Extracto
El consumo de cigarrillos es un factor de riesgo para el cáncer de esófago. proteína asociada Sí-1 (YAP1), el factor de transcripción clave de la vía Hippo de mamífero, se ha informado que es un factor oncogénico para muchos tipos de cáncer. En este estudio, nos encontramos con la administración de nicotina puede inducir la translocación nuclear y la activación de YAP1 en CECA. Consistentemente, se observó la translocación nuclear y la activación de YAP1 por desmontables de CHRNA3, que es un regulador negativo de la señalización de la nicotina en bronquial y las células de cáncer de esófago. la administración de nicotina o el agotamiento CHRNA3 aumentaron sustancialmente la proliferación y migración de células de cáncer de esófago. Curiosamente, encontramos que YAP1 interacciona físicamente con los nAChR, y nAChR-señalización disocia YAP1 de su complejo regulador negativo compuesta con α-catenina, β-catenina y 14-3-3 en el citoplasma, lo que conduce a la regulación positiva y la translocación nuclear de YAP1. Este proceso probablemente requiere la activación de PKC, como inhibidor específico de PKC Enzastaurina puede bloquear la nicotina inducida por la activación YAP1. Además, nos encontramos con la señalización de la nicotina también inhibe la interacción de YAP1 con P63, que contribuye al efecto inhibidor de la nicotina sobre la apoptosis. Utilizando el análisis de inmunohistoquímica se observó la regulación positiva de YAP1 en una porción significativa de las muestras de cáncer de esófago. Consistentemente, se ha encontrado una asociación significativa entre YAP1 regulación al alza y el consumo de cigarrillos en las muestras clínicas de cáncer de esófago. En conjunto, estos resultados sugieren que la nicotina nAChR activados vía de señalización que activa más YAP1 juega un papel importante en el desarrollo de cáncer de esófago, y este mecanismo pueden ser de importancia general para la carcinogénesis de los cánceres relacionados con el tabaco.
cita: Y Zhao, Zhou W, Xue L, Zhang W, Zhan Q (2014) a través de la nicotina activa YAP1 señalización mediada por nAChR en el cáncer esofágico de células escamosas (CECA). PLoS ONE 9 (3): e90836. doi: 10.1371 /journal.pone.0090836
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 9 Enero, 2014; Aceptado: 6 Febrero 2014; Publicado: 12 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio ha recibido el apoyo de los fondos del Programa de Investigación fundamental clave Nacional 973 de China (2009CB521801) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81021061). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el consumo de cigarrillos está asociada con un mayor riesgo tanto de carcinoma de células escamosas y adenocarcinoma del esófago [1] - [3]. Recientes hallazgos sugieren la nicotina y sus derivados tales como NNN (N-nitrosonornicotina) y NNK ((4-metilnitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona) pueden dirigir activar los receptores nicotínicos de la acetilcolina (nAChR) para estimular el crecimiento y la angiogénesis y suprimir la apoptosis inducida por fármacos de las células cancerosas [4]. receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) son una familia de canales iónicos puerta de ligando que funcionan como los principales reguladores de la señalización nicotínico y acetilcolinérgico en las células. a-R-nic y β-nAChR son los más comunes nAChR. expresiones desequilibrada de diferentes subtipos de nAChR en las células contribuyen a la patogénesis de enfermedades tales como el cáncer [4]. nAChR también se sabe que regulan la adhesión celular y la migración a través de sus interacciones con RapSyn y herparansulphate proteogly pueden tal como la agrina [5] - [7].
Sobreexpresión y el aumento de la localización nuclear de la vía hipopótamo factor de transcripción YAP1have ha observado en varios tipos de cánceres humanos, incluyendo el cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón y de próstata [8]. Y amplificaciones de YAP1 locus del gen se observan en los ependimomas intracraneales, carcinomas de células escamosas orales y meduloblastomas [8]. YAP1 se informó de que el gen del cáncer de conducción en el carcinoma hepatocelular humano (CHC) y el cáncer de mama 11q22 amplicones [9], [10]. Por otra parte, YAP1 se determinó que era un marcador pronóstico independiente para la supervivencia global del carcinoma hepatocelular y carcinoma de células escamosas de esófago [11], [12].
Dasgupta et al. la nicotina puede inducir reportado hasta la regulación de XIAP y survivina (BIRC5) en células no pequeñas de cáncer de pulmón para inhibir la apoptosis inducida por fármacos quimioterapéuticos [13]. Y la nicotina se sabe que inducen la expresión de CTGF (factor de crecimiento de tejido conjuntivo) en los fibroblastos gingivales y en las células del ligamento periodontal que contribuye a la patogénesis de la fibrosis periodontal [14]. Cabe destacar que la survivina y CTGF son dos de los genes aguas abajo conservadas reguladas por factor de transcripción YAP1 de la vía Hippo [8], [15]. Recientemente, Yu et al. la regulación informado de la vía de Hippo-YAP por la señalización de receptores acoplados a la proteína G [15]. Y no se reportaron β2-nAChR que se asocia físicamente con la proteína G, ag inductor regulada por proteína de neuritas a cabo el crecimiento 1 y G canal 1 de proteína activada por K (+), lo que indica una posible relación entre los nAChR señalización y celulares vías de proteína G [ ,,,0],dieciséis]. Por otra parte, se informó YAP1 ser upregulated en los cánceres de esófago y se determina como un oncogén en el cáncer de esófago [11], [17]. Por lo tanto hemos tratado de explorar la posible relación entre la exposición a la nicotina y la activación YAP1 en el cáncer de esófago en este estudio.
Métodos
muestras de tejido
Nuestros muestras de tejido CECA de 83 pacientes con se recogieron etapa T3 patológico carcinoma de células escamosas de esófago. Los pacientes fueron reclutados consecutivamente en la Academia China de Ciencias Médica Hospital del Cáncer (Pekín, China). Al momento del reclutamiento, se obtuvo el consentimiento de cada sujeto. Las autorizaciones se en forma escrita, a cada paciente se le informó a firmar el consentimiento para el uso de sus muestras de tejidos obtenidos de la cirugía para la investigación en ciencias antes de que se tomaron las muestras. Hemos conservado la tabla consentimiento en nuestra base de datos médicos, y el comité de ética /IRB del Instituto del Cáncer de la Academia China de Ciencias Médicas aprobó el procedimiento de consentimiento y el estudio.
Cultivo de células y transfección y la administración del fármaco
líneas celulares CECA humano se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en 5% de CO2 y humedad saturada. líneas celulares de cáncer de esófago KYSE510, KYSE30 fueron proporcionados generosamente por el Dr. Yutaka Shimada (Universidad de Kyoto). Para las transfecciones transitorias de plásmido y siRNA, las células se cultivaron en placas de 60 mm en 50 a 90% de confluencia y se transfectaron con 200 mol de p siRNA usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Tres sigilo siRNAs dirigidos a CHRNA3 fueron diseñados y ordenados de Invitrogen, TureClone plásmido de tGFP-CHRNA3 se adquirió de OriGene. Las células fueron transfectadas con el plásmido tGFP-CHRNA3 o CHRNA3 siRNA usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. medio fresco se añadió 6 horas después de la transfección. Para la administración de nicotina, se incubaron las células en medio que contenía 80 nM de nicotina durante 48 horas o más. Para la administración Enzastaurina, Enzastaruin se añadió al medio a una concentración de 500 mM durante 48 horas.
Curva
Crecimiento Celular
curva
El crecimiento medido por xCELLigence RTCA MP-E placa de 96 pocillos, 3 × se añadieron 10
3 células a cada pocillo de acuerdo con el protocolo del Sistema de xCELLigence, la tasa de crecimiento celular se controló durante 81 h. Para las curvas de crecimiento de células leído por el ensayo de MTT, 100 l de cultivo celular que contiene 3 × 10
se añadieron 3 células de 30 pocillos de una placa de 96 pocillos. se añadieron 20 l de reactivo methanethiosulfonate (Promega) para 6 pocillos cada vez en 24 intervalo h durante 5 días, seguido de 1 h de incubación a 37 ° C y 5% de CO
2, la absorbancia se leyó a 490 nm con un lector de microplacas.
transwell migración y la invasión ensayos
Migración y ensayos de invasión se llevaron a cabo con 80 micras de Corning de 24 pocillos transwell placa recubierta con un 30% de Matrigel (300 l /pocillo, Falcon) . En total, 1 × 10
se añadieron 5 células en 100 l de medio libre de suero a la cámara superior del dispositivo, y la cámara inferior se llenó con 600 l de medio de cultivo con suero bovino fetal 20%. Después de 6 horas de incubación a 37 ° C, las células no migran se retiran de la superficie superior de la membrana con un hisopo de algodón. Los filtros fueron fijadas en metanol durante 10 min, se tiñeron con solución de Giemsa durante 1 hora, y se contaron. Cinco campos microscópicos al azar (× 100) se contaron por pocillo, y se determinó la media.
Los anticuerpos y reactivos especiales
YAP1 anticuerpo de conejo, anticuerpo CHRNA3 se adquirieron de Proteintech Gourp (Chicago, IL 60612, EE.UU.), YAP ratón (63.7), el anticuerpo GAPDH se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas 75220U.SA), YAP fosfo-(anticuerpo de anticuerpos y β-catenina Ser127), anticuerpo β-actina se adquirieron de Cell Signaling tecnología (Danvers, MA 01923), anticuerpo CHRNB4, anticuerpos y CHRNA5 14-3-3 anticuerpos fueron adquiridos de Abgent. anticuerpo tGFP, el anticuerpo P63, tGFP marcado CHRNA3 Tureclonevector se adquirieron de OriGene (Beijing, CHINA 101111), anticuerpo α-catenina se adquirió de Lifetechnologies (Carlsbad, CA 92008). GST recombinante marcado proteína YAP1 se adquirió de Abnova (Ciudad de Taipei Taiwan114). inhibidor de PKC Enzastaurina se adquirió de Selleck Químicos (Múnich, Alemania 81829). La nicotina se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO 63103).
inmunofluorescencia ensayo
KYSE510 Las células fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio en una placa de 6 pocillos durante 24-48 horas, las células se fijaron con metanol durante 10 min a temperatura ambiente y se lavó con PBS. Después de la incubación con el anticuerpo asociado durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron y se incu1'bated con cabra conjugado con FITC IgG anti-conejo. Después de ser lavado con PBS, las células se tiñeron con DAPI y se examinan con un microscopio de escaneo láser confocal (Leica Microsystems Heiderg GmbH, Am Friedensplatz 3, Alemania).
Quantitative PCR en tiempo real
Total ARN a partir de células KYSE510 se extrajo con TRIzol (Life Technologies (Carlsbad, CA 92008)). Primera línea de cDNA se sintetizó usando el kit de transcriptasa inversa Superscript II-(Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real (qPCR) se llevó a cabo utilizando SYBR Premezcla Ex Taq (Takara) en una PCR System 7300 en tiempo real ABI (Applied Biosystems). Todas las muestras se normalizaron a GAPDH
Las PCR pares de cebadores específicos de genes utilizados en este estudio:.
YAP1 (GGCGCTCTTCAACGCCGTCATGAAC /CCTGTCGGGAGTGGGATTT);
CTGF (CCAATGACAACGCCTCCTG /TGGTGCAGCCAGAAAGCTC) ;
Cyr61 (AGCCTCGCATCCTATACAACC /TTCTTTCACAAGGCGGCACTC);
EDN1 (TGTGTCTACTTCTGCCACCT /CCCTGAGTTCTTTTCCTGCTT);
PPP1ReB (GGACACGTTCTCCTTCGAC /AGATTTTAACTCAGCCCGGAT);
survivina (CCTGGCTCCTCTACTGTT /CTCTATTCTGTCTCCTCATCC);
GAPDH (GCTGAGAACGGGAAGCTTGT /GCCAGGGGTGCTAAGCAGTT)
transferencia Western, inmunoprecipitación, ensayos y GST
Western blot pull-down se realizó como sigue. Las células se recogieron y se centrifugaron para cosechar. Las células fueron lysedon hielo durante 40 min en tampón RIPA (10 mMTris, pH 7.4, 150 mMNaCl, 1% de Triton X-100, desoxicolato de sodio 0,1%, 0,1% de SDS y EDTA 5 mM) que contiene completa de mezcla de inhibidor de proteasa (Sigma). Los lisados fueron aclarados por centrifugación a 12,000relative fuerza centrífuga durante 20 minutos a 4 ° C. Para la transferencia Western, 40 g de proteína total se suspendió en tampón de muestra. Para la inmunoprecipitación, los lisados se incubaron con primaryantibody seguido de incubación con perlas de agarosa de proteína A-(Invitrogen). Los complejos inmunes se lavaron y tampón de muestra suspendedin. En desplegable ensayo GST, perlas de glutatión (Sigma) se incubaron con expresado-coli Escherichia GST-YAP1or GST sola durante 4 horas. entonces Glutathionebeads se lavaron y se incubaron durante 4 horas con lisados de células KYSE510. Después del lavado, los complejos de proteína se suspendieron en tampón de muestra. Toda la proteína se cargó en cada wellof un SDS-PAGE al 15%. Los geles se transfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad), se bloquearon con 5% de leche /PBS, y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios. Después del lavado y la incubación con anticuerpos secundarios en 5% de leche, la membrana se lavó, y las señales positivas se desarrollaron con el reactivo de quimioluminiscencia (Amersham). La membrana se expuso a una película de rayos X médicos (Fuji Ltd., Tokio, Japón).
El análisis de citometría de flujo
Las células vitales, apoptóticas y dañadas fueron separados por citometría de flujo. La determinación cuantitativa del porcentaje de células en proceso de apoptosis se realizó utilizando un kit de anexina V-FITC de detección de apoptosis (Cliniscience S.A.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, 48 horas después del tratamiento con nicotina, 2 × 10
5 células se marcaron con fluorescencia para la detección de células apoptóticas y necróticas mediante la adición de 195 l de tampón de unión de anexina V y 5 l de anexina V-FITC a cada muestra. Las muestras se mezclaron suavemente y se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 3 min, 10 l de yoduro de propidio; se añadió a cada muestra y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min (PI Sigma). Antes del análisis de citometría, la suspensión de células se complementó con 300 l de tampón de unión a anexina V. Un mínimo de 10.000 células dentro de la región acotada fueron adquiridos y analizados con el software Cell Quest.
tinción inmunohistoquímica y la evaluación
Todos los tejidos se fijaron en formaldehído al 4% neutralizado, incluidos en parafina. Los bloques de tejido del donante incluido en parafina fueron muestreados utilizando un Manual de Tejido Arrayer 1 Instrumento (Beecher Instruments, Silver Spring, MA, EE.UU.). Dos núcleos fueron cortadas de cada bloque de donantes para los bloques de TMA. Secciones (5 mM) del bloque de matriz de tejido se cortaron y se colocaron en portaobjetos de vidrio recubiertos con polilisina y se procesaron para IHC. A partir de las muestras disponibles, se prepararon siete bloques de la matriz de tejido, cada uno con 30 casos con tumores, tejidos normales y de ganglios linfáticos si están disponibles. Las diapositivas de microarrays de tejidos fueron deparaffinized en xileno y etanol en gradiente. La recuperación del antígeno se llevó a cabo mediante la colocación de los portaobjetos en una olla de alta presión en un tampón de citrato 0,01 mM, pH 6,0, durante 2,5 min a 100 ° C; se enfriaron luego por 20 min. actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de la sección en 3% H
2O
2 durante 10 min, seguido de lavado en solución de PBS tres veces. Las secciones se incubaron con anticuerpo de conejo anti-YAP1 (Proteintech) a una dilución de 1:50 a 4 ° C durante la noche, los portaobjetos se incubaron a continuación durante 1 h en anticuerpo secundario. Un kit EnVision (Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.) se utiliza para visualizar la unión de anticuerpos, y las diapositivas fueron posteriormente counterstained con hematoxilina. Un PBS-única muestra la tinción se utilizó como un control de fondo. Las diapositivas de la matriz de tejido fueron escaneados y analizados con AperioScanScope CS. Sobre la base de la intensidad de inmunotinción, los tejidos del esófago se dividieron en cuatro categorías como YAP1 negativo (-), débil positividad de YAP1 (+), la positividad mediana de YAP1 (+ +), fuerte positividad de YAP1 (+ + +). Todos los experimentos se llevaron a cabo y se repitieron al menos tres veces. Los datos fueron analizados con el programa SPSS 11.5software. Las correlaciones entre los subgrupos de tinción y el tabaquismo se calcularon mediante la prueba de la χ2 de Pearson.
Resultados
La nicotina estimula el crecimiento y la migración de cáncer de esófago
La nicotina es conocido por ser un importante factor de riesgo para el cáncer de esófago. Los informes anteriores demuestran que la nicotina promueve el crecimiento celular y la migración de diferentes tipos de cánceres humanos [4], [18]. Por lo tanto primero a prueba los efectos estimulantes del crecimiento de la nicotina en la línea celular de cáncer de esófago con KYSE510 xCELLigence RTCA MP-E placa de 96 pocillos y se observó que la administración de nicotina ha mejorado sustancialmente la tasa de crecimiento de las células KYSE510 (Figura 1 A). Adicionalmente, se realizó transwell ensayo para estudiar los efectos de la nicotina sobre la migración de células KYSE510 y también se observó un aumento significativo de la migración de la célula KYSE510 tratados con nicotina (Figura 1 B).
A. la administración de nicotina estimula el crecimiento de las células del esófago del cáncer KYSE510 medido por el sistema E-Plateofx CELLigence RTCA MP. administración B. La nicotina aumenta la invasión y migración de células KYSE30 cáncer de esófago en transwell ensayos. C. La localización subcelular de YAP1 examinó con microscopio de fluorescencia confocal. se observó la translocación de YAP1 (verde) desde el citoplasma al núcleo después de la administración de nicotina en KYSE510 células durante 48 h. células D. KYSE510 fueron tratados con nicotina durante 48 hs, disminución de la fosforilación de YAP1 y aumentó YAP1 desfosforilado se observó por análisis de transferencia Western. E. en tiempo real la verificación por PCR de la inducción de ARNm de genes transcripcionalmente activa por YAP1 tras la administración de nicotina. F. PKC inhibidor Enzastaurina bloqueado upregualtion inducida por la nicotina del nivel de proteína YAP1, y dio lugar a la reducción del nivel de proteína YAP, en particular la forma de desfosforilado YAP1 por Western blot.
La nicotina induce YAP1 translocación nuclear y la activación
Reglamento
arriba y el aumento de la localización nuclear de Hipona la vía del factor de transcripción YAP1 se informó de que el marcador independiente de peor supervivencia del cáncer de esófago [11]. Para evaluar si la exposición a la nicotina sería resultó en la activación de YAP1. Investigamos la localización subcelular de YAP1 en cáncer de esófago de células KYSE510 usando microscopio de inmunofluorescencia confocal después de la exposición a la nicotina. Después las células se cultivaron en los medios que contienen nicotina a la concentración de 80 nM durante 48 horas, se observó un aumento en la translocación nuclear de YAP1, tal como se manifiesta por la acumulación YAP1 en el núcleo después de las células tratadas por la nicotina (Figura 1 C). Dado que la translocación nuclear y la activación de YAP1 está regulada por la fosforilación de YAP1 en S127 sitio [8], se midieron entonces los cambios de nivel de fosforilación de YAP1 antes y después del tratamiento de nicotina. Como se muestra en la Figura 1 D, disminución de la fosforilación de YAP1 y se observaron una mayor nivel de proteína de YAP1 desfosforilado después de la administración de nicotina. Además, examinó la expresión del ARNm de CTGF, un YAP1 dirigida de genes aguas abajo, y encontró que los niveles de ARNm de CTGF fue elevado por la administración de nicotina. Sin embargo no se observó la regulación al alza significativa de YAP1 ARNm después de la administración de nicotina (Figura 1 E). Estos resultados sugieren que después de la administración de nicotina, YAP1 sufre translocación nuclear y a su vez activa transcripcionalmente sus genes aguas abajo incluyendo CTGF.
PKC ha sido informado de que se requiere para la activación de nAChR por formación de un bucle de retroalimentación auto-positivo para la activación de los receptores nicotínicos de la acetilcolina [19], [20]. También se ha identificado como un YAP1 quinasa [21]. De este modo se trataron las células con PKC inhibidor específico Enzastaurina para ver si la activación YAP1 puede ser bloqueada por la inhibición de PKC. Hemos observado que el tratamiento Enzastaurina bloqueado sustancialmente la activación inducida por la nicotina YAP1 como se indica por una disminución dramática de nivel de proteína total de YAP1, en particular la YAP1 desfosforilado (figura 1 F). Este resultado sugiere que la activación de YAP1 inducida por la nicotina está mediada por PKC.
Desmontables de CHRNA3 también indujo la activación YAP1
Se ha demostrado que CHRNA5 (neuronal subunidad del receptor de acetilcolina alfa-5) y CHRNA3 (alfa-3 de la subunidad del receptor de acetilcolina neuronal) como reguladores negativos de la señalización de la nicotina en el cáncer bronquial y las células de cáncer de esófago [22]. Debido desmontables de CHRNA3 y CHRNA5 aumentó la proliferación, la migración y calcio afluencia de líneas celulares de cáncer de pulmón, como resultado de aumento compensatorio de montaje de α7-nAChR en la membrana citoplasmática, que tenía una mayor permeabilidad al calcio en respuesta a la nicotina. Por lo tanto hemos empleado enfoques siRNA a desmontables CHRNA3 en la celda KSYE-510 y, a continuación examinamos los efectos del agotamiento CHRNA3 en el crecimiento y la migración de células KYSE510, y en la activación de YAP1 también. Se observó un aumento de la tasa de crecimiento y la migración en las células KYSE510 por caída CHRNA3, que es similar a la observada en la administración de nicotina (Figura 2 A, Figura 2 B). Consistentemente, una disminución de la fosforilación YAP1, en particular en el lugar de S127 de YAP1 se demostró por Western Blot (Figura 2 C). Con el microscopio confocal de inmunofluorescencia se observó también la translocación nuclear de YAP1 en las células KYSE510 siguientes CHRNA3 desmontables (Figura 2 D). Además, la inducción transcripcional de CTGF y otros genes aguas abajo YAP1 también se observaron en las células silenciadas para CHRNA3 (Figura 2 E).
A. curva de crecimiento de la célula se mide con el ensayo MTT indicó siRNA mediada desmontables de CHRNA3 aumentó la tasa de crecimiento de las células KYSE510. B. ensayo Transwell indicó que desmontables de CHRNA3 aumentó la invasión y migración de las células KYSE30. C. Análisis de transferencia Western indicó 3 de la cautela siRNA construcciones de manera efectiva derribado CHRNA3. El agotamiento de CHRNA3 condujo a una disminución de YAP1 fosforilado y un aumento de YAP1 desfosforilado, particularmente una disminución de la fosforilación S127 de YAP1. D. Observación de YAP1 localización subcelular con microscopía de fluorescencia confocal tras el agotamiento de CHRNA3. se observó la translocación de YAP1 (verde) desde el citoplasma al núcleo después de siRNA mediada desmontables de CHRNA3 en KYSE510 células durante 48 h. E. En tiempo real prueba de PCR indicaron determinados genes YAP1 fueron inducidos por la caída en la celda CHRNA3 KYSE510.
interacciones físicas entre nAChR y YAP1
Para explorar más a fondo el papel regulador del nAChR con YAP1, se realizaron experimentos de inmunoprecipitación para investigar si nAChR interactuar físicamente con YAP1. Como se muestra en la Figura 3 A, se identificaron las claras interacciones entre YAP1 y CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4. La interacción entre YAP1 y CHRNA3 se verificó con exógenamente transfectadas marcado con tGFP CHRNA3 en KYSE510 células (Figura 3 B). Adicionalmente, se realizó GST pull down de ensayo para verificar aún más la interacción entre YAP1 y CHRNA3 con forma exógena expresada marcado con GST YAP1 (Abnova). GST-tirar hacia abajo experimento también demostró con la interacción positiva entre CHRNA3 endógena y GST-YAP1 (Figura 3 C). A continuación, se utilizó el microscopio confocal de inmunofluorescencia para examinar la colocalización entre CHRNA3 y YAP1. Se encontró que tanto CHRNA3 y YAP1 se colocalized en la región de la membrana y en el citoplasma de las células KYSE510 (Figura 3 D). En conjunto, estas observaciones sugieren nAChR asocian físicamente con YAP1 en células de cáncer de esófago. 14-3-3 es la pareja de unión de YAP1 en el citoplasma, también se observó una interacción positiva entre 14-3-3 y CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 con ensayo de inmunoprecipitación de células KYSE510 (Figura 3 E).
A. prueba de IP endógena mostró interacciones proteína positivos entre YAP1 y CHRNA3 /CHRNB4 /CHRNA5 en KYSE510 células. B. La interacción positiva entre tGFP-CHRNA3 y YAP1 se detectó en las células transfectadas con tGFP-CHRNA3. C. GST pull ensayo mostraron que la interacción positiva de forma exógena expresó GST-YAP1 con CHRNA3 en la celda KYSE510. D. La microscopía confocal de inmunofluorescencia observó colocalización de YAP1 y CHRNA3 en la celda KYSE510. Las células KYSE510 se expresaron transitoriamente tGFP etiquetado CHRNA3 de TureClone vector (OriGene). YAP1 se marcó con conjugado de cabra anti IgG de conejo-FITC roja. Los núcleos celulares se visualizaron con DAPI. E. endógena IP detecta interacciones positivas entre 14-3-3 y CHRNA3 /CHRNB4 /CHRNA5.
La disociación de los reguladores negativos de YAP1 por tratamiento
La actividad transcripcional y la proteína de la nicotina nivel de YAP1 se sabe que está regulada negativamente por 14-3-3, α-catenina y β-catenina [8], [23], [24]. Fosforilada YAP1 puede unirse con p63, y dicha asociación aumenta la estabilidad de p63 y contribuye a p63 mediada por apoptosis inducida por fármacos [21]. Por lo tanto hemos tratado de examinar el efecto de la nicotina sobre las interacciones de YAP1 con α-catenina, β-catenina, 14-3-3, y p63. Como se muestra en la Figura 4, las interacciones de YAP1 con α-catenina, β-catenina, 14-3-3, y p63 fueron interrumpidas por la administración de nicotina (Figura 4 A), que está de acuerdo con nuestras observaciones de que el tratamiento de nicotina aumentó nuclear translocación y activación de YAP1. Disminución de la interacción de YAP1 con 14-3-3, α-catenina, β-catenina se traduciría en un aumento del nivel de proteína total de YAP1. Consistentemente, hemos observado un aumento significativo del nivel de proteína YAP1 tras el tratamiento prolongado de nicotina (Figura 4 B). Como p63 es un regulador importante de la apoptosis, y la interacción alterada entre YAP1 y p63 puedan menoscabar las respuestas de apoptosis mediadas por p63. Consistentemente, se observó disminución de la apoptosis de las células tratadas con KYSE510 nicotina (Figura 5).
B. KYSE510 células expuestas a la nicotina durante más de 4 días llevaron a la regulación positiva del nivel de proteína total de YAP1, incluyendo tanto la YAP1 fosforilada y YAP1 desfosforilado indicado por Western blot.
tratamiento de nicotina disminuye el padre de la apoptosis las células en el cuadrante inferior derecho.
el análisis inmunohistoquímico de YAP1 en muestras clínicas
Se ha demostrado que los pacientes con cáncer de esófago con la regulación positiva de YAP1 tenían una peor supervivencia global que los que tienen la normalidad expresión de YAP1 [11]. Por lo tanto utilizamos clínicos muestras de cáncer de esófago para examinar la correlación entre la expresión regulada por incremento de YAP1 y fumar cigarrillos. Hemos recogido las muestras de cáncer de esófago de 83 pacientes en estadio T3, incluyendo 29 no fumadores y 54 fumadores. Hemos llevado a cabo experimentos de inmunohistoquímica para analizar el nivel de expresión de YAP1 en las muestras de cáncer de esófago, y se encontró que los pacientes con cáncer con antecedentes de tabaquismo mostraron alta expresión de YAP1 en comparación con los pacientes no fumadores (
P Hotel & lt; 0,05) (Figura 6 y Tabla 1). Por lo tanto, estos hallazgos ir junto con nuestras observaciones de que YAP1 fue activado por la administración de nicotina in vitro. Sin embargo, no se observó una diferencia significativa en las supervivencias globales entre YAP1-altos y bajos YAP1-grupos, probablemente debido a estas muestras de cáncer eran de estadio T3 esofágicas cánceres pacientes.
Las diapositivas fueron escaneados por el AperioScanScope CS. Las muestras de tejido fueron divididos en 4 categorías en función de la intensidad de la tinción YAP1.
Discusión
La nicotina es un factor oncogénico establecido que contribuye a la patogénesis de numerosos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de esófago cáncer [3], [4]. Y la nicotina es conocido por promover la proliferación de células de cáncer a través de la activación de la señalización de catecolaminas cascada [4], [25], [26]. Constantemente se observó un aumento de la tasa de crecimiento de células de cáncer de esófago por el tratamiento de nicotina o por medio de desmontables de CHRNA3. Varios grupos han informado de que la exposición a la nicotina y el tabaquismo pueden promover la adquisición de las células madre tumorales y como transición epitelio-mesénquima en el cáncer oral, carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas, cáncer de pulmón y cáncer de mama [27] - [30]. Curiosamente, Nallet-Staubet al. han demostrado que YAP1 y TAZ contribuyen a la capacidad invasiva y metastásica de células de melanoma [31]. Y Chen et al. informaron YAP1 como un importante mediador de la vía oncogénica TLR4 /NANOG en el mantenimiento de la población de células madre como iniciadoras del tumor (TIC) por la supresión de la señalización de TGF-β citostático en HCC [32]. Estas observaciones están de acuerdo con la observación inicial que se requiere YAP1 homólogo TAZ para el sostenimiento de las capacidades de auto-renovación y el tumor a la iniciación en las células madre del cáncer de mama [33]. En este estudio, hemos demostrado que la administración de nicotina o CHRNA3 plomo agotamiento a un aumento del crecimiento celular y la migración, e inducir resistencia a la apoptosis en células de cáncer de esófago.
G receptores acoplados a proteínas (GPCRs) pueden activar o inhibir la vía de Hippo-YAP en función de las proteínas G acopladas. Y se informó de ácido lisofosfatídico (LPA) y la esfingosina-1-fosfato (S1P) para ser los agonistas de aguas arriba en esta vía de señalización para activar YAP1 /TAZ a través de la regulación de la actividad quinasa Lats mediante la modulación de la dinámica de la actina del citoesqueleto [15]. GPCRs pueden activar calcio cascada de señalización a través de PLC /IP3R /PKC vía [34]. Y la señalización de calcio es conocido para regular la dinámica de actina y la motilidad celular a través de la modulación de las vías de señalización corriente abajo Rho GTPasa [34], [35]. Por lo tanto la nicotina puede activar a través YAP1 nAChR mediadas por la entrada de calcio. Curiosamente, se observó PKC inhibidor específico Enzastaurina fue capaz de bloquear la activación de YAP1 por la administración de nicotina, que es consistente con el papel de PKC en la potenciación de los canales de calcio para aumentar la afluencia de calcio [36].
En este estudio, se determinó las interacciones entre los nAChR y YAP1, lo que indica la señalización mediada por nAChR pueden tener un efecto directo sobre la activación YAP1, que está respaldada por las observaciones de que CHRNA3 co-localiza con YAP1. Por otra parte, se observó alterado asociaciones físicas entre YAP1 y α-catenina /β-catenina /14-3-3 sobre la activación de YAP1 por la administración de nicotina en las células del cáncer de esófago. Previamente se ha informado de α-catenina y β-catenina interactuar físicamente con YAP1 para regulada negativamente la actividad YAP1 y su degradación [23], [24]. La asociación entre YAP1 y α-catenina está mediada por 14-3-3 y que IQGAP1 es una de las parejas de unión de alta confianza de YAP1 [23]. Curiosamente, 14-3-3 interactúa con nAChR y amarres nAChR en dominios específicos de membrana a través de una interacción con un complejo de múltiples subunidades, que comprende APC, EB1, IQGAP1 y MACF, que están anclados a los microtúbulos del citoesqueleto [37]. 14-3-3 también promueve el transporte hacia adelante de los complejos de N-cadherina /ß-catenina de la sala de emergencia [38]. Además, β-catenina interactúa con RapSyn para regular la agrupación de nAChR en células de músculo [39]. En este estudio, se observó una interacción positiva entre 14-3-3 y CHRNA3 /CHRNA5 /CHRNB4 en la celda KYSE510. Estos hallazgos sugieren nAChR, 14-3-3, IQGAP1, α-catenina y la β-catenina puede formar un citoesqueleto anclado compleja regulación negativa con YAP1, y 14-3-3 sirve como el adaptador de unión común del complejo. Este complejo regula negativamente la activación YAP1 y la translocación nuclear y YAP1 de sujeción al citoesqueleto en el citoplasma.