Extracto
18β-glicirretínico ácido (18β-GA) es un componente bioactivo de regaliz. La actividad anti-cáncer de 18β-GA ha sido estudiado en muchos tipos de cáncer, mientras que sus efectos en el cáncer de pulmón siguen siendo en gran medida desconocido. primero Demostramos que 18β-GA suprime eficazmente la proliferación celular y la expresión inhibida, así como actividad de tromboxano sintasa (txas) en el cáncer de pulmón de células no pequeñas células (NSCLC) A549 y NCI-H460. Además, la administración de 18β-GA que no tenía ningún efecto inhibidor adicional sobre la disminución de la proliferación celular inducida por la transfección con txas pequeños ARN de interferencia (siRNA). Por otra parte, 18β-GA no pudo inhibir la proliferación celular en las células epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas 16HBE-T y otra línea celular de NSCLC NCI-H23, ambos de los cuales expresa nivel mínimo de txas en comparación con A549 y NCI-H460. Sin embargo, 18β-GA abolió el aumento de la proliferación celular inducida por transfección de NCI-H23 con pCMV6-txas plásmido. Además estudio encontró que la activación de tanto regulada por señal extracelular quinasa (ERK) media y elemento de respuesta a la adenosina monofosfato cíclico proteína (CREB) inducida por txas cDNA transfección de unión podría ser totalmente bloqueados por 18β-GA. En total, se han delineado que, a través de la inhibición de txas y su señalización de ERK iniciado /CREB, 18β-GA suprime la proliferación de células NSCLC. Nuestro estudio ha puesto de relieve la importancia de 18β-GA con respecto a la prevención y el tratamiento del NSCLC
Visto:. Huang R-Y, Chu Y-L, Huang Q-C, Chen X-M, Jiang Z-B, Zhang X, et al. Proliferación Celular (2014) 18β-glicirretínico ácido Suprime través de la inhibición de la tromboxano sintasa en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 9 (4): e93690. doi: 10.1371 /journal.pone.0093690
Editor: Daotai Nie, Escuela de Medicina de la Universidad del Sur de Illinois, Estados Unidos de América
Recibido: 3 de diciembre de 2013; Aceptado: 9 Marzo 2014; Publicado: April 2, 2014
Derechos de Autor © 2014 Huang et al. . Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Conceder una ayuda Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de china (Nº 81302799), china Fundación postdoctoral Ciencia (núm 2013M531838) y 2012 Fundación Excelente joven Científico de la Universidad de Guangzhou de Medicina china (Nº KAB111133K08). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las hierbas usadas en la medicina tradicional proporciona un rico yacimiento de extracción de compuestos biológicamente activos. Por ejemplo, el regaliz se ha utilizado frecuentemente en la medicina Oriental para miles de años, y su principal ácido glicirrícico componente bioactivo posee diversas actividades biológicas, farmacológicas y medicinales, que son similares a los de los retinoides y esteroides [1]. ácido glicirrícico se hidroliza fácilmente a 18β-GA en el cuerpo humano, ejerciendo de este modo sus anti-inflamatorios, anti-virus e incluso anti-cáncer de efectos [2] - [4]. Aunque potencial quimiopreventivo de 18β-GA se ha documentado en muchos tipos de células de cáncer, como el carcinoma humano epitelial de ovario, cáncer de mama y de glioblastoma [5] - [7], se sabe poco sobre los efectos de 18β-GA en el crecimiento del tumor de pulmón .
el cáncer de pulmón es el crecimiento descontrolado de células anormales en los tejidos del pulmón. Más de 1,5 millones de muertes en el mundo son por cáncer de pulmón, que superan a los de cualquier otro neoplasias [6]. Entre los muchos subtipos, CPNM representa el 80% de todos los casos de cáncer de pulmón [8]. Hasta hace poco no existían estrategias terapéuticas satisfactorias para la gestión de NSCLC. Txas se ha observado que es sobreexpresado en muestras de NSCLC, en comparación con tejidos pulmonares normales [9] - [11]. En los tejidos de cáncer, txas está situado aguas abajo de las ciclooxigenasas (COX) -2, y se puede sintetizar tromboxano -A2 (Tx) de la prostaglandina (PG) -H2, que es convertida por las COXs a partir de ácido araquidónico (AA) [12]. La vida media biológica de TxA2 es de aproximadamente 30 s en modelos in vitro, por lo TxA2 es rápida y no degrada enzimáticamente en una forma inactiva de TxB2 en solución acuosa [12], [13]. Por lo tanto, actúa como un TxA2 paracrina /autocrina hormona con efectos potentes de la agregación plaquetaria, la vasoconstricción, proliferación de células tumorales y la invasión [12], [14]. Los efectos de TxA2 están mediadas mediante la interacción con su receptor específico, receptor de tromboxano (TP), que es un miembro de la familia de receptores de la superficie celular acoplados a la proteína G [12], [13]. Durante los últimos 5 años, y su txas TP relacionados han sido ampliamente estudiados en la investigación del cáncer. Por lo tanto, se establece el papel positivo de txas y TP en la patología tumoral, y sus inhibidores /antagonistas han sugerido que los prometedores agentes contra el cáncer [10], [15]. Recientemente, se informó de que tanto txas y su aguas arriba de la COX-2 son controlados por TP, y txas es capaz de promover el crecimiento del tumor de pulmón a través de este bucle de retroalimentación auto-regulador [16]. Curiosamente, en las células endoteliales humanas, los efectos de agonista TP se pueden imitar por 18β-GA con un curso de tiempo similar y eficacia [17], lo que sugiere una asociación entre 18β-GA y txas moleculares.
Por lo tanto, han investigado el posible efecto de un cáncer de 18β-GA en las células NSCLC. Presentamos aquí que 18β-GA podría suprimir la proliferación celular e inducir la apoptosis en células de NSCLC a través de, al menos en parte, la inhibición de la expresión y actividad txas. podría esperarse que tales efectos son de considerable relevancia clínica.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y productos químicos
Las líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón humano NCI-H23, NCI-H460 y A549, así como una línea bronquial humana inmortalizada de células epiteliales 16HBE-T se adquirieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Tanto las células NCI-H23 y 16HBE-T se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), y NCI-H460 y células A549 se cultivaron en medio RPMI 1640. Todas las células se mantuvieron en medio de cultivo suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) en una atmósfera que contiene 5% de CO2 a 37 ° C.
18β-GA y ácido araquidónico se compraron de Sigma-Aldrich, y cisplatino fue suministrado por ALADDIN Chemical Co., Ltd. (Shanghai, china).
proliferación de las células de ensayo
Las células se sembraron a 5.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Después de un tratamiento adecuado, el número de células viables se cuantificó en los puntos de tiempo indicados, usando el ensayo de MTS, realizado por cuadruplicado, de acuerdo con la instrucción del fabricante (Promega, Madison, WI). La absorbancia se determinó a través de un lector de micro placa a la longitud de onda de 492 nm.
El análisis de citometría de flujo
Las células se sembraron a 1 x 10
5 células /10 ml en placas de 6 pocillos y se incubaron durante la noche. Se recogieron células vivas y se lavaron dos veces por PBS enfriado con hielo. las células se tiñeron con Anexina V colorante de fluoresceína y yoduro de propidio (PI) a temperatura ambiente en oscuridad durante 15 min. las células se resuspendieron a continuación en 400 tampón de unión Anexina-l (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Las células teñidas se mantuvieron en hielo y se analizaron por Beckman citómetros de flujo.
Inmunoensayo enzimático (EIA) de ensayo
actividad
txas se monitorizó ensayando el nivel de tromboxano B2 (TxB2), un producto estable de la hidratación no enzimática de TxA2 [12]. las células A549 y NCI-H460 se sembraron a la misma densidad de 1 × 10
5 células /10 ml de medio en una placa de cultivo de 6 pocillos. El sobrenadante del cultivo se recogió y se centrifugó seguido el tratamiento adecuado. TxB2 fue detectado por conjugados marcados con peroxidasa de TxB2 usando un kit de inmunoensayo enzimático de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).
transitoria transfecciones
Las células se sembraron a la misma densidad de 1 × 10
5 células /10 ml de medio en una placa de cultivo de 6 pocillos. 10 nM txas siRNA y no objetivo siRNA (control) se transfectaron en A549 y NCI-H460, mientras que 2 g pCMV6 vacante (control) o plásmido pCMV6-txas se transfectó en NCI-H23, con la ayuda de Lipofectamine 2000 reactivos (Invitrogen , Carlsbad, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante (tecnologías OriGene, Rockville, MD). La magnitud de la caída de genes específicos o la sobre expresión se detectó mediante experimento PCR en tiempo real.
La secuencia de txas siRNA es rGrUrArArCrUrUrUrArCrCrArArCrArGrArArUrGrGrCrGTC. Las condiciones para las transfecciones de ARNsi son los siguientes: las células se cultivaron a una densidad de 70% con el medio estándar. Después de eliminar el medio, las células se incubaron con DMEM (sin antibióticos) que contiene premezclada siRNA (10 nM) y 7,5 l de Lipofectamine reactivo 2000, y se incubaron adicionalmente durante 72 h.
transcriptasa reversa (RT) -PCR y PCR cuantitativa en tiempo real
RT-PCR y PCR cuantitativa en tiempo real se realizaron como se describe anteriormente [16]. Se utilizaron las siguientes secuencias de cebadores específicos del gen: 5'-AATAAGAACCGAGACGAACT-3 '(sentido) y 5'-GGCTTGCACCCAGTAGAG-3' (antisentido) para txas humanos; 5'-GGAAATCGTGCGTGACATT-3 '(sentido) y 5'-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3' (antisentido) para β-actina humana. PCR en tiempo real se realizó utilizando el tacto CFX96 pozo profundo ™ sistema de detección de PCR en tiempo real (Bio-Rad Laboratories, Inc. de Berkeley, CA). El pliegue del cambio de control en la expresión de ARNm txas se calculó por la 2
-ΔΔCT método.
Análisis Western Blot
La proteína total (20 microgramos) se resolvió mediante SDS 7% gel de poliacrilamida electroforesis y se sometió a análisis de transferencia de Western usando el más avanzado sistema de detección quimioluminiscente (Bio-Rad Laboratories). Las transferencias Western se sondaron con un anticuerpo monoclonal de ratón contra txas (tecnologías OriGene), un anticuerpo policlonal de cabra contra la β-actina (Santa Cruz Biotechnology), y los anticuerpos policlonales de conejo contra GAPDH, PARP, ERK1 /2 total y fosforilada, así como el total y CREB fosforilado (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Para garantizar la igualdad de proteínas de carga, las membranas fueron despojados y posteriormente probaron con anti-GAPDH o anticuerpos anti-β-actina.
Análisis estadísticos
Los datos se representan como media ± desviación estándar de al menos tres independientes experimentos. Se utilizó la prueba t de Student para las comparaciones entre los dos grupos, mientras que un modelo lineal seguido por la prueba de Dunnett fue adoptada para comparar las diferencias entre más de dos grupos. Los análisis estadísticos se realizaron mediante el programa SPSS 11,6 software estadístico (SPSS, Chicago, IL). Un valor de p de dos colas de. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa para todos los experimentos
Resultados
18β-GA suprime la proliferación celular a través de inducción de la apoptosis
Tanto A549 y NCI-H460 son líneas celulares de cáncer. El primero pertenece a adenocarcinoma, y el último es una línea celular de cáncer de pulmón de células grandes. Evaluación del número de células viables mediante el ensayo de MTS demostró que 24 h de tratamiento de 18β-GA suprime la proliferación celular en ambas líneas celulares en una manera dependiente de la dosis (Figura 1A). Anterior estudio in vitro demostró que la IC
50 valor de 18β-GA para inhibir el crecimiento de células de cáncer de pulmón fue de 145,3 mu M [18]. Como se muestra en la Figura 1A y 1B, 18β-GA a 160 mu M disminuyó significativamente el porcentaje de células viables a alrededor de 40,5 ± 10,5% en A549 y 38,3 ± 4,6% en NCI-H460 (p & lt; 0,01 respectivamente). Cuando las células fueron tratadas con 320 mM 18β-GA, se mostró un mayor efecto inhibitorio sobre la proliferación celular, como el porcentaje de células viables era inferior a 30% en comparación con los controles no tratados (p & lt; 0,001). Por lo tanto, parecía que 160 M 18β-GA era una concentración óptima para lograr una supresión significativa de la proliferación celular en células de NSCLC.
A y B, los experimentos mostraron que MTS 18β-GA inhibió la proliferación celular de A549 y NCI -H460 células de una manera dependiente de la dosis. Por otra parte, 18β-GA aumentó la citotoxicidad del cisplatino agente quimioterapéutico. Los datos se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes realizó por triplicado. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01. C, análisis de transferencia Western demostró el aumento de la PARP escindida (85 kDa) con la longitud de la disminución de PARP completa (116 kDa) en A549 y las células NCI-H460 tratados con 18β-GA. GAPDH (37 kDa) sirvió como control de carga. D, el análisis de citometría de flujo de la apoptosis celular. Porcentaje de células en apoptosis temprana o tardía se proporciona en los cuadrantes correctos correctos inferior y superior, respectivamente. Las cifras son el resultado representativo seleccionado de tres experimentos independientes.
El cisplatino es parte del estándar de tratamiento para los pacientes con cáncer de pulmón. Para determinar la posibilidad de que 18β-GA podría tener un efecto aditivo al cisplatino sobre la proliferación de células tumorales, las dos líneas celulares ensayadas fueron cultivadas en la presencia de 5 mg /ml de cisplatino solo o 5 mg de cisplatino /ml junto con 80 mM 18β-GA. Cuando se trata con cisplatino solo, el porcentaje de células viables solamente se redujo en 20,5 ± 6,8% en A549 y 38,7 ± 6,0% en NCI-H460 en comparación con el control (p = 0,076 y 0,041, respectivamente, la Figura 1A y 1B). Sin embargo, cuando se combina con 80 mM 18β-GA, tenían un efecto sinérgico en ambas líneas celulares. tratamiento en ambas líneas celulares, la tasa de supresión después de combinarse estaba por debajo del 40% de los controles (p & lt; 0,01)., similar a la eficacia de 160 M 18β-GA sola
Para confirmar los datos observados mediante ensayos y MTS para determinar si la supresión de la proliferación celular fue en parte debido a un aumento en la apoptosis, PARP escindida se midió por transferencia Western utilizando un anticuerpo policlonal de conejo PARP detectar tanto de longitud completa y las formas escindidas. Como se ilustra en la figura 1C, el tratamiento con 18β-GA en 160 M y 320 M disminuyeron los niveles de de longitud completa PARP y el aumento de los niveles de PARP-escindido. Este resultado fue apoyado además por el análisis de citometría de flujo que se utilizó para medir la anexina-V etiquetado de fosfatidilserina, un fosfolípido de membrana expuesta en la superficie de las células apoptóticas [19]. Después de 24 h de tratamiento con 160 mM 18β-GA, las células se tiñeron con isotiocianato y PI anexina-V-fluoresceína. Como se ilustra en la figura 1D, la fracción de células en apoptosis temprana, indicados por las células PI-positivo, fue significativamente mayor en los grupos tratados con 18β-GA (alrededor de 3,5 veces para el A549, y alrededor de 3,9 veces para el NCI-H460, respectivamente ; P & lt; 0,001). Además, se encontró que las células apoptóticas más en el tratamiento de cisplatino en combinación con 18β-GA que el tratamiento de cisplatino solo, apoyando además que 18β-GA tiene un efecto aditivo al cisplatino.
18β-GA inhibe la expresión y actividad txas
estudios previos implicados un papel potencial de txas en la patogénesis de varios tipos diferentes de cáncer, incluyendo NSCLC [10], [16]. tanto, nuestro estudio si 18β-GA podría afectar a la expresión y la actividad txas. El análisis de transferencia Western mostró que 18β-GA disminución del nivel de proteína txas en un tiempo y manera dosis-dependiente (Figura 2A y 2B). Consistente con efecto apoptótico de 18β-GA muestra en la figura 1, 12 h de tratamiento de 18β-GA en 160 mM y 320 mM disminuyó drásticamente los txas niveles. Por otra parte, 18β-GA (160 M) inhibió el nivel de txas tan pronto como 3 h en NCI-H460 y 6 h en A549 después del tratamiento. mRNA también se extrae de las células tratadas con 160 mM 18β-GA de 6 h, 12 h y 24 h y posteriormente se somete a tiempo real los experimentos de PCR. Figura 2C mostró que el nivel txas ARNm se redujo significativamente por 18β-GA de una manera dependiente del tiempo, lo cual está en línea con los datos observados por Western blot.
A y B, Western blot reveló que 18β -GA inhibió la expresión de proteínas de txas (60 kDa) de una manera dosis-y dependiente del tiempo. Actina (45 kDa) sirvió como control de carga. La figura que se muestra es representativa de tres experimentos independientes, y densitometría de las transferencias se muestra en el panel derecho de la fig A y el panel inferior de fig.B. * P & lt; 0,05 y ** P & lt; 0,01 en comparación con el control. C, PCR en tiempo real reveló que la expresión de mRNA txas podría reducirse en 18β-GA de una manera dependiente del tiempo. Dare se expresan como el pliegue de control, que se calculó por 2 método
-ΔΔCT basado en los datos observados a partir de tres experimentos independientes realizados por triplicado. * P & lt; 0,05 y ** P & lt; 0.01. D y E, los ensayos de TxB2 EIA demostraron los efectos de 18β-GA sobre la actividad txas tanto en células A549 y NCI-H460 en ausencia o presencia de 0.4μM AA. Los datos se expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes realizó por triplicado. ** P & lt; 0,01 en comparación con el control,#p & lt; 0,01 en comparación con el tratamiento AA
Además, se midió el efecto de 18β-GA sobre la actividad txas posteriormente.. Como se ha mencionado, TxA2 es químicamente inestable in-vitro, la actividad txas tanto, es monitoreado ensayando el nivel de TxB2, un producto estable de la hidratación no enzimática de TxA2 [16]. Tanto las células A549 y NCI-H460 se trataron con 160 mM 18β-GA durante 24 h, y se recogió el medio de cultivo para realizar el ensayo TxB2 EIA. En estos experimentos, las células tratadas con 0,4 M AA que es el precursor de TxA2 sirve como los controles positivos, y las células tratadas con inhibidor específico txas furegrelate (1 mM) sirvieron como controles adicionales. Las dosis seleccionadas de estos productos químicos son comparables a las concentraciones utilizadas en el in-vitro experimentos reportados en otros estudios [16], [20]. Como se muestra en la figura 2D y 2E, en ambas líneas celulares, la biosíntesis de TxA2 se suprimió significativamente por 18β-GA en ausencia o presencia de AA. 0,4 M AA inducida TxB
2 Producción por 1,8 veces en células A549 (P & lt; 0,01) y 2,8 veces en las células NCI-H460 (p & lt; 0,01) en comparación con el control. Sin embargo, la adición de 160 M 18β-GA significativamente atenuada TxB
2 la producción de AA inducida por casi 91% en el A549 y 89% en NCI-H460 (p & lt; 0,001 respectivamente). Es importante destacar que, 18β-GA en M 160 es el equivalente en eficacia a furegrelate 1 mM. Estos resultados sugieren fuertemente que 18β-GA es capaz de abrogar la actividad txas en células de NSCLC.
conjunto, los datos de que 18β-GA podían inhibir significativamente tanto la expresión y la actividad de txas implica que 18β-GA puede suprimir célula proliferación a través de la inhibición de la acción txas.
18β-GA no tuvo efectos adicionales sobre la proliferación celular cuando fue derribado txas
Para verificar la posibilidad de que 18β-GA puede suprimir la proliferación celular a través de la inhibición de txas, nos derribado expresión txas en A549 y células NCI-H460 utilizando siRNA transfección y 160 mM 18β-GA se añadió posteriormente durante 24 h. No objetivo siRNA también se transfectó en dos líneas celulares para servir como control. PCR en tiempo real indica que la expresión de txas en ambas líneas celulares se suprimió significativamente a las 24 h de la transfección de siRNA-txas, con casi el 90% de la eficacia de supresión (Figura 3A). La eficacia de transfección se confirmó adicionalmente mediante análisis de transferencia Western (figura 3B). Después de la adición de 160 M 18β-GA para otro 24 h, los ensayos de MTS se realizaron y los resultados mostraron que las tasas de proliferación de células A549 tratadas con 18β-GA, txas-siRNA, y la combinación de ambos fueron 41,7 ± 1,7%, 38,3 ± 4,4% y 35,4 ± 6,4% de los controles, respectivamente (figura 3C). En las células NCI-H460, fueron 38,9 ± 3,7%, 31,1 ± 3,4% y 28,4 ± 8,0% de los controles, respectivamente (Figura 3D). Parece ser que, en comparación con txas-siRNA transfección, la administración adicional de 18β-GA no tiene ningún efecto adicional significativo sobre la proliferación celular.
A y B, la eficacia de la supresión de la expresión de siRNA en txas fue revelado por bienes -Tiempo PCR y análisis de transferencia Western. se observaron en tiempo real los datos de PCR a partir de tres experimentos independientes realizados por triplicado y calculados por el método 2
-ΔΔCT. Los datos se presentan como el pliegue de control, ** P & lt; 0,01. C y D, los ensayos de MTS demostró que txas-siRNA transfección inhibe la proliferación celular en A549 y NCI-H460, y la administración adicional de 18β-GA no tenía efectos aditivos. Los datos se presentan como porcentajes del control y expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes realizados por triplicado. ** P & lt; 0,01
Es de destacar que el resultado de que siRNA de txas redujo significativamente el crecimiento celular, la cual está en línea con los datos observados en nuestros estudios anteriores que muestran que txas inhibidor específico furegrelate puede inhibir de forma espectacular. el crecimiento celular en células de cáncer de pulmón [11], [16]. En apoyo de nuestros datos, Cathcart MC et al demostraron que otro inhibidor txas ozagrel inhibe la proliferación celular a través de la inducción de la apoptosis en las células NSCLC [10], y Moussa O et al demostraron que txas shRNA suprimió el crecimiento de células de cáncer de vejiga [19]. Por otra parte, Nie D et al observaron que la motilidad de las células tumorales de próstata fue atenuada por inhibidores de txas [21].
supresión de la proliferación celular por 18β-GA se asoció con txas estado
Los resultados observados por encima de apoyo que los efectos inhibidores de 18β-GA puede ser debido a la supresión de txas en células de NSCLC. A fin de verificar esta posibilidad, el próximo examinado una serie de líneas de células de pulmón para la expresión de txas. RT-PCR experimentos mostraron que, en comparación con el A549 y NCI-H460, una línea inmortalizada humana de células epiteliales bronquiales 16HBE-T y otra línea celular de NSCLC NCI-H23 expresaron nivel mínimo de txas (figura 4A). Estas dos líneas celulares se trataron con concentraciones crecientes de 18β-GA durante 24 h, y el ensayo de MTS se llevó a cabo para detectar la proliferación celular. Como se muestra en la figura 4B y 4C, 18β-GA no logró abolir la proliferación celular en tanto 16HBE-T y NCI-H23, aunque con una ligera tendencia a la supresión. La tasa de supresión en dosis de 500 mM no era más de 20% de control en ambas líneas celulares.
A, el nivel mínimo de txas en 16HBE-T y NCI-H23 y la expresión sobre-de txas en A549 y NCI-H460 fueron revelados por RT-PCR. La figura que se muestra es representativa de tres experimentos independientes. B y C, MTS demostraron que mientras que había una tendencia inhibitoria leve, 18β-GA no pudo controlar la proliferación celular en 16HBE-T y NCI-H23. Los datos se presentan como porcentajes del control y expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes realizados por triplicado. D y E, la expresión txas en NCI-H23 se sobre-expresan por transfección con pCMV6-txas plásmido. se observaron en tiempo real los datos de PCR a partir de tres experimentos independientes realizados por triplicado y calculados por el método 2
-ΔΔCT. Los datos se presentan como el pliegue de control, ** P & lt; 0,01. F, ensayos MTS demostró que la promoción de la proliferación de las células mediante transfección con pCMV6-txas sido abrogada por la 18β-GA. Los datos se presentan como porcentajes del control y expresan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes realizados por triplicado. ** P & lt; 0,01 en comparación con el control,#p. & Lt; 0,01 en comparación con pCMV6-txas transfección
Dado que NCI-H23, perteneciente al adenocarcinoma, es una línea de células de NSCLC con el nivel mínimo de txas, que sobre-expresan txas en esta línea celular mediante transfección con pCMV6-txas plásmido. plásmido Libre también se transfectó para servir como control. Figura 4D ilustra que txas se sobre-expresa aproximadamente 8,2 veces mayor que el control después de 24 h de la transfección con ADNc txas. También se realizó análisis de transferencia de Western para confirmar la eficacia de la transfección (figura 4E). Las células se trataron posteriormente con 160 mM 18β-GA para otro 24 h. experimentos MTS demostraron que la transfección con ADNc txas marcadamente promovió la proliferación de células de 181,4 ± 3,6% en comparación con el control (p & lt; 0,001), el efecto se suprimió mediante la adición de 18β-GA. La tasa de proliferación celular se redujo significativamente por 18β-GA a 111,2 ± 2,2% del control, casi incluso con el nivel de control (figura 4F). Estos resultados apoyan que el efecto del 18β-GA en el CPNM se asocia con el cambio de expresión txas.
De señalización
ERK /CREB estuvo implicado en los efectos 18β-GA
En nuestros estudios anteriores, demostró que la activación de ERK y tanto CREB puede ser inhibida por los inhibidores de txas o antagonistas TP, y la activación de CREB se suprime por el inhibidor específico ERK [11], [16]. /ERK /CREB txas se aborda también en otros estudios realizados en el modelo de cáncer de pulmón [22], [23]. Por lo tanto, la serie final de Western Blot experimentos se realizaron para investigar si la vía ERK /CREB estuvo implicado en los efectos de supresión tumoral de 18β-GA. Como se muestra en la Figura 5A, las células transfectadas con pCMV6-txas presentan los niveles más altos de ERK1 fosforilados /2 (p-ERK1 /2) y CREB fosforilado (p-CREB), los efectos fueron atenuadas de manera espectacular por el tratamiento de 160 M 18β- GEORGIA. El resultado está en línea con los datos observados por MTS ensayos (figura 4F). Además, se determinaron los efectos de 18β-GA sobre la activación de ERK /CREB en A549 y NCI-H460, ambos de los cuales presentan altos niveles de txas como se ve en la figura 4A. Figura 5B mostró que la baja regulación de txas de siRNA bloqueado ERK1 /2 fosforilación en las células A549 y H460. Consistentemente, 160 M 18β-GA suprime eficazmente los altos niveles de p-ERK y p-CREB en estas dos líneas celulares. No alteración era detectable sobre la expresión de CREB ERK o total total en todas las líneas celulares ensayadas.
A, los experimentos de transferencia Western demostraron que la activación de ERK1 /2 (42/44 kDa) y CREB (43 kDa) inducida por pCMV6-txas transfección se puede abolir por 18β-GA en células NCI-H23. La figura que se muestra es representativa de tres experimentos independientes, y densitometría de las transferencias se muestra en el panel derecho. * P & lt; 0,05 ** p & lt; 0,01 en comparación con el control;#P & lt; 0,05 y ## p & lt; 0,01 en comparación con el tratamiento 18β-GA en las células transfectadas con el plásmido vacío. B, la supresión de ERK1 /2 y la activación de CREB por txas-siRNA y 18β-GA en A549 y NCI-H460 se reveló mediante análisis de transferencia Western. En estos experimentos, ERK1 Total /2 (42/44 kDa), CREB total (43 kDa) y actina (45 kDa) sirvió como control de carga. Un anticuerpo monoclonal que puede detectar los niveles endógenos de p-CREB y la forma fosforilada de la proteína relacionada con CREB activador de la transcripción del factor-1 (p-ATF-1) se utilizó en el estudio actual. La figura que se muestra es representativa de tres experimentos independientes, y densitometría de las transferencias se muestra en el panel derecho. * P & lt; 0,05 en comparación con el control
Discusión
Como una de las hierbas que se usan con frecuencia en la medicina oriental con baja toxicidad, el regaliz se aprobó una Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos (FDA). suplemento alimenticio utilizado en muchos productos. Como se ha indicado anteriormente, el ácido glicirrícico es el componente bioactivo importante y es fácilmente hidrolizado para ser 18β-GA en el cuerpo humano para ejercer diversos efectos, incluyendo la actividad anti-cáncer [1] - [4]. Este estudio demostró el efecto supresor de tumores de 18β-GA en las células NSCLC, y se encontró txas estar implicados en este efecto.
Inicialmente se puso de manifiesto que 18β-GA dosis-dependiente disminución de la proliferación celular en las células NSCLC A549 y NCI-H460. El ID50 de 18β-GA en las células HepG2 fue de 80 M [24], mientras que en nuestro modelo de la dosis de 160 M disminuyó la tasa de proliferación celular en un 50% de control, que está en línea con un informe anterior muestra que el CI
50 valor de 18β-GA fue 145,3 M en una línea celular de cáncer de pulmón metastásico altamente potencialmente PGCL3 [18]. 80 M 18β-GA en combinación con cisplatino produjo un efecto significativo supresor de tumores, a pesar de 18β-GA solo en 80 M no tenían eficacia eficaz para matar las células cancerosas. Este resultado sugiere que el efecto sinérgico de 18β-GA en agente quimioterapéutico. A549 mostró una mayor resistencia a cisplatino en comparación con las células NCI-H460, que está de acuerdo con otros estudios que demuestran que A549 es más resistente a cisplatino que algunas otras líneas celulares [25], [26]. El análisis de transferencia Western presenta aún más el aumento de la PARP-escindido con la disminución de la PARP de longitud completa en células tratadas con 18β-GA a las dosis de 160 mM y 320 mM. Por lo tanto, el cambio en el número total de células viables a las 24 h después del tratamiento con 18β-GA observó en los experimentos de MTS puede atribuirse al aumento de la apoptosis, que es confirmado por los datos observados por el análisis de citometría de flujo. En conjunto, parece que 18β-GA es un agente anti-cáncer prometedor para su aplicación en la prevención y tratamiento de NSCLC.
procedió a examinar los mecanismos moleculares mediante el cual 18β-GA ejerce un efecto supresor de tumores en células de NSCLC. En virtud de la catálisis de la formación de TxA2 que funciona a través de su receptor TP, txas se ha demostrado que tiene un papel potencial en el fenotipo del cáncer [10], [11], [14] - [16]. Es importante destacar que, txas y su producto TxA2 se encontraron que se sobreexpresa en tejidos de cáncer de pulmón, en comparación con tejidos pulmonares normales [9] - [11], [27]. Un informe anterior mostrando que 18β-GA es el equivalente en eficacia a un agonista de TP en células endoteliales humanas [17] nos llevó a preguntar si estaba implicado en txas efectos 18β-GA en NSCLC. Esta hipótesis también fue iluminado por un hecho de que el ácido glicirrícico, el precursor de 18β-GA, actúa en parte a través de la inhibición de la COX-2 [28], que proporciona PGH2 para txas para catalizar la formación de TxA2 [12], [29]. Junto con los resultados que 24 h de tratamiento de 18β-GA dependiente de la dosis suprime la proliferación celular y la apoptosis inducida, la disminución de txas por 12 h de tratamiento de 18β-GA sugiere que el 18β-GA inducida por la inhibición de la txas es un evento aguas arriba de inhibición del crecimiento y la apoptosis en el CPNM, que es apoyada además por los siguientes experimentos de tiempo. Además, los niveles de mRNA de txas podrían reducirse en 18β-GA de una manera dependiente del tiempo, lo que implica que 18β-GA inhibe la expresión txas a nivel transcripcional. Por otra parte, la actividad txas, reflejada por el nivel TxB2 secretada al medio de cultivo, se inhibió dramáticamente por 18β-GA. Estos resultados sugieren que txas podría ser una base molecular crucial del efecto 18β-GA en células de NSCLC. Por transfección con txas-siRNA, célula capacidad proliferativa de los dos A549 y NCI-H460 se inhibió de manera efectiva, más el apoyo a la función positiva de txas en el cáncer de pulmón [10], [11], [16]. Es importante destacar que la administración adicional de 18β-GA no tenía los efectos aditivos en txas-siRNA transfección. Para confirmar estos resultados, que exhibió una serie de líneas de células de pulmón para determinar la expresión de txas. NSCLC es cualquier tipo de cáncer de pulmón epitelial que no sea el carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC), así que utilizamos 16HBE-T, que es una línea bronquial humana inmortalizada de células epiteliales para servir como control para las líneas celulares de cáncer. De acuerdo con otros estudios [9] - [11], se encontró nivel txas a ser mínima en 16HBE-T, mientras estaba sobreexpresado en las células NSCLC A549 y NCI-H460. Otra de las líneas celulares de cáncer del NCI-H23 también expresó nivel mínimo de txas, por lo que es un modelo ideal para la transfección de ADNc txas. Como era de esperar, 18β-GA no pudo reprimir eficazmente la proliferación de células de 16HBE-T y NCI-H23. Parecía que los diferentes efectos de 18β-GA en todas estas líneas de células se debe a la diferencia de expresión txas.