Extracto
Las opciones de tratamiento para el cáncer de cuello uterino se basa principalmente en la etapa FIGO clínica y la evaluación postoperatoria de los parámetros de pronóstico, incluso el tumor de diámetro, parametrio y el compromiso de los ganglios linfáticos, vaso-invasión, la profundidad de la infiltración, y el tipo histológico. El objetivo de este estudio fue evaluar los cambios genómicos en tumores cervicales voluminosos y su relación con parámetros clínicos, el uso de polimorfismo de nucleótido único -análisis (SNP).
Células tumorales
Flow-ordenados y se extrajeron las células normales de pacientes emparejados de 81 tumores de cuello uterino voluminosos. Se realizaron ADN-índice (DI) de medición y todo el genoma SNP-análisis. Los datos fueron analizados para detectar alteraciones del número de copias (CNA) y el estado del balance alélica: LOH equilibrado, desequilibrado o puro, y su relación con parámetros clínicos
El DI varió de 0.92-2.56.. LOH puro se encuentra en ≥40% de las muestras en el cromosoma de armas 3p, 4p, 6p, 6q y 11q, las ganancias de NC en & gt; 20% en 1T, 3T, 5p, 8q y 20q, y pérdidas en 2q, 3p , 4p, 11q, 13q y. Más del 40% demostró un aumento en 3q. Se encontró que las únicas diferencias significativas entre los tipos histológicos (escamosas, adeno y adenoescamosos) en la proporción menor intensidad alelo (GUARIDA) (p = 0,035) y en el análisis CNA (p = 0,011). Más pérdidas se encuentran en el cromosoma 2q-brazo (FDR = 0,004) en tumores escamosos y más ganancias en 7p, 7q, y 9p en tumores adenoescamosos (FDR = 0,006, FDR = 0,004, y FDR = 0,029).
análisis del genoma entero de cáncer cervical voluminoso muestra cambios generalizados en el equilibrio alélica y CN. Los cambios genéticos en general y de la CNA en el cromosoma de armas específicas diferían entre los tipos histológicos. No se encontró relación con los parámetros clínicos que actualmente dictan la elección del tratamiento
Visto:. Van den Tillaart Sahm, Corver WE, Ruano Neto D, ter Haar NT, Goeman JJ, Trimbos JBMZ, et al. (2013) La pérdida de heterocigosidad y número de copia alteraciones en el flujo-Ordenada voluminosos Cáncer de cuello uterino. PLoS ONE 8 (7): e67414. doi: 10.1371 /journal.pone.0067414
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 21 Noviembre 2012; Aceptado: 20-may de 2013; Publicado: 9 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 van den Tillaart et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. D. Ruano Neto recibió fondos de subvención 93518025 de la Iniciativa Genómica Países Bajos (NGI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los factores de pronóstico para el cáncer de cuello de útero
el cáncer cervical es uno de los cánceres ginecológicos más frecuentes en todo el mundo. Tras el tratamiento quirúrgico de los tumores cervicales, factores pronósticos de la supervivencia incluyen los parámetros clínicos etapa FIGO, el diámetro del tumor, tumor en el parametria, los ganglios linfáticos pélvicos positivos tumorales, vaso-invasión, y la profundidad de infiltración. Tipo histológico también se relaciona con el pronóstico, y se evalúa tanto antes como después de la operación [1] - [4]. A pesar de que los parámetros pueden ser determinados en parte antes de la operación mediante el examen clínico, tratamiento de imágenes, o la evaluación patológica de la biopsia, la mayoría de los parámetros solo están definitivamente establecidos tras el examen patológico post-operatorio de especímenes quirúrgicos. La presencia o ausencia de estos factores es de relevancia pronóstica y por lo tanto se utiliza para seleccionar tanto el tratamiento primario, y para decidir si la quimioterapia adyuvante y /o radioterapia son necesarios.
El tratamiento quirúrgico se considera que es el tratamiento principal óptima para los tumores de pequeño diámetro del cuello del útero (& lt; 4 cm, FIGO etapa & lt; 1b2). tumores localmente extendidas (FIGO 2b o superior) son tratados principalmente por la quimio-radiación. Hay, sin embargo no acuerdo mundial sobre el tratamiento primario óptimo para el cáncer cervical voluminoso (diámetro & gt; 4 cm, FIGO ≥1b2-2b), aunque la radioterapia o la cirugía son opciones [5] - [13]. Recientemente, nuestro grupo informó de un posible factor pronóstico adicional para los tumores cervicales voluminosos. Los pacientes con forma de barril (extensión lateral ≥1.5 × extensión craneocaudal) tumores voluminosos mostraron una supervivencia global y libre de enfermedad empeora después del tratamiento quirúrgico, en comparación con exofítico (todos los demás), los tumores. tratamiento quirúrgico primario, en lugar de la radioterapia o la quimioterapia-radioterapia, se ha propuesto como el tratamiento óptimo para los pacientes con tumores voluminosos exofíticos [14].
La posibilidad de seleccionar subgrupos más homogéneos de pacientes con tumores de cuello uterino puede ayudar a la selección de la estrategia de tratamiento más adecuada para los pacientes individuales. La identificación de los pacientes con patrones genéticos específicos podría ser una manera de lograr este objetivo. Los cambios genéticos podrían evaluarse de manera objetiva, antes de la operación, en biopsias de tumores, lo que podría proporcionar una predicción más exacta de la etapa y el comportamiento clínico que el examen físico del paciente. Por otra parte, el perfil genético podría proporcionar información sobre los genes o vías responsables para el crecimiento tumoral y la metástasis.
Perfil genético
La progresión de las células normales al cáncer se acompaña de cambios en el ADN y los perfiles genéticos se han establecido desde hace varios tipos de cáncer. Estos perfiles se han determinado en gran medida el uso de arrayCGH, y por lo tanto se han limitado a copiar los cambios de numeración. En este estudio, hemos utilizado matrices de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) para determinar el perfil genético de las poblaciones de tumores clasificados por flujo. Este enfoque tiene la ventaja de también determinar los cambios específicos de alelo, además de alteraciones en el número copiar (CNA), en las células tumorales puros. Con el fin de incluir la pérdida de heterocigosidad (LOH) en el análisis, hemos desarrollado el enfoque en menor proporción de intensidad alelo (GUARIDA), que permite la evaluación del número de copias de los alelos específicos discreta (CN) para todos los lugares del genoma [15]. Este método permite la clasificación de la CN total de discreta ya que tanto la suma de dos alelos y como el estado de equilibrio, que a su vez se pueden dividir en 3 clases:. Equilibrada, desequilibrio y LOH
El análisis estadístico de las diferencias en los perfiles genéticos entre los grupos de tumores ha demostrado ser difícil. La naturaleza de los cambios genéticos en los tumores provoca una fuerte correlación entre las mediciones de las sondas vecinas, las correlaciones que no maneja adecuadamente en pruebas estadísticas de uso común. En este estudio se introduce un método estadístico basado en la prueba global [16], que realiza múltiples pruebas de corrección correctamente en la presencia de valores fuertemente correlacionados. Otra ventaja de la prueba global es que se puede poner a prueba la hipótesis de que los grupos de muestras son los mismos a nivel de todo el genoma, y puede hacer zoom en los cromosomas de armas cuando se encuentra una diferencia entre los grupos.
Objetivo del estudio
El propósito de este estudio fue identificar los cambios genéticos asociados con uno o más factores de pronóstico en pacientes con cáncer de cuello uterino. Nuestro enfoque consiste en utilizar el análisis de SNP gama de tejido tumoral FFPE clasificados por flujo de los cánceres cervicales voluminosos.
A nuestro entender, esta es la primera a gran escala, todo el genoma SNP estudio conjunto de esta etapa de los tumores cervicales, y ninguna publicación se ha descrito un perfil genómico de tumores de cuello uterino en base a la matriz de análisis SNP de tejido tumoral puro. Además, este es el primer estudio de todo el genoma SNP matriz de un gran grupo de tumores de cuello uterino voluminosos en relación a los cambios genéticos en el estado de equilibrio y CN, y su relación con factores pronósticos desfavorables.
Materiales y Métodos
muestras
el tejido de 107 carcinomas de cuello uterino, así como emparejado normal (no afectada) de endometrio y /o tejido de los ganglios linfáticos, se obtuvo del banco de tejidos FFPE del Departamento de Patología de la Universidad de Medicina de Leiden centro (LUMC). Las muestras fueron manejados de acuerdo con las directrices éticas médicas descritas en el Código correcto uso secundario de Tejidos Humanos establecida por la Federación Holandesa de Ciencias Médicas (www.federa.org). Nuestro grupo de estudio consistió en pacientes que viven en los Países Bajos y en Surinam. Todos los pacientes que se presentaron con voluminosos etapa FIGO ≥1b2-2b cáncer de cuello uterino y recibieron tratamiento quirúrgico primario en el LUMC entre enero de 1984 y noviembre de 2000, se incluyeron en el grupo de estudio. Un gran número de parámetros clínicos se han caracterizado en estos pacientes, pero para este estudio se elija para investigar siete parámetros clínicos conocidos por ser de valor pronóstico: el diámetro del tumor, el tipo histológico, parametrio, los ganglios linfáticos pélvicos, vaso-invasión, la infiltración profundidad, y el patrón de crecimiento. El patrón de crecimiento se definió como si la extensión lateral del tumor fue ≥1.5 forma de barril × la extensión craneocaudal del tumor; de lo contrario el tumor se clasificó como exofítico. tipificación histológica (escamosas, adeno, adenoescamoso, o tumores mixtos) se basó en la tinción histoquímica con H & amp; E, ácido periódico de Schiff (PAS) de reactivo, y azul Alcian para mucina detección. El uso de esta tinción adicional está bien establecido entre los patólogos [17]. FIGO etapa no se incluyó en los análisis ya que las diversas características postoperatorias se solapan con, y más precisa que las características que se utilizan para la estadificación preoperatoria FIGO.
preparación
Muestras de tejido
Parafina secciones tomadas de todas las muestras fueron H & amp; e manchadas y revisados por un patólogo (GJF). El nódulo tumoral fue marcado en la H & amp; E sección, que se utilizó como una guía para recortar el tejido normal de bloque de parafina antes de fluir estudio diagnóstico de citometría. El estado negativo tumor de bloques que contienen (ganglios linfáticos negativos, ya sea de tumor o tejido endometrial) tejido normal fue revisado por histología y confirmado. Las suspensiones celulares se prepararon para citometría de flujo, como se describe en detalle en otra parte [18], [19]. En pocas palabras, se tomaron seis a diez micras de 60 secciones de cada bloque de parafina. Las secciones fueron desparafinados y procesarse adicionalmente hasta que se obtuvo una suspensión celular. Las células se recogieron a continuación, se lavaron, se contaron y se almacenaron en hielo antes de su procesamiento posterior.
La inmunocitoquímica de las suspensiones celulares
La inmunocitoquímica se ha descrito en detalle en otra parte [18], [19]. Brevemente, se incubaron cinco millones de células en una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos contra queratina o vimentina. Se usaron los siguientes MAbs: anti-queratina MNF116 (DAKO, Glostrup, Dinamarca), anti-queratina AE1 /AE3 (Millipore-Chemicon, Billerica, MA), y V9-2b anti-vimentina (diluido 1:05) (anticuerpos para Aplicaciones de investigación BV, Gouda, Países Bajos). Las células se incubaron con FITC premezclada o reactivos secundarios RPE marcado (cabra F (Ab2) 'anti-ratón IgG1-FITC y de cabra F (Ab2)' anti-ratón de IgG2b-RPE [Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL]), y el ADN se marcó con DAPI (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Países Bajos) [20].
citometría de flujo y clasificación
el uso de un LSRII (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica) citómetro de flujo, una puerta se ha creado para recopilar eventos de células individuales 20000 queratina-positivas durante la adquisición. conjuntos de filtros estándar se utilizan para la detección de FITC, R-PE y la fluorescencia DAPI. Un archivo de datos contenía todos los eventos. Los Winlist 6.0 y 3.2.1 ModFit paquetes de software (Verity Software House, Inc., Topsham, ME) se utilizaron para el análisis de datos y el cálculo (DI) índice de ADN (mediana de G
0G
1 población de células tumorales fracción /mediana de G
0G
1 población de la fracción de células del estroma). Con el fin de celdas separadas tumorales de células genéticamente normales (tejido conectivo, lymphocyes y los vasos sanguíneos) [21], [22]. queratina-positivas y las células normales vimentina-positivas se recogieron por separado, utilizando un FACSAria fluyo-clasificador a 40 psi (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica). En los casos en citometría de flujo detecta más de una población de células tumorales de queratina-positivo, ambas poblaciones fueron ordenados de forma independiente. La población de ADN más frecuente fue seleccionado para someterse a análisis de SNP gama. Se llevó a cabo
aislamiento de ADN como se ha descrito anteriormente [23]. En los casos en que endometrio o tejido del ganglio linfático no estaba disponible, se utilizó el ADN de las células del estroma tumoral fracciones clasificadas como referencia [23].
SNP gama
El panel de la puerta de oro Vinculación V, que consiste de 4 matrices con un total de 6000 SNPs (Illumina, San Diego, EE.UU.), se utilizó para analizar el ADN derivado del tumor, junto con el ADN a partir de tejido /normal correspondiente no afectado. Se realizaron ensayos tal como se describe anteriormente [24]. La resolución de este ensayo es relativamente baja, pero en contraste con otros ensayos de SNP se puede utilizar con ADN derivado FFPE [24], [25]. Estos análisis de SNP sobre el tejido FFPE fueron ampliamente validado previamente mediante análisis FISH [15], [24] - [26]. Las muestras se procesaron en 6 lotes de 48 muestras, y las muestras del mismo paciente siempre se procesaron en el mismo lote. A 7
º lote se utilizó para repetir los ensayos de baja calidad. Las muestras fueron genotipo Illumina en BeadStudio 2.3. Los grupos de genotipo de referencia se derivan de las muestras normales en el conjunto de datos, y se extrajeron los genotipos y las intensidades de los alelos. El paquete beadarraySNP se utilizó para su posterior procesamiento de datos. Los pasos del análisis se muestran en la Figura 1. Los SNPs que se desviaron significativamente de equilibrio de Hardy-Weinberg (a un nivel de significación de 0,05, dividido por el número de SNPs analizados = 0,00001), y SNPs con un tipo de referencia inferior al 95% en los controles, fueron retirados para evitar la posibilidad de errores de genotipado. Todos los ensayos con una mediana de intensidad de debajo de 2.000 para uno de los alelos se rechazaron y se repitieron en lote 7. La normalización se subdivide en 4 pasos: I) normalizar intensidades para el efecto colorante - cuantil normalización se aplicó para hacer la distribución de las intensidades de ambos colorantes idénticos, II) por muestra entre cuantil normalización ensayo para igualar las diferencias de intensidad, III) dentro de la normalización de la muestra a la escala de la intensidad mediana de cada alelo a 1, IV) por SNP entre la normalización de la muestra utilizando las muestras de referencia (que escala la intensidad total de SNPs y corrige el sesgo específica de alelo mediante el uso de un modelo lineal entre la relación de B-alelo y la intensidad total). muestras normales de la misma se utilizaron para seleccionar los heterocigotos SNPs informativos. La madriguera se calculó para todos los SNPs informativos en las muestras tumorales. El valor de LAIR es básicamente la relación B de alelo, la relación de la intensidad de la B-alelo y la intensidad total, refleja en su eje de simetría a 0,5, y a escala en un valor entre 0 y 1. Esto hace que sea fácil de calcular promedios y permite la segmentación. Con el fin de identificar las regiones genómicas con idéntica CN y el equilibrio de estado, los datos fueron segmentados utilizando segmentación binaria circular en la configuración por defecto del paquete DNAcopy R [27]. Para cada tumor, primero se segmentó la intensidad de señal de cada cromosoma, seguido de un sub-segmentación de los segmentos obtenidos previamente de la madriguera [15]. Mediante la combinación de la CN continua (intensidad de la señal) y el valor de LAIR de un segmento de ADN con el índice muestra medida por citometría de flujo, se desarrolló un nuevo método de llamada que asigna un estado alélico de cada segmento [15]. En el estado actual de alelos estudio fue distinguido a lo largo de 2 dimensiones. Para cada segmento, CN discreta y un estado de equilibrio fue asignado. El CN discreto es una medida absoluta asignada a los segmentos de tal manera que los valores discretos NC promedio en todos los segmentos deben reflejar el índice de ADN de la muestra. El equilibrio entre los alelos se dividió en 3 posibles resultados: segmentos equilibradas - CN con el mismo para ambos alelos y un valor de LAIR cerca de 1; LOH - segmentos con un solo alelo presente y un valor de LAIR cerca de 0; segmentos desequilibradas - CN con diferente para los dos alelos y un valor de LAIR entre 0 y 1.
Los datos es preprocesado para obtener una calidad comprobada y valores normalizados de intensidad y guarida. Junto con el ADN-índice de éstas se interpretan en una escala discreta y categórica. La trama muestra incrustado intensidad normalizada como puntos en el panel superior, y guarida en el panel inferior como guiones. El procedimiento de segmentación ha dividido esta región en dos segmentos. El segmento de la izquierda tiene la copia número 1 con LOH. El estado alélico es A. El segmento de la derecha tiene la copia número 2 con el equilibrio. El estado alélico es AB.
El análisis estadístico
Los puntos de ruptura entre los segmentos son diferentes en cada muestra. Los puntos de corte de cada muestra se aplicaron a todas las muestras. Esto hace que las muestras comparables después de la segmentación se utilizó la prueba mundial para detectar diferencias en los cambios genéticos entre los grupos de pacientes en todo el nivel del genoma y en los brazos cromosómicos [16]. Hemos probado diferencias tanto en la CN continuas y discretas. El CN continua es una medida relativa; el promedio de la muestra es 1, independientemente de la DI. Discrete CN es una medida absoluta que representa el número de copias en un segmento genómico en cada célula de un tumor. El CN continua es la forma convencional de mirar CN; que investigaría aquí si es útil para mirar absoluta CN. GUARIDA como una medida continua de equilibrio alélica y el estado del balance como una medida discreta también se probaron. Las ganancias y pérdidas continuas NC se definieron como desviarse más del 15% de la media de la muestra. La prueba global permite el uso de factores de confusión. etnia fue utilizado como un factor de confusión para todas las pruebas, debido a que la constitución genética podría influir en la aparición de cambios cromosómicos. DI fue utilizado como un factor de confusión adicional en el análisis de continua CN, porque DI tiene una relación con las ganancias y pérdidas. La determinación de CN discreta ya tiene el DI en cuenta, y por lo tanto el uso de DI como un factor de confusión haría que este análisis de nuevo a una medida relativa en lugar de un absoluto (véase la figura S1 S2 en archivos). Etnia se define por la agrupación de los genotipos junto con muestras de HapMap de origen étnico conocido. Las pruebas fueron localizados aún más mediante la realización de la prueba global en todos los brazos cromosómicos de forma individual. Las diferencias entre los grupos fueron aceptados como significativos cuando la tasa de falso descubrimiento (FDR) fue inferior a 0,05 [28]
Todos nuestros SNP-datos se pueden encontrar en la expresión de genes de Omnibus:.. GSE29143 serie
Resultados
los datos clínicos
de los 107 pacientes con carcinoma de cuello uterino incluidos en el estudio, se obtuvo material de ADN suficiente para parejas normales /82 emparejado tumorales después de la clasificación de flujo. Una muestra se retiró después de la hibridación debido a la baja calidad de los datos. La Tabla 1 muestra resumir la información clínica sobre los 81 pacientes analizados, mientras que la Tabla S1 S1 en el archivo muestra los datos de pacientes individuales. Como no se encontraron 96,3% de los tumores que tienen un diámetro de tumor mayor de 40 mm, este parámetro no fue explorada más.
Análisis de Componentes Principales (PCA) se realizó utilizando las 4 poblaciones HapMap originales como referencia paneles, junto con genotipos obtenidos a partir de tejido normal de los pacientes. Tres grandes grupos genéticos podrían distinguirse en las cuatro poblaciones HapMap, con las poblaciones HapMap japonesas y chinas agrupar juntos. Guiados por esta agrupación, se clasificaron los pacientes en 3 grupos étnicos: europeos (EUR, n = 45) para los pacientes que se agrupan junto con la población CEU HapMap, África (AFR, n = 25) que el grupo junto con riales, y asiáticos ( ASI, n = 11) que el grupo junto con el CHB y JPT poblaciones. Para obtener información más detallada, véase la figura S1 S1 en el archivo.
Muestras
La mayoría de las 81 muestras de tumores emparejados (89%) podría ser emparejado con el tejido normal /no afectados. Como el tejido normal no estaba disponible en 9 casos, el ADN del tumor se en lugar emparejado con el ADN de las células del estroma normales obtenidos a partir del flujo de clasificación procedimiento [23]. clasificación de células detecta la presencia de la población de células más de un tumor en 8 casos. Para estos casos, se seleccionó la población de ADN de mayor prevalencia a someterse a análisis de matriz de SNP. El ADN-índice (DI) de las muestras clasificados por flujo varió de 0,92 a la 2.56. La figura 2 muestra el diagrama de densidad DI del grupo de pacientes.
Hay una distribución bimodal del índice de ADN con picos de alrededor de 1, y cerca de 2.
patrón genético general
Estado de Situación.
al mirar los patrones estatales equilibrio generados por el análisis de los SNP serie de datos, se puede observar que la LOH está presente en casi todas las regiones cromosómicas (Figura 3). En 28 de los 40 cromosomas de armas, más de 10% de los pacientes mostró LOH. LOH fue especialmente frecuente en el cromosoma 3p brazos, 4p, 6p, 6q, y 11q, donde se observó en más de 40% de todos los pacientes. Además de LOH todas las regiones cromosómicas muestran la presencia de los desequilibrios en al menos 10% de las muestras (Figura 3). El patrón de desequilibrio es algo complementario al patrón de LOH
Además de la altura de la gráfica, los colores indican la frecuencia de LOH.; negro: & gt; 10%, verde: & gt; 20%, azul: & gt; 0%, rojo: & gt; 40%. El grupo de equilibrado no se representa; que es el complemento de estos 2 grupos.
Copiar alteraciones numéricas.
CNA usando el CN continua puede ser visto por todo el genoma (Figura 4). Más del 20% de los pacientes muestran ganancias en el 1T, 3T, 5p, 8q, 20q y y pérdidas en los cromosomas 2q, 3p, 4p, 11q, 13q y. Ganancia en 3q se encontró en & gt;. El 40% de todas las muestras
Las ganancias se muestran en la parte superior de los ideogramas, mientras que las pérdidas se representan a continuación. Los colores indican la frecuencia dentro del conjunto de datos; negro: & gt; 10%, verde: & gt; 20%, azul: & gt; 30%, rojo: & gt; 40%. Se identificaron las ganancias y pérdidas cuando el CN continua se desvió más del 15% de la media de la muestra.
Relación entre los parámetros clínicos y los cambios genéticos
Estado de Situación.
Tabla 2A muestra los resultados de todo el análisis del genoma de Lair y el estado de equilibrio. Cuando se analizaron en conjunto los 22 autosomas y el cromosoma X, sólo el tipo histológico mostró diferencias estadísticamente significativas en el valor de LAIR (p = 0,035). No se observaron diferencias entre los diferentes parámetros clínicos en el estado de equilibrio (p = 0,050). Centrándose en los brazos cromosómicos individualmente mostraron que la diferencia entre los grupos histológicos no podía atribuirse a un brazo del cromosoma específico.
Copiar número alteraciones.
Tabla 2B muestra el resultado de la totalidad El análisis del genoma de los cambios en la CN. valores continuos NC mostraron diferencias estadísticamente significativas sólo para los tipos histológicos (p = 0,011). La prueba para discreta CN no fue estadísticamente significativa (p = 0,363). Cuando se añade DI como un factor de confusión para el análisis de discreta CN la diferencia entre tipos histológicos es significativa (p = 0,019), los perfiles NC discretas de pacientes con y sin metástasis ganglionares fueron significativamente diferentes (p = 0,032), y aquí el prueba para continuo CN no fue significativa (p = 0,614). La inclusión de DI como un factor de confusión en la prueba para discreta CN ahora no muestra diferencias más (p = 0,637). Véase también la figura S1 S3 en Archivo. Para continua CN las pruebas muestran resultados comparables con o sin inclusión de DI como un factor de confusión (datos no mostrados). A continuación, el zoom en los cromosomas de armas individuales en el análisis de los parámetros clínicos que mostraron una diferencia. tumores escamosos mostraron mayores pérdidas en 2q (FDR = 0,004), mientras que se encontró que los tumores adenoescamosos tener más ganancias en 7p, 7q, y 9p (FDR = 0,006, FDR = 0,004, y FDR = 0,029, respectivamente). Para discreta CN, las diferencias entre los grupos con y sin afectación de los ganglios linfáticos no pueden atribuirse a cualquiera de los brazos cromosómicos en particular. La Figura 5 muestra las diferencias en continua CN para el tipo histológico de los diferentes brazos cromosómicos.
Las ganancias se muestran en la parte superior de los ideogramas, mientras que las pérdidas se representan a continuación. Rojo: tumores escamosos, verde: adenocarcinoma + de tipo mixto, azul: tumores adenoescamosos. El adenocarcinoma y el tipo mixto se combinaron debido al bajo número de muestras en estos grupos.
Discusión
Utilizando el análisis de SNP gama, hemos demostrado extensa LOH en todo el genoma y los cambios en CN cáncer cervical voluminoso. Hasta donde sabemos, no hay estudios previos han aplicado perfil genético de todo el genoma de un gran número de cánceres de cuello uterino voluminosos (FIGO etapa 1b2-2b) tales.
El análisis de la relación entre los cambios genéticos y los factores pronósticos histológicos tipo, la profundidad de infiltración, los ganglios linfáticos, la extensión a la parametria, vaso-invasión, y el patrón de crecimiento reveló una diferencia estadísticamente significativa en el análisis de la discreta CN entre los grupos con y sin compromiso de los ganglios linfáticos, y una relación entre el tipo histológico y cambios Lair y continua CN. A pesar de la discreta CN no mostró diferencias entre los diferentes tipos histológicos, se observó que cuando se utilizó el índice de ADN como un factor de confusión en el análisis se restauró la diferencia significativa entre los grupos histológicos (p-valor va desde 0,363 a la 0,019). Esto significa que los valores discretos NC contienen suficiente información para distinguir los grupos, pero que los cambios relativos en el ADN en comparación con el contenido de ADN de una célula promedio son más importantes para la diferencia entre los grupos histológicos que el recuento de alelo absoluta.
con el fin de especificar los cambios genéticos que contribuyen a las diferencias en los parámetros clínicos, se analizaron los cromosomas de armas de forma individual. En el análisis de los cambios continuos NC, los carcinomas escamosos de grupos histológicos mostraron un aumento estadísticamente significativo en la pérdida de 2q, mientras que los carcinomas adenoescamosos mostraron más ganancias en 7p, 7q, y 9p. Las diferencias estadísticas en estas 4 regiones son comparables, pero la diferencia numérica es más pronunciada para el cromosoma 2q, donde alrededor del 10% de los carcinomas adenoescamosos muestra la pérdida, pero más del 40% de los carcinomas escamosos muestra la pérdida. A pesar de toda la diferencia en el genoma discreta CN entre los pacientes con y sin afectación de los ganglios linfáticos, no pudimos enlazar esta diferencia a un brazo cromosómico específico. Por lo tanto, esta diferencia no puede ser utilizado para extraer un parámetro clínico
CNA fueron encontrados en estudios previos utilizando clásica CGH-array, que examina sólo los cambios continuos NC (ver Tabla S1 S2 en Archivo) [29] -. [ ,,,0],39]. Como puede verse en la Tabla, las ganancias que se encontraron fueron reportadas previamente:
También se encontraron Beneficios en 1q en 8 de los 11 estudios incluidos, en 3q frecuencia en todos los estudios, en 5p en 5 de los 11 estudios, en 8q en 3 de los otros estudios, y en 20q en 6 estudios. Las pérdidas en el 2T fueron reportados en 5 de los otros 11 estudios, en 3p en 8 de las 11, en 4p en 6, en 11q en 6, y en 13q en 8 de los otros estudios. Todos nuestros hallazgos fueron encontrados previamente por Rao et al., Y todos menos uno por Lando et al., Aunque también se han encontrado cambios adicionales en otras localizaciones en estos estudios. Esto podría explicarse por la inclusión de los tumores con un mayor estadio FIGO en estos estudios.
Algunos de los estudios también investigaron la relación entre los parámetros clínicos y los cambios genéticos en el cáncer de cuello de útero (ver Tabla S1 S2 en Archivo) [ ,,,0],29], [30], [33], [34], [36]. Rao et al. no encontraron diferencias entre los tumores escamosos y adeno etapa 1b-4b. Esto puede ser debido al pequeño número de adenocarcinomas incluidos (5 adenocarcinomas y 72 carcinomas escamosos) [34]. No hubo tumores adenoescamosos en este grupo. En un análisis de los tumores de cuello uterino etapa 1b-3b, se marchita y col. informaron significativamente más ganancias en 9 tumores escamosos en comparación con 7 adenocarcinomas. ganancias más altas se encontraron predominantemente en 3q [36], aunque el método se utiliza para definir el tipo histológico no se describió. Las ubicaciones de las diferencias en las alteraciones genéticas entre los carcinomas escamosos y adenoescamosos en nuestro estudio no coinciden con los hallazgos de marchitamiento y col., Pero no hubo tumores adenoescamosos en este grupo.
La diferencia en los resultados globales entre nuestra y estudios previos pueden explicarse por las diferencias en estadio FIGO, tamaño de la muestra, y las técnicas de tinción para discriminar el tipo histológico. El grupo de tumores que hemos utilizado no fue analizado previamente en la literatura, y, a excepción de los ganglios linfáticos, los parámetros clínicos que analizamos fueron estudiados antes en sólo 2 de los otros 11 estudios (Rao et al., Y se marchita y col. ). La dilución causada por el uso de tejido tumoral en lugar de las células tumorales puros también puede explicar las diferencias en los resultados
.
La importancia pronóstica de tipo histológico sigue siendo un objeto de debate y no se utiliza actualmente para el tratamiento de elección primaria o adyuvante [ ,,,0],1] - [4], [40] - [42]. Los resultados contradictorios de estos estudios sobre el efecto de tipo histológico en el comportamiento del tumor y la supervivencia del paciente también pueden ser debido a diferencias en la clasificación de los tumores, en los que no se aplicó la tinción específica (PAS y azul Alcian). Se aconseja a los futuros estudios sobre las alteraciones genómicas de tomar los diferentes perfiles genéticos de los tipos histológicos en consideración
.
Las regiones con las diferencias más prominentes contienen muchos genes. El objetivo de este estudio era encontrar parámetros pre-quirúrgicos adicionales que se podrían utilizar para la elección del tratamiento, sin saber el gen causante. Este tema merece una mayor investigación.
El SNP gama utilizada en este estudio consistió en 6000 SNP marcadores distribuidos uniformemente a lo largo del genoma, y el conjunto fue optimizado para tener una mayor frecuencia menor alelo en la población caucásica (Europea) . Como consecuencia, el número medio de sondas informativos fue mayor para los pacientes caucásicos (2139 SNP informativos) que para el (1712) de los pacientes de Asia y África (1796) y. Esto puede dar lugar a una subestimación de los cambios genéticos que tienen lugar en el cáncer de cuello uterino en estas poblaciones. Aunque hubiera sido interesante comparar los cambios genéticos y su relación con parámetros clínicos por su origen étnico, los subgrupos son demasiado pequeños para permitir esto.
Nuestros resultados revelaron cambios genéticos relacionados con el tipo histológico, un parámetro clínico no está utilizado para la elección del tratamiento. Nuestro análisis no mostró relación de los cambios genéticos en los parámetros clínicos que podrían ser usados para predecir las características de pronóstico post-operatorias desfavorables o seleccionar subgrupos de pacientes. Parece que, en la actualidad, la mejor evaluación de los factores pronósticos todavía proviene de los hallazgos pre, intra y postoperatorias del oncólogo ginecológico y el patólogo. Como las diferencias en alteraciones del ADN entre los tumores de diferentes tipos histológicos pueden tener un impacto en el comportamiento del tumor, la respuesta al tratamiento y la supervivencia, la investigación futura debe incluir grupos de pacientes más grandes, y las técnicas de tinción de uso que pueden distinguir de forma fiable el tipo histológico.
Apoyo información
archivo S1.
Figura S1, Clasificación de origen étnico del paciente en relación con las poblaciones HapMap.