientos experimentales para GeneChip se realizaron de acuerdo a la expresión Affymetrix GeneChip Manual análisis técnico. La expresión de datos se analizaron mediante el Sistema Operativo GeneChip de Affymetrix (Affymetrix) y el software dChip [30]. El conjunto de datos también fueron depositados en el GEO (número de acceso GSE44458).
Determinación de los niveles de quimioquinas
Para la medición de la expresión de CCL5 2 x 10
4 HSC-3, SAS y DOK células fueron cultivadas como monocultivo o en co-cultivo con 2 x 10
4 BMMSCs o GFs (proporción de células de 1: 1 a 2: 1) en placas de 24 pocillos (Costar). medios de cultivo celular se recogió 40 h después de la siembra celular y se filtró. La expresión de CCL5 quimiocinas se determinó a partir de medios de cultivo de células por Quantikine CCL5 /RANTES Immunoassay (R & amp; D Systems).
Las muestras del paciente y los datos clínico-
especímenes del archivo de los 105 OTSCC y diez metástasis de ganglios linfáticos (pN1) de los pacientes, tratados quirúrgicamente en el Hospital de la Universidad de Oulu entre los años 1981-2009, fueron recuperados de el hospital de la Universidad de Oulu, Departamento de Patología, Oulu, Finlandia. Además, nueve pacientes firmaron como los ganglios linfáticos libres de tumor (pN0) fueron recuperados de la Chaim Sheba Medical Center, Tel Hashomer, Ramat Gan, Israel. La edad media de los 114 pacientes fue de 64 años (rango 27-87). El tiempo medio de seguimiento fue de 101 meses (rango 18-298 meses) en los pacientes supervivientes (n = 53). La mediana del tiempo de seguimiento de los pacientes del estudio fue de 47 meses (rango 1-298 meses). datos de supervivencia de los pacientes fue adquirido de Estadística de Finlandia y otros datos relevantes a partir de los registros de pacientes (Tabla 1). No hemos podido recuperar los datos de tratamiento de tres de los pacientes y los datos de supervivencia de dos de los pacientes. La recuperación de los datos del paciente fue aprobado por el comité de ética y Autoridad Nacional de Finlandia locales de supervisión para el Bienestar y la Salud.
N
%
edad media al diagnóstico & lt; 55 yrs4035.155-70 yrs3026.3 & gt; 70 yrs4438.6SexMale5649.1Female5850.9Tumour grade14035.126254.431210.5Tumour stage1-26355.33-45144.7Neck ganglios nodesNegative7969.3Positive3530.7Neck dissectionNo1614.0Yes9886.0Adjuvant therapyNo6859.6Radiotherapy3429.8Radio- y chemotherapy97.9Missing data32.6Total114Table 1. Los datos clínicos del paciente.
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La inmunohistoquímica
La inmunotinción se realizó en todas nuestras muestras OTSCC, que han sido seleccionados previamente para ser representativo de la masa tumoral en las piezas resecadas. Después de un método de recuperación de antígeno de alta temperatura con tampón citrato para CCL5 (REAL Target Retrieval Solution, pH 6; Dako, Glostrup, Dinamarca) o Tris /EDTA para PINP (10 mmol /L Tris, 1 mmol /L EDTA, pH 9), secciones se bloquearon por incubación con suero normal de cabra durante 30 min. Los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo policlonal de cabra anti-humano CCL5 (# AF-278-NA, R & amp; D Systems) a una dilución de 1: 100. Para el anticuerpo policlonal de conejo anti-humano PINP [31] portaobjetos se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con el anticuerpo primario PINP en una dilución 1: 5000. Las muestras se incubaron con anticuerpos secundarios específicos para cada especie. Para la detección se utilizó el kit Dako EnVision (Dako) con diaminobencidina (DAB Dako-kit básico) como cromógeno. Counterstaining se realiza en el Dako Autostainer (Dako, Copenhagen, Dinamarca). En los controles negativos de IgG de cada especie respectivos se utilizó en lugar de anticuerpo primario.
evaluación inmunohistoquímica de la expresión de CCL5 PINP y
La expresión de CCL5 PINP y se evaluó mediante inmunohistoquímica. Las muestras fueron analizadas por tres investigadores independientes (K. M., J.H.K., y T. S. o S. S., J.H.K., y T.S .; ganglios linfáticos libres de enfermedad metastásica fueron examinados por D. D. y M.V.). Se eligieron Diversos modelos de clasificación de expresión. Al principio, las muestras se clasifican en función de la diferencia global de la tinción entre las áreas superficiales e invasivos de los tumores se clasificaron (tinción aparece más intensa en las zonas superficiales de la tumor o tinción aparece más intensa en las áreas invasivas del tumor). El porcentaje de células positivas en las células del estroma y del tumor, tanto en las áreas superficiales e invasivos del tumor se puntuó en una escala de cuatro puntos (0 = 0%, 1 = 0 a 25%, 2 = 25 a 50% y 3 = & gt; 50%, titulado ninguna, baja, moderada y alta expresión, en consecuencia). Además, se evaluó la presencia de tinción PINP en los vasos sanguíneos y linfáticos. El estroma subepitelial de la morfología del epitelio también estaba manchada. En los sitios de la mucosa displásicas tanto las células epiteliales y las células del estroma subepiteliales fueron analizados.
ARN de interferencia
Tres comercial de ARN CCR5 corto horquilla (shRNA) oligonucleótidos (Thermo Scientific#VGH5518-98903425, VGH5518-99159618 #,#VGH5518-99294601) y el control no silenciar (Thermo Scientific#RHS4348) se obtuvieron a partir de Thermo Scientific abierto Biosystems GIPZ Lentiviral shRNAmir Biblioteca (Thermo Scientific). Las transducciones de HSC-3 células con vectores virales y de control se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante con puromicina selección (Sigma-Aldrich). La eficiencia de la caída por CCR5-shRNA se determinó mediante análisis de citometría de flujo usando el anticuerpo monoclonal anti-CCR5 (BD Pharmingen,#556903) y isotipo IgG (BD Pharmingen,#555576) como un control. Se obtuvo aproximadamente 70% desmontables de CCR5 en comparación con células de control no silenciar con uno de los oligonucleótidos comerciales (Thermo Scientific#VGH5518-99159618).
El análisis estadístico
Todos los ensayos se repitieron 2 - 4 veces, excepto el ensayo de invasión de células 3D con SAS y DOK que se realiza sólo una vez con discos mioma triplicados por mono- o co-cultivo. Las diferencias en la proliferación celular y la curación de heridas, área de invasión y la profundidad se evaluaron mediante el uso de la prueba t de Student. En todos los experimentos, a
p
-valor de menos de 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Para los análisis estadísticos del material del paciente se utilizó 18 (. IBM Corp) el software SPSS. Se utilizó una prueba de chi-cuadrado para calcular diferencias estadísticamente significativas entre las variables pronósticas y clínico-patológicos. tablas de supervivencia se calcularon de acuerdo con el método de Kaplan-Meier, y se compararon con la prueba de log-rank. Los análisis de supervivencia y recurrencia multivariados se realizaron con el modelo de riesgos proporcionales de Cox utilizando las siguientes covariables: género (masculino o femenino), edad en el momento del diagnóstico (& lt; 55 años, 55-70 años y & gt; 70 años), el estadio tumoral (1-4) y el grado histológico del tumor (bueno = 1, 2 = moderadamente y mal = 3 carcinomas diferenciados en función de la clasificación de cabeza y cuello carcinoma de la Organización Mundial de la Salud (2005), junto con variables de patrones de expresión PINP como se indica. regresión de Cox se realizó utilizando la selección por pasos hacia atrás de las variables, y un
p
valor de 0,05 fue adoptado como el límite para la inclusión de una covariable.
resultados
BMMSCs inducen la invasión de células cáncer de lengua en el [29] que es más fiel a la TME humana que los modelos derivados de tejidos animales anteriores. células de carcinoma de lengua humana in vitro modelo organotípicos
el efecto de BMMSCs en la invasión de células de cáncer de lengua se examinó en el modelo 3D, mioma organotípicos células HSC-3, SAS o displásicas DOK se cultivaron como un monocultivo o en co-cultivo con BMMSCs en la parte superior de los discos del mioma. Después de 10 - 14 días zona de invasión y la profundidad se cuantificaron mediante el análisis de imágenes tomadas de pancytokeratin secciones histológicas teñidas de discos de monocultivo y de co-cultivo. Como se muestra en la Figura 1, BMMSCs indujo un aumento en el área de invasión, y incluso un efecto más clara fue visto en la profundidad de la invasión en HSC-3-BMMSCs co-cultivos (Figura 1A-1B). Un ligero aumento en el área de invasión se observó también con células de SAS en la presencia de BMMSCs, aunque no estadísticamente significativa. Sin embargo, no parecía haber ningún efecto sobre la profundidad de invasión (Figura 1C-1D). Curiosamente, BMMSCs inhibió la invasión de las células displásicas DOK (Figura 1D-1E), sugiriendo un efecto diferente de BMMSCs en células de carcinoma en comparación con células no malignas.
Bone BMMSCs derivadas de la médula mejoran la invasión de HSC-3 células (A, B), pero no las células displásicas (E, F) en 3D modelo mioma organotípicos [29]. aumento de menor importancia, aunque no estadísticamente significativa, fue visto en la zona de invasión de SAS (C, D). Los cortes histológicos obtenidos de discos mioma se tiñeron con anticuerpo monoclonal pancytokeratin (Dako, clonar AE1 /AE3) y se fotografiaron a 100 x aumentos con un microscopio DMRB foto conectado a la cámara DFC 480 utilizando el software QWin V3 (Leica Microsystems). La barra de escala 100 micras.
Para estudiar si el aumento de la invasión de células HSC-3 se debió a un aumento de la proliferación celular, las células HSC-3 y SAS se cultivaron en la parte superior del disco mioma como monocultivo o co -Cultura con BMMSCs o FG. Las secciones histológicas obtenidas a partir de estos discos se inmunotiñeron con el marcador de proliferación Ki67 y las células positivas se calcularon como se describe en Materiales y Métodos. niveles de proliferación celular fueron notablemente inferiores en HSC-3 y SAS co-cultivos con BMMSCs en comparación con los co-cultivos con FG (Figura 2A-2B). Para confirmar que el efecto observado en las secciones histológicas vino de reducida la proliferación de células cancerosas, HSC-3 células fueron cultivadas como una mono- o co-cultivo en portaobjetos de cámara de cultivo de células con BMMSCs marcado con un colorante fluorescente. Después de co-cultivo durante la noche, las células se tiñeron para Ki67. Como se muestra en la Figura 2C, BMMSCs inhibe la proliferación de células HSC-3 significativamente también en el ensayo de células de co-cultivo. La viabilidad de las células HSC permaneció siendo alta y no se detectó señal de apoptosis (datos no presentados).
Los cortes histológicos obtenidos de discos mioma se tiñeron con anticuerpo policlonal anti-Ki67. BMMSCs inhibir la proliferación de células HSC-3 y SAS en el modelo de invasión organotípicos (A, B), así como en ensayos de cultivo celular (C), y cambian HSC-3, pero no las células DOK displásicas hacia un fenotipo migratorio con menos célula-célula contactos (D, puntas de flecha). fibroblastos gingivales normales, GFs, promueven cierre de la herida más de BMMSCs potencialmente debido en parte al aumento en la proliferación celular de las células cancerosas (E). Barra de escala 50 micras.
Como no se aumentó la proliferación, para evaluar si el aumento de la invasión fue una consecuencia de una migración de células de cáncer más alta un ensayo de rayado se lleva a cabo con células HSC-3 y DOK sembrado solo o junto con BMMSCs o GFs a placas de 24 pocillos. BMMSCs cambió HSC-3 células, pero no las células displásicas DOK, hacia un fenotipo migratorio con estructuras lamellipodia y menos contactos célula-célula (Figura 2D). Sin embargo, los FC promovidos cierre de la herida más rápido que BMMSCs, que puede ser en parte debido a los efectos de suero en la capacidad de proliferación de las células cancerosas (Figura 2D-2E) guía
La expresión de CCL5 quimiocinas es hasta reguladas en BMMSCs después interacción con las células cancerosas
BMMSCs fueron cultivadas con medio condicionado obtenido de HSC-3. Aunque varios genes fueron hasta reguladas, el mayor aumento en la expresión génica en BMMSCs se observó en los genes de quimioquinas (Tabla 2). Cuando la expresión de quimioquinas fue examinada en el nivel de proteína se encontró la expresión de CCL5 ser principalmente un resultado de la interacción entre las células HSC-3 y BMMSC en lugar de a partir de los co-cultivos de HSC-3 células y GFs (Figura 3A). Similares resultados se obtuvieron a partir de co-cultivos de SAS y BMMSCs, pero no a partir de células que interactúan con DOK BMMSCs (Figura 3A). A nivel de proteínas, se encontró que la regulación de la mayoría de las quimiocinas que aparecen en la Tabla 2 que se originan en OTSCC líneas celulares de las interacciones con tanto BMMSCs y FG. Algunas quimiocinas, tales como CCL2, CXCL8 y CCL20, fueron también hasta regulados, como resultado de las interacciones entre las células y BMMSCs DOK, como se estudia en inmunoensayos (datos no mostrados).
Génica
Símbolo
doble cambio
quimiocina (motivo CC) ligando 2CCL2830.66chemokine (motivo CC) ligando 5CCL5194.90chemokine (motivo CC) ligando 20CCL20182.23chemokine (CXC motivo) ligando 1CXCL1134.91chemokine (CXC motivo) ligando 2CXCL280.98chemokine (CXC motivo) ligando 3CXCL380 .14chemokine (CXC motivo) ligando 5CXCL573.90chemokine (CXC motivo) ligando 8 (interleuquina 8) CXCL8 (IL-8) 18.06chemokine (motivo CC) ligando 13CXCL1316.86Table 2. hasta reguladas genes de quimioquinas en BMMSCs después de exponer a acondicionado HSC-3 medios de cultivo celular (doble cambio & gt; 2).
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Co-cultivo de células OTSCC con BMMSCs resultados en la alta expresión de CCL5 quimiocinas en las células HSC-3 y SAS, pero no en las células displásicas DOK (UN). Función de bloqueo de anticuerpo monoclonal contra CCL5 (Mab CCL5) inhibe ligeramente BMMSC zona de invasión mejorada, pero no tiene efecto en la profundidad de la invasión, mientras que el anticuerpo contra CXCL1 no aumenta el efecto inhibidor en OTSCC invasión (B, C).
Función de bloqueo de anticuerpos contra CCL5 inhibe BMMSC aumentó zona de invasión
a continuación exploramos la importancia de CCL5 en la propagación del cáncer de lengua, ya que CCL5 se ha demostrado para promover la motilidad de las células de cáncer oral [32]. CCL5 también ha demostrado ser importante en la progresión del tumor de varios tipos de cáncer, como el de mama y carcinoma colorrectal [17,33]. Por lo tanto, hemos probado el efecto del anticuerpo función de bloqueo de CCL5 en OTSCC y BMMSC co-cultivos en el modelo 3D invasión. También probamos el efecto potencial de bloqueo de anticuerpos contra CXCL1 en la invasión función, ya que CXCL1 también se expresa a partir de la interacción BMMSC-HSC-3 y Previamente se ha demostrado que estar presente en cánceres como el de mama, pulmón, colorrectal y de próstata, ya sea de apoyo o la supresión de la progresión del tumor [34-36]. En el cáncer oral CXCL1 se ha sugerido que tiene un papel en la progresión tumoral, ya que en las muestras de pacientes de la expresión de CXCL1 se ha demostrado estar asociado con la infiltración de leucocitos, la metástasis de los ganglios linfáticos, y la angiogénesis [37]. Como se muestra en la Figura 3, la función de bloqueo de CCL5 anticuerpo monoclonal era capaz de atenuar significativamente promovido-BMMSC área de la invasión de células HSC-3, pero no tuvo ningún efecto sobre la profundidad de invasión (Figura 3B-3C). CXCL1 no tenía un efecto sobre la invasión, ya que no aumentó el efecto inhibidor de CCL5 en el modelo de invasión 3D (Figura 3B-3C).
en muestras de pacientes CCL5 se expresa principalmente por células inflamatorias y algunas células de cáncer, pero sólo CAF esparcidos se CCL5 positivo
A continuación, para evaluar la importancia de la expresión CCL5 en muestras de tumores de pacientes para el diagnóstico de cáncer de lengua, secciones histológicas que representan diferentes etapas de las lesiones displásicas y carcinomas de la lengua de los pacientes humanos se tiñeron con anticuerpo anti-CCL5. La expresión de CCL5 se detectó principalmente en células inflamatorias y en algunas células cancerosas (Figura 4A-4B), pero sólo los CAF dispersas eran CCL5 positivo, tal como se evaluó por inmunohistoquímica co-localización de CCL5 y CAF marcador αSMA (datos no mostrados). Sin embargo, la expresión de CCL5 no se asoció con el resultado clínico de los pacientes OTSCC (no mostrado). La expresión de CCL5 se estudió más en fibroblastos primarios orales normales (NOF, [28]) y células CaDEC12 [11]. Inmunoensayo detectar CCL5 secretada en medios de cultivo celular mostró expresión CCL5 muy baja o no en los fibroblastos normales, pero considerable mayor expresión en las células CaDEC12 (Figura 4C).
CCL5 se expresa principalmente por células inflamatorias en TME y algunas células de cáncer en muestras de pacientes como se muestra por inmunotinción con Pab CCL5, pero sólo CAF dispersas son positivos para CCL5 (A, B). células CaDEC12, los cultivos primarios de CAF obtenidos a partir de pacientes con cáncer de lengua, expresan cantidad relativa de CCL5 en comparación con NOF, fibroblastos orales normales (C). La barra de escala 100 micras.
El papel de eje CCL5 /CCR5 no es crítico en BMMSC aumento de la invasión cáncer de lengua
La señalización CCL5 en las células cancerosas se ha propuesto estar mediada principalmente, pero no es necesario exclusivamente, a través del receptor CCR5 [38]. Se muestran tanto las células HSC-3 y SAS para expresar este receptor (Figura 5A). En el co-cultivo más o menos todo CCR5 células de cáncer expresado, sin embargo, en los monocultivos de aproximadamente sólo el 25% de las células de cáncer fueron positivos para CCR5 lo que sugiere que se necesita un contacto con las células del estroma o la inducción CCL5 para una mayor expresión de CCR5 (citometría de flujo análisis, los datos no se muestran ). La asociación de CCL5 y expresión CCR5 se ha propuesto recientemente también por otros [39,40]. A medida que el eje CCL5-CCR5 se ha demostrado que la promoción de la motilidad de las células de cáncer orales humanos
in vitro
[32] y para inducir la expresión de MMP9 [32], que también examinó el efecto de rCCL5 sobre la expresión de MMP9 los niveles en HSC-3 y SAS, así como en las células displásicas DOK. De manera similar a la observación anterior por Chung y colaboradores [32] rCCL5 aumentó claramente la expresión de MMP9 en HSC-3 células y células SAS, pero no en las células displásicas DOK (Figura 5B). Sin embargo, rCCL5 no indujo transición epitelio-mesenquimal (EMT) como se analizó por transferencia Western con anticuerpo anti-vimentina, o la proliferación de células de cáncer (datos no mostrados).
El receptor CCL5 CCR5 se expresa en células SAS HSC-3 y, pero no en BMMSCs (A). rCCL5 puede inducir la expresión de MMP9 en HSC-3 y SAS, pero no en células DOK (B). El silenciamiento de la expresión del receptor CCR5 en HSC-3 células regula a la baja la expresión del gen de 70% en comparación con las células control y bloquea la señalización aumentar la expresión de MMP9 en células de cáncer (C, D). CCR5 desmontables tienen menor o ningún efecto sobre la mejora BMMSC invasión de HSC-3 células en el modelo 3D organotípicos (E, F).
Para explorar la importancia del eje CCL5 /CCR5 en la propagación del cáncer de lengua, se realizó un estudio de la invasión 3D con SAS y HSC-3 OTSCC células con expresión de CCR5 reducida y con anticuerpos contra el bloqueo de la función CCL5. En primer lugar, inhibió la expresión de CCR5 mediante la transducción HSC-3 células con CCR5 shRNA y produjimos una línea celular estable con ~ 70% de inhibición de la expresión de CCR5 y disminución de la respuesta a la inducción rCCL5 (Figura 5C, 5D). En el ensayo de invasión de co-cultivo 3D las células CCR5 desmontables invadieron igual o menor que el de tipo salvaje o controlan HSC-3 células transducidas con no silenciar shRNA (Figura 5E, 5F). Resultados similares también se obtuvieron con un anticuerpo monoclonal contra CCR5 (datos no mostrados).
La expresión de los componentes de colágeno y la plasticidad del epitelio se inducen en las células cancerosas después de la interacción BMMSC
Los posibles mecanismos de la invasión efecto promotor de BMMSCs en las células cancerosas se estudiaron más por el análisis de microarrays. Se utilizaron células HSC-3 para los experimentos, ya que respondieron más claramente a BMMSCs que las células SAS, especialmente en el modelo de invasión 3D.