Extracto
El cáncer de páncreas STAT3-dependiente es una enfermedad muy agresiva con pocas opciones terapéuticas. En este estudio, investigamos el papel de la proteína quinasa C zeta (PKCζ) en las células de cáncer de páncreas. PKCζ se ha demostrado que actuar ya sea como un supresor de tumor o promotor de tumores en función del contexto celular. Encontramos que la expresión PKCζ se mantiene uno o elevada en los tumores pancreáticos humanos primarios, pero nunca se pierde, en consonancia con PKCζ jugar un papel promotor en el fenotipo de cáncer de páncreas. La inhibición genética de PKCζ redujo el crecimiento adherente, la supervivencia celular y el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer de páncreas humano in vitro. Además, la inhibición PKCζ reduce el tamaño del tumor ortotópico in vivo mediante la inhibición de proliferación de células tumorales y el aumento de la necrosis tumoral. Además, la inhibición PKCζ reducida metástasis de tumores in vivo, y causó una reducción correspondiente en la invasión de células de cáncer de páncreas
in vitro
. transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) es a menudo constitutivamente activa en el cáncer de páncreas, y juega un papel importante en la supervivencia de células de cáncer de páncreas y metástasis. Curiosamente, la inhibición de PKCζ redujo significativamente la activación de STAT3 constitutiva en células de cáncer pancreático
in vitro
y
in vivo
. la inhibición farmacológica de STAT3 imitaba el fenotipo de la inhibición PKCζ, y la expresión de una construcción de STAT3 constitutivamente activa rescató el fenotipo transformado en células PKCζ deficientes. Concluimos que PKCζ se requiere para la célula transformada crecimiento del cáncer de páncreas y la invasión in vitro y la tumorigénesis in vivo, y que STAT3 es un importante mediador aguas abajo de los efectos pro-cancerígenos de PKCζ en células de cáncer pancreático
Visto.: mayordomo AM, Scotti Buzhardt ML, Li S, Smith KE, campos AP, Murray NR (2013) la proteína quinasa C zeta Regula celulares de cáncer pancreático humano transformado el crecimiento y la invasión a través de un mecanismo dependiente de STAT3. PLoS ONE 8 (8): e72061. doi: 10.1371 /journal.pone.0072061
Editor: Jingwu Xie, Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de mayo de 2013; Aceptado: July 5, 2013; Publicado: 28 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Butler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Financiación proporcionada por: NIH /NCI R03 CA143164, NIH /NCI R01CA140290 (MRN), Daniel Fundación de Alabama beca posdoctoral (MLS), NIH /NCI F31 CA168117 (AMB), NIH /NCI R01 CA081436-16 (APF), la Fundación Clínica Mayo (NRM, APF). APF es el Jacoby Dotado Profesor Monica Flynn de Investigación del Cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses: Una patente provisional en relación con esta investigación ha sido presentada (MSB, APF, MRN; Métodos y materiales para el tratamiento del cáncer de páncreas, la solicitud de patente de EE.UU.#20110190390). Co-autor Alan Fields es un editor académico de PLOS ONE. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de páncreas es la décima cáncer más comúnmente diagnosticado en los EE.UU., y ocupa el cuarto lugar letalidad [1]. La tasa de supervivencia global a 5 años de cáncer de páncreas es inferior al 5% y no ha mejorado significativamente en los últimos 30 años. La letalidad del cáncer de páncreas se atribuye en parte a la resistencia a las quimioterapias actuales [2]. Caracterización de nuevas vías de señalización oncogénicas en el cáncer de páncreas puede conducir a la identificación de dianas terapéuticas más eficaces para el tratamiento del cáncer de páncreas.
proteína quinasa C (PKC) se ha implicado en la tumorigénesis de más de 30 años, ya que fue la primera caracterizado como un receptor para los ésteres de forbol promotores de tumores [3]. PKC se sabe ahora que es una familia de isoformas relacionadas, y estudios recientes han caracterizado las funciones específicas de las isoformas individuales en la susceptibilidad a, y el desarrollo de cáncer [4], [5], [6], [7], [8 ], [9], [10]. Aunque los miembros de la PKC atípicas (aPKC) subfamilia de las isoformas de PKC son incapaces de unirse y ser activado por ésteres de forbol, su posible papel en el fenotipo de cáncer también ha sido investigado. Los dos aPKCs, PKC iota (PKCι) y PKC zeta (PKCζ), son estructuralmente similares; Sin embargo, nocaut embrionario de cada aPKC revela fenotipos únicos, lo que sugiere funciones no redundantes en el desarrollo y el cáncer [11], [12]. PKCι promueve el desarrollo del cáncer en modelos de ratón de cáncer de pulmón y colon, y es un oncogén en el cáncer de pulmón y de ovario [5], [6], [13], [14], [15]. Del mismo modo, hemos demostrado un papel pro-cancerígenos para PKCι en las células de cáncer de páncreas [16]. Por el contrario, los dos papeles PROMOTIVE tumor y supresores de tumores se han atribuido a PKCζ [4], [17], [18], sin embargo, su papel en el cáncer de páncreas no ha sido evaluada. En el presente estudio, mostramos que PKCζ es elevada en un subconjunto de los tejidos tumorales pancreáticas humanas en comparación con el epitelio de páncreas normal correspondiente. Por otra parte, hemos demostrado que la inhibición de PKCζ en las células de cáncer de páncreas entorpece seriamente el fenotipo del cáncer. Nuestros datos también identifican STAT3 como un importante mediador de PKCζ en el crecimiento transformado e invasión de células de cáncer de páncreas.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Bioespecímenes se obtuvieron de la Mayo Clinic Registro de tejido bajo un protocolo de la Clínica Mayo Junta de Revisión Institucional aprobado. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo de la Clínica Mayo Institucional.
Las muestras de pacientes
RNA fue aislado de un conjunto de muestras de pacientes con adenocarcinoma de páncreas para el cual congelada, tumor y no emparejado tejido páncreas tumor estaba disponible como se describe [16]. Hematoxilina y eosina (H & amp; E) teñidas secciones de tumor emparejados y tejidos pancreáticos adyacentes, no tumorales se analizaron para confirmar la histología apropiado
Reactivos y cultivo celular
humano de células de cáncer de páncreas. líneas fueron adquiridos de American Type Culture Collection y todos los experimentos se realizaron con células a pases menos de 6 meses. líneas celulares de cáncer pancreático humano se mantuvieron en un CO 5%
2 de cultivo de tejidos humidificado incubadora en DMEM con 10% de FBS como recomendado por la American Type Culture Collection. Los anticuerpos se obtuvieron de las siguientes fuentes: PKCζ, β-actina, fosfo-STAT3 (Y705), STAT3, fosfato ERK1 /2, ERK1 /2 y troceados caspasa-3 (Tecnologías de Señalización Celular), PKCι (BD Transducción Laboratories), 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) (Dako) y FLAG (Sigma Life Sciences).
El aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR
El ARN total se aisló utilizando el kit de aislamiento RNAqueous (Ambion) de acuerdo con los protocolos del fabricante. TaqMan Gene primers Ensayo de Expresión y la sonda conjuntos (Applied Biosystems) se utilizaron para el tiempo real, análisis de PCR cuantitativa (qPCR) de hGAPDH (Hs99999905_m1), hPKCζ (Hs00177051_m1) y 18S (Hs99999901_s1). qPCR análisis se llevaron a cabo utilizando 10 ng de cDNA (GAPDH y hPKCζ) o 2 ng de cDNA (18S) en un Applied Biosystems 7900 termociclador. Los datos se evaluaron utilizando el paquete de software SDS 2.3. La expresión génica en tumores de páncreas y en líneas celulares de cáncer pancreático se normalizó a GAPDH y 18S, respectivamente. Todos los datos se expresan como 2
- (
CT gratis (objetivo) -
CT gratis (endógeno de referencia)).
La inmunohistoquímica y análisis de la expresión
Los tejidos se procesaron para el análisis inmunohistoquímico (IHC) como se describe anteriormente [19]. PKCζ y fosfo-STAT3 tinción se visualizó utilizando el Envision Plus Anti-conejo marcado con HRP-Polymer (Dako). Las imágenes fueron capturadas utilizando Aperio ImageScope y se analizaron con el software Spectrum Aperio.
La inhibición de la expresión PKCζ
Los vectores lentivirales que expresan la interferencia corta horquilla de ARN (ARNi) PKCζ orientación construcciones humanas se generaron y se utilizan para obtener estables transfectantes como se describe anteriormente [20]. PKCζ RNAi#1 constructo se dirige a una secuencia en la región de codificación de PKCζ (GTTGTTCCTGGTCATTGAGTA) y PKCζ RNAi#2 constructo se dirige a una secuencia en la región no traducida 3 'de PKCζ (GACAGACGCTTGCGCCGAGAC). Se seleccionaron y se mantienen por la inclusión de puromicina en el medio de cultivo poblaciones de células que incorporan las construcciones lentivirales.
cuantificación de la célula de ensayo
La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de MTT (CellTiter 96 acuoso One Solution, Promega) , según lo recomendado por el fabricante. células de cáncer pancreático, Panc-1 (1 × 10
3 células /pocillo) y MiaPaCa-2 (1 × 10
2 células /pocillo) se cultivaron en una placa de 96 pocillos durante 1, 3, 5 y 7 días antes del ensayo.
la muerte celular ensayo
la muerte celular se ensayó usando el ensayo de detección de muerte celular ELISA Plus (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Anchorage- ensayos de crecimiento independientes
Panc-1 y MiaPaCa-2 células (5 × 10
3) se sembraron en agar blando y evaluado para el crecimiento independiente de anclaje como se describe anteriormente [21].
modelo de tumor ortotópico
Panc-1 células de cáncer de páncreas humano (1 × 10
6) que lleva un vector retroviral que codifica la luciferasa de luciérnaga pSIN-Fluc [22] y que manifieste su NT [16] o ARNi eran PKCζ mezclado con el factor de crecimiento reducido Matrigel (Becton Dickinson) y se inyecta en el páncreas proximal de 4-6 semanas de edad ratones desnudos atímicos macho (
n
= 16). Todas las cirugías se realizaron bajo anestesia con isoflurano, y los ratones se les administró buprenorfina como analgésico inmediatamente antes y ~ 18 horas después de la cirugía para minimizar las molestias animal. los ratones portadores del tumor se controlaron diariamente para detectar signos de angustia y dos veces por semana para la pérdida de peso. El crecimiento tumoral se controló semanalmente por imágenes de fluorescencia. Brevemente, se inyectaron ratones por vía intraperitoneal con una solución de D-luciferina (Xenogen) a una dosis de 150 mg /kg de peso, anestesiados con isoflurano y la imagen utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia (Caliper Life Sciences-Xenogen, Hopkinton, MA). Una hora antes del sacrificio, los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 100 mg /kg de BrdU.
tumor ortotópico análisis
Los tumores de los ratones inyectados con células PKCζ RNAi fueron de la fijada en formalina y se analizaron para la proliferación (BrdU incorporación) por inmunohistoquímica (IHC), como se describe anteriormente para los tumores NT RNAi [16]. La apoptosis se evaluó mediante la detección de la caspasa-3 de escisión tal como se describe anteriormente [19], [23]. necrosis tumoral fue identificado en H & amp; E de tejidos teñidos. software Spectrum se utilizó para calcular el porcentaje de área del tumor necrótico dividiendo área del tumor necrótico por área total del tumor. metástasis tumorales fueron identificados por la evaluación anatómica bruto de los órganos abdominales y el pecho sobre la terminación del estudio, y verificado por H & amp; E tinción de las lesiones metastásicas como se describe para los tumores NT RNAi [16]
ensayo de invasión celular
invasión celular se ensayó usando cámaras de invasión de Matrigel recubierto (BD Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, 5 × 10
4 células de cáncer de páncreas humanos se sembraron en medio libre de suero en la cámara superior, y DMEM que contiene 2,5% de FBS se utilizó como el quimioatrayente en la cámara inferior. Las células se dejaron para invadir durante 24 horas a 37 ° C y las células fueron fijadas, teñidas y se cuantificaron como se describe anteriormente [20].
Expresión de STAT3 constitutivamente activa (STAT3-C)
Las células fueron infectadas con adeno-Null o FLAG-etiquetados adeno-STAT3-C [24]. La expresión de proteínas se determinó mediante análisis de inmunotransferencia de lisados de células totales. El análisis por inmunotransferencia se realizó en células aisladas a 60-80% de confluencia.
El análisis estadístico
Dos vías ANOVA y Student
t-test
se utilizaron para evaluar la significación estadística de los resultados.
p
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
PKCζ se eleva en un subgrupo de tumores pancreáticos humanos
Comenzamos nuestro estudio evaluando PKCζ expresión en los tumores pancreáticos humanos primarios y tejido no tumoral circundante (Figura 1). La información clínica y demográfica de esta población de pacientes se publica [16]. Detección inmunohistoquímica de la proteína PKCζ en los tejidos tumorales pancreáticas representativos reveló un nivel variable de expresión PKCζ que localiza tanto en el núcleo como en el citoplasma (Figura 1A). expresión PKCζ también se detectó en un nivel variable, pero inferior en no tumoral, tipos de células pancreáticas (Figura 1B). células de los islotes y acinares del páncreas no tumoral mostraron baja expresión PKCζ (Figura 1B, paneles de la izquierda). La expresión de PKCζ en células ductales era similar a, o ligeramente mayor que, la expresión de células de los islotes y acinares (Figura 1B, paneles de la derecha). Seguidamente, evaluó la expresión PKCζ mRNA en un panel de adenocarcinoma de páncreas humano 28 emparejado y adyacente páncreas, no tumoral. expresión PKCζ mRNA se detectó en los 28 tumores pancreáticos primarios analizados (datos no mostrados). Análisis de muestras pareadas reveló que la expresión PKCζ fue significativamente mayor en tumores que en pares de tejido, no tumoral (Figura 1C). expresión PKCζ mRNA fue significativamente elevado en 25% de los tumores de páncreas, en comparación con la expresión media PKCζ mRNA en el páncreas no tumoral, y no hay tumores mostraron una reducción significativa en la expresión PKCζ mRNA (Figura 1D). Se realizó un análisis de la relación entre la expresión de mRNA PKCζ y la supervivencia del paciente, pero en esta pequeña cohorte no se observó correlación
A y B) de detección de IHC de expresión PKCζ en los tumores pancreáticos humanos representativos (A;. Tumor) y tejido adyacente no tumoral (B; normal). B) Las secciones seriadas teñidas con H & amp; E se proporcionan para distinguir acinar, los islotes (imagen superior izquierda, los islotes pancreáticos se describe) y las células ductales (imagen superior derecha). Todas las imágenes en el mismo panel son la misma ampliación. Bares = 100 micras. C) Análisis cuantitativo de PCR de la expresión de mRNA PKCζ se realizó en 28 pacientes muestras de adenocarcinoma de páncreas y no tumorales emparejados. PKCζ expresión se normalizó a la abundancia 18S; * P = 0,001 calculado por emparejado
t-test
. D) expresión PKCζ es significativamente elevado en un subconjunto de tumores de páncreas. PKCζ se sobreexpresa en el 25% de los tumores pancreáticos analizados, según lo definido por la abundancia de ARNm del tumor mayor de 2 desviaciones estándar por encima de la media de PKCζ la abundancia de ARNm en todas las muestras de páncreas no tumorales adyacentes.
PKCζ regula la fenotipo transformado de las células de cáncer de páncreas in vitro
para evaluar directamente el papel de PKCζ en el fenotipo de cáncer de páncreas, hemos utilizado dos diferentes construcciones de RNAi para inhibir la expresión PKCζ en dos líneas pancreáticos humanos bien caracterizados de células cancerosas, Panc- 1 (Figura 2A) y MiaPaCa-2 (Figura S1A). poblaciones de células establemente seleccionados exhibieron consistentemente 70% o más de inhibición de la expresión de mRNA PKCζ, con la correspondiente disminución en la expresión de proteínas PKCζ (Figura 2A y S1A). La selectividad de la RNAi-dirigida de PKCζ constructos se confirma por la falta de efecto de estas construcciones en la expresión de la isoenzima PKCι atípica estrechamente relacionados (Figura 2A y S1 A). La inhibición de la expresión PKCζ resultó en una disminución pequeña pero significativa en el diario de fase, el crecimiento de células adherentes (Figura 2B y S1B) y un aumento en la muerte celular basal (Figura 2C). Además, PKCζ derribar (KD) disminuyó significativamente el crecimiento de células de cáncer de páncreas independiente de anclaje (la formación de colonias en agar blando) (Figura 2D y S1C), lo que indica que PKCζ es crítico para la supervivencia de células de cáncer de páncreas y el fenotipo transformado.
células Panc-1 de forma estable que llevan lentivirus que manifieste su control, no director (NT) o PKCζ de metas de RNAi (Z1 y Z2) se evaluaron para a) PKCζ y PKCι expresión de la proteína mediante análisis de inmunotransferencia (arriba), y la abundancia PKCζ ARNm por El análisis qPCR (inferior); B) la viabilidad celular (MTT ensayo colorimétrico); C) la muerte celular (detectado por muerte celular de ELISA de detección) y D) el crecimiento independiente de anclaje (formación de colonias en agar blando). Para cada Barras del panel = promedio de 3 o más repeticiones ± SD y el gráfico es representativo de 3 experimentos independientes o más. * P & lt;. 0,05 vs NT
PKCζ juega un papel crítico en la tumorigénesis pancreática
A continuación se investigó el efecto de PKCζ KD en la formación de tumores de páncreas y el crecimiento mediante un Panc- descrito anteriormente 1 modelo de tumor ortotópico [16]. Panc-1 en las células que expresan el gen de luciferasa de luciérnaga (pSIN-Fluc) y, o bien NT o PKCζ RNAi se inyectaron en el páncreas de ratones desnudos para formar tumores ortotópico. El crecimiento tumoral se monitorizó por detección de la bioluminiscencia (Figura 3A), y los ratones se cosecharon 5 semanas después de la inoculación. La formación de tumores se observó en todos los ratones inyectados con células Panc-1 que expresan RNAi construir; sin embargo, el peso del páncreas final fue significativamente menor en los ratones con tumores PKCζ RNAi, debido al tamaño reducido del tumor (Figura 3B y 3C). La hipótesis de que, similar al efecto de PKCζ KD in vitro (Figura 2B-D), el tamaño del tumor reducido de células PKCζ KD Panc-1 in vivo se debe a la proliferación de células tumorales reducido y una mayor muerte de células tumorales. El nivel de incorporación de BrdU, una medida de la proliferación del tumor, se evaluó en Panc-1 tumores PKCζ RNAi y se compara con el nivel de incorporación de BrdU en Panc-1 tumores NT RNAi [16]. Como se predijo, la proliferación tumoral se redujo significativamente en los tumores PKCζ RNAi comparación con los tumores NT RNAi (Figura 4A). Curiosamente, no se observó un efecto significativo de PKCζ KD sobre la apoptosis tumoral, detectada por exfoliados caspasa-3 (Figura 4B). Sin embargo, los tumores PKCζ RNAi tenían un nivel significativamente más alto de la necrosis de tumores NT RNAi (Figura 4C y 4D). resultados de necrosis tumoral de una acumulación de muerte de células tumorales, que puede ocurrir cuando un tumor crece más su suministro de sangre. Aunque los tumores PKCζ RNAi son drásticamente más pequeño que los tumores NT RNAi, no exhiben una disminución de la densidad de los vasos sanguíneos del tumor tal como se cuantifica por tinción con CD31 (Figura 4E). Estos datos sugieren que el volumen del tumor reducido de los tumores pancreáticos PKCζ RNAi es el resultado del efecto acumulativo de la disminución de la proliferación celular y la supervivencia durante el transcurso de tiempo del experimento in vivo.
A) de formación de imágenes bioluminiscente Representante de ratones con Panc-1 NT y PKCζ RNAi tumores pancreáticos ortotópico. B) Representante H & amp; E manchadas secciones de los tumores de páncreas ortotópico Panc-1 NT y PKCζ RNAi. El páncreas de ratón normal restante está encerrado en azul. C) Inhibición de la PKCζ disminuyó significativamente el páncreas y el peso del tumor ortotópico; n = 16; * P & lt;. 0.001
A) Análisis cuantitativo de la proliferación tumoral detectada por la incorporación de BrdU; * P & lt; 0,003. B) Análisis cuantitativo de la apoptosis tumor detectado por exfoliados caspasa-3 tinción. C) Representante H & amp; E manchadas ortotópico tumores de páncreas Panc-1 NT y PKCζ RNAi con áreas de necrosis identificado (contorno amarillo) (barra = 1 mm). línea verde delimita el tejido tumoral. D) Análisis cuantitativo de necrosis tumoral representa como por ciento del área total del tumor; * P & lt; 0,0002. E) Análisis cuantitativo de la vascularización del tumor, como se determina por porcentaje de área de CD31 tinción. A-E)
n = 16
tumores NT RNAi y 15 tumores PKCζ RNAi. F) Panc-1 células PKCζ RNAi (Z1 y Z2) NT y se evaluaron para la invasión celular a través de cámaras recubiertas con Matrigel. Bares = promedio de 3 o más repeticiones +/- SD y el gráfico es representativo de 2 o más experimentos independientes. * P & lt;. 0,05 vs NT
PKCζ juega un papel importante en la invasión de células de cáncer de páncreas
En el modelo de tumor ortotópico de páncreas, las células Panc-1 forman tanto los tumores primarios y las metástasis [dieciséis]. se observaron metástasis en el riñón, el hígado, el diafragma, y el mesenterio en más de 50% de los ratones portadores de tumores NT RNAi (Tabla 1, [16]). En contraste, no la metástasis tumoral en el mesenterio o diafragma se identificó en ratones portadores de tumores PKCζ RNAi; Sólo 2 de los 15 ratones portadores de tumores PKCζ RNAi (13%) tenían metástasis a los riñones, y sólo 1 de los 15 ratones portadores de tumores PKCζ RNAi (6%) tenían una metástasis hepática (Tabla 1). Estos datos son coherentes con un efecto inhibidor de PKCζ KD en la metástasis del tumor de páncreas. Sin embargo, no podemos descartar la posibilidad de que la disminución observada en la metástasis de tumores PKCζ RNAi puede ser secundaria al tamaño reducido de manera significativa de los tumores. Si PKCζ regula la metástasis tumoral in vivo, es probable que regulan también aspectos del fenotipo metastásico, tales como la invasión celular, in vitro. De hecho, la invasión celular se redujo significativamente en las células PKCζ RNAi, en comparación con las células de cáncer de páncreas NT RNAi (Figura 4F y S2). Estos resultados demuestran un papel para PKCζ en la invasión de células de cáncer de páncreas, y son consistentes con un papel para PKCζ en el fenotipo metastásico de las células de cáncer de páncreas in vivo.
PKCζ regula la activación de STAT3
transductor de señal y activador de la transcripción-3 (STAT3) es un factor de transcripción que se integra numerosas señales extracelulares para regular procesos celulares que promueven el cáncer [25], [26]. la activación de STAT3 constitutiva es una característica de muchos cánceres humanos, incluyendo el cáncer de páncreas [27]. la activación de STAT3 promueve el fenotipo oncogénico de cáncer de páncreas, y la pérdida de STAT3 impide el desarrollo y la progresión del cáncer pancreático en un modelo de ratón de
Kras
cáncer de páncreas mediada [27], [28]. Además, la inhibición de la actividad STAT3 en células de cáncer pancreático también reduce la supervivencia celular, la invasión y el crecimiento del tumor [28], [29]. Dada la similitud sorprendente entre el fenotipo informado de la inhibición de STAT3 y el fenotipo que hemos observado con la inhibición de la PKCζ, nos preguntamos si la expresión PKCζ regula la actividad STAT3 en líneas celulares de cáncer de páncreas. Se observó una reducción significativa en la activación de STAT3, detectada como fosforilación de STAT3 en Tyr705, en células de cáncer pancreático que expresan PKCζ RNAi (Figuras 5A y S3A). Además, la activación de STAT3 se redujo significativamente en los tumores PKCζ RNAi en comparación con los tumores NT RNAi (Figura 5B), lo que indica que PKCζ regula la activación STAT3 en células de cáncer pancreático tanto in vitro como in vivo. Desde PKCζ también ha sido implicado en la regulación de la activación de ERK1 /2 en el cáncer y las células no cancerosas tipos [30], [31], [32], [33], se analizó el efecto de PKCζ RNAi en ERK1 /2 fosforilación en células de cáncer de páncreas humano. A diferencia de la fosforilación de STAT3, ERK1 /2 fosforilación no fue alterada por una reducción significativa en la expresión PKCζ (Figuras 5A y S3A) lo que sugiere que la expresión PKCζ no regula la señalización a través de la vía ERK1 /2 señalización.
A) La inhibición de la expresión PKCζ disminuye la activación constitutiva STAT3 (detectado como fosfo-STAT3 Y705), pero no ERK1 /2 de activación (detectado como fosfato ERK1 /2). El análisis por inmunotransferencia se realizó en el total de lisados celulares de células PKCζ RNAi (izquierda) y análisis de la expresión de la detección de inmunotransferencia Panc-1 NT y se llevó a cabo (a la derecha)
n = 3.
B) de detección de IHC Representante de p-STAT3 en los tumores pancreáticos ortotópico Panc-1 NT y PKCζ RNAi (izquierda), bar = 50 micras. El análisis cuantitativo de la tinción IHC pSTAT3 (derecha). C-E) El efecto inhibidor de STAT3 (S3I-201) en C) fosforilación de STAT3, D) el crecimiento independiente de anclaje en agar blando y E) la invasión celular a través de cámaras recubiertas con Matrigel. En todos los ensayos, S3I-201 se usó a 100 micras y un volumen igual de DMSO usado como diluyente control. Para el ensayo de invasión, las células se pre-trataron con S3I-201 o DMSO durante 48 horas antes de la iniciación del ensayo. Barras = promedio de 3 o más repeticiones +/- SD, y el gráfico es representativo de 2 o más experimentos independientes. * P & lt;. 0.05
inhibición STAT3 reduce el fenotipo transformado de las células de cáncer de páncreas
Para determinar si la activación STAT3 reducida puede ser responsable de algunos de los efectos de PKCζ KD, se evaluó el efecto de un inhibidor farmacológico de STAT3 en el fenotipo transformado de las células de cáncer de páncreas. El tratamiento de células de cáncer de páncreas con S3I-201, una pequeña molécula que interrumpe interacciones STAT3 SH2-fosfo-tirosina [34], la reducción de la activación de STAT3 (Figura 5C y S3B) y redujo significativamente el crecimiento (Figuras 5D) independiente de anclaje y la invasión celular ( Figura 5E y S3C), similar al efecto de la inhibición PKCζ. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la inhibición de la expresión PKCζ reduce la actividad STAT3 en células de cáncer pancreático, y que la actividad de expresión PKCζ y STAT3 regulan positivamente célula transformada crecimiento y la invasión del cáncer de páncreas.
STAT3 constitutivamente activa puede reconstituir el fenotipo transformado en células de cáncer de páncreas PKCζ RNAi
Para probar la hipótesis de que STAT3 es un efector aguas abajo crítico de PKCζ en las células de cáncer de páncreas, se evaluó si la expresión de un constructo STAT3 constitutivamente activa (STAT3-C) podría rescatar a los efectos de inhibición PKCζ en células Panc-1. células Panc-1 y NT PKCζ RNAi se infectaron con adenovirus que expresa la bandera de etiquetado, control (null) adenovirus STAT3-C o (Figura 6A). La expresión de STAT3-C se recuperó de manera significativa el crecimiento independiente de anclaje de células Panc-1 PKCζ RNAi, sin afectar significativamente el crecimiento independiente de anclaje de las células NT RNAi (Figura 6B). Además, la reducción del fenotipo invasión celular de las células PKCζ RNAi se recuperó de manera significativa por la expresión de STAT3-C (Figura 6C). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el aumento de la actividad STAT3 celular puede rescatar el fenotipo anti-oncogénica de células PKCζ RNAi, y demostrar que PKCζ media la transformación de células de cáncer de páncreas, al menos en parte, a través de regulación de la actividad STAT3.
Panc-1 células que expresan NT o PKCζ RNAi fueron infectadas con las construcciones adenovirales que expresan bien nulo (control), o constitutivamente activa, la bandera de etiquetado STAT3 (STAT3-C). A) El análisis por inmunotransferencia de p-STAT3, STAT3, bandera, PKCζ y expresión β-actina. Las células se evaluaron para B) crecimiento independiente de anclaje en agar blando y C) la invasión celular a través de cámaras recubiertos con Matrigel. Para cada gráfica: Barras = promedio de 3 o más repeticiones ± SD y el gráfico es representativo de 2 o más experimentos independientes. * Reducido significativamente en comparación con NT /null, p & lt; 0,05; ** Aumentado significativamente en comparación con los tratados con nula, p. & Lt; 0,05
Discusión
Los estudios funcionales han demostrado que el papel de PKCζ en la regulación del fenotipo del cáncer varía según el tipo de tumor, el modelo sistema y etapa de la enfermedad. Por ejemplo, la inhibición de la expresión PKCζ en una línea celular de cáncer de colon reduce la proliferación de tamaño vitro y tumor in vivo; sin embargo, la inhibición genética de PKCζ en el epitelio intestinal de ratón no afecta a la tumorigénesis en el modelo APCmin /+ ratón de la iniciación del cáncer intestinal y la progresión [7], [35]. En contraste, la inhibición genética de PKCζ en un modelo de ratón de
Kras
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inducida por la tumorigénesis de pulmón revela un papel supresor de tumor [4], mientras que la inhibición de la expresión de PKCζ en células de cáncer de pulmón no tiene efecto sobre transformado crecimiento in vitro [20]. En el presente estudio, se evaluó el papel específico de PKCζ en la biología de las células de cáncer de páncreas, el uso de RNAi PKC específicos de isotipo para inhibir la expresión PKCζ. Demostramos que PKCζ KD reduce la proliferación de células de cáncer de páncreas y la supervivencia celular in vitro. Además, muestran que PKCζ KD en células de cáncer de páncreas reduce significativamente el crecimiento transformado in vitro, correspondiente a una reducción significativa en el tamaño del tumor in vivo. Estos datos sugieren fuertemente que PKCζ se requiere para el mantenimiento del fenotipo transformado de las células de cáncer de páncreas.
PKCζ ha sido implicada en el fenotipo invasivo de cánceres humanos [36], [37], [38]. RNAi mediada, la inhibición específica de PKCζ reduce el cáncer de mama y la invasión celular de glioblastoma in vitro [37], [38] y reduce la invasión de células de cáncer de próstata in vitro y in vivo [36]. Curiosamente, cada uno de estos informes atributos PKCζ a una vía de señalización distinta invasivo, lo que sugiere un papel amplio para PKCζ en la invasión de células de cáncer [36], [37], [38]. En consonancia con el fenotipo observado en otros tipos de cáncer, se determinó que la inhibición de la expresión PKCζ no sólo inhibió el crecimiento transformado de células de cáncer pancreático, pero también reprimió su potencial invasivo in vitro. Además, PKCζ KD redujo significativamente la metástasis del tumor de páncreas, lo que indica que PKCζ regula invasión de células tumorales de páncreas in vivo, así como in vitro
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El valor pronóstico de la expresión PKCζ en el cáncer no está bien documentado. Sin embargo, varios informes recientes han implicado PKCζ como un predictor de mal pronóstico para los pacientes con cáncer. PKCζ alta predice pobre supervivencia específica de la enfermedad de los pacientes con sarcoma de tejidos blandos [39]. Del mismo modo, PKCζ es elevada en el cáncer de próstata, y la expresión de alto PKCζ predice pobre supervivencia de los pacientes de cáncer de próstata [36]. Se evaluó la expresión de PKCζ en el cáncer de páncreas, y determinamos que PKCζ fue claramente superior en un sub-conjunto de los cánceres de páncreas. Sin embargo, nuestro tamaño pequeño de la muestra junto con el mal pronóstico global de los pacientes con cáncer de páncreas impidió determinar un posible papel pronóstico de la expresión PKCζ. colecciones de tejidos en curso facilitará la investigación futura de la capacidad de expresión PKCζ para predecir el resultado en una cohorte más grande de pacientes con cáncer de páncreas.
Mientras que la expresión PKCζ se ha caracterizado recientemente a ser elevados y predecir la supervivencia pobres en varios tipos de cáncer [36 ], [39], se sabe poco acerca de la regulación de la expresión PKCζ. Sin embargo, PKCζ se ha demostrado para ser activado por varias vías de señalización conocidos para promover la señalización oncogénica en cáncer de páncreas. Fosfatidilinositol-3,4-5-trifosfato (PtdIns-3,4,5-P3), el producto de fosfoinosítido 3-quinasa, se puede unir directamente y activar PKCζ, y también activa PtdIns-3,4,5-P3-activado quinasa 1 mediada por la fosforilación dependiente de fosfoinosítido y la activación de PKCζ [40], [41], [42]. En cabeza y células de carcinoma de cuello escamoso, PKCζ es tirosina fosforilada y activada por el receptor del factor de crecimiento epidérmico [31]. Los estudios futuros se investigará si cualquiera de estas vías, tanto con frecuencia mal regulada en el cáncer de páncreas, modula PKCζ señalización en líneas celulares de cáncer de páncreas.
En contraste con nuestra observación de que la inhibición de la PKCζ reprime el crecimiento del tumor y la metástasis pancreática, la inhibición genética de PKCζ en
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inducida por tumores de pulmón promueve el crecimiento tumoral y la progresión [4]. El papel de supresión tumoral de PKCζ en K-ras mediada por la tumorigénesis de pulmón está mediada por la represión de la activación de STAT3 en las células tumorales [4].