Extracto
Las observaciones clínicas y modelos de ratón han sugerido que la inflamación puede ser pro-tumorigénicos. Desde quimiocinas son críticos en el tráfico de leucocitos, la hipótesis de que las quimiocinas desempeñan papeles esenciales en los cánceres asociados con la inflamación. La detección de 37 quimiocinas en líneas celulares de cáncer de próstata y xenoinjertos CXCL16, el ligando para el receptor de CXCR6 reveladas, como la quimiocina más expresado constantemente. La inmunohistoquímica y /o inmunofluorescencia y microscopía confocal de 121 especímenes de próstata humanos mostraron que CXCL16 y CXCR6 se co-expresan, tanto en las células cancerosas de la próstata y las células T adyacentes. Los niveles de expresión de CXCL16 y CXCR6 en las células cancerosas correlacionados con las características de mal pronóstico, incluyendo de etapa alta y de alto grado, y la expresión también se correlacionó con cambios post-inflamatorias en el estroma del cáncer tal como se revela por la pérdida de actina de músculo liso alfa. Por otra parte, CXCL16 mejora el crecimiento del cáncer CXCR6 que expresan y las células CD4 T primarias. Se estudió la expresión de CXCL16 en un 461 ejemplares adicionales que cubren 12 tipos de tumores, y se encontró que CXCL16 se expresa en múltiples cánceres humanos asociados con la inflamación. Nuestro estudio es el primero en describir la expresión de CXCL16 /CXCR6 tanto en células de cáncer y las células T adyacentes en los seres humanos, y para demostrar correlaciones entre CXCL16 y CXCR6 vs. características pobres tanto pronósticos y cambios reactivos en estoma cáncer. En conjunto, nuestros datos sugieren que CXCL16 y CXCR6 pueden marcar los cánceres que surgen en un medio inflamatorio y mediar los efectos pro-tumorigénicas de la inflamación a través de efectos directos sobre el crecimiento de células cancerosas y mediante la inducción de la migración y proliferación de leucocitos asociado a un tumor.
Visto: Darash-Yahana M, Gillespie JW, Hewitt SM, Chen Y-YK, Maeda S, Stein I, et al. (2009) la quimiocina CXCL16 y su receptor, CXCR6, como marcadores y promotores de cánceres asociados con la inflamación. PLoS ONE 4 (8): e6695. doi: 10.1371 /journal.pone.0006695
Editor: Derya Unutmaz, Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Abril 2009; Aceptado: 21 de julio de 2009; Publicado: 19 Agosto, 2009
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Financiación:. Esta investigación fue financiada en parte por el Programa de investigación Intramural del Instituto Nacional de Salud, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y el Instituto Nacional del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
recientes modelos de ratón han hecho un vínculo funcional entre el cáncer y la inflamación [1] - [3], proporcionando evidencia de una actividad promotora de tumores para los leucocitos como se sugiere originalmente por Rudolf Virchow [4], [5]. cáncer de próstata humano se ha postulado que surgen de los procesos precancerosos asociados con la inflamación, tales como la atrofia inflamatoria proliferativa (PIA) [6], que son lesiones que se encuentran adyacente al cáncer de próstata que se proponen para dar lugar a neoplasia intraepitelial prostática (PIN) o cáncer [ ,,,0],7]
Entre los factores importantes para la inflamación son quimiocinas -. citocinas quimiotácticas que median el reclutamiento de leucocitos [8]. papeles diversos se ha informado de quimiocinas en la biología del tumor, incluyendo los efectos directos sobre las células de cáncer, tales como la transformación, la supervivencia y la proliferación, y los efectos indirectos, como en la angiogénesis y en el reclutamiento de leucocitos a los sitios tumorales [9] - [11] . En vista de la reciente evidencia de posible actividad pro-tumorigénico de los leucocitos, la hipótesis de que las quimiocinas inflamatorias, ya sea producida por las células tumorales o por los leucocitos asociado a un tumor, podría, en contra de el punto de vista estándar, contribuir a la progresión maligna mediante la mejora de reclutamiento de leucocitos .
en los estudios descritos a continuación, una pantalla para la expresión de quimiocinas en 37 líneas celulares de cáncer de próstata y xenoinjertos reveló la expresión de alto nivel de CXCL16, una quimiocina inusual que existe tanto transmembrana y formas solubles [12], [13], y que también puede funcionar como un receptor scavenger para la lipoproteína de bacterias y oxidado [14]. expresión CXCL16 se ha asociado con una serie de enfermedades inflamatorias humanas que incluyen artritis reumatoide [15], [16], las enfermedades pulmonares intersticiales [17], [18], aterosclerosis [19] - [23], enfermedad de la arteria coronaria [24], [25] y el hígado lesiones [26] - [30]. El receptor de CXCL16, CXCR6, se ha informado que se expresa en las células Th1 [31], en los linfocitos infiltrantes de tumores [32], y en una variedad de leucocitos en sitios de tejido inflamado [33], [34], y puede servir como una co-receptor para el VIH-1 [32], [35].
Nuestro estudio sugiere un papel directo para CXCL16-CXCR6 sobre el cáncer de próstata mediante la demostración de co-localización de CXCL16 y CXCR6 en las células cancerosas, la búsqueda de correlaciones positivas significativas entre la expresión de CXCL16 y CXCR6 vs. el estadio y el grado de cáncer de próstata, y que muestra que CXCL16 puede estimular el crecimiento de líneas celulares de cáncer de próstata transfectadas para expresar CXCR6.
Nuestros estudios sobre la relación entre CXCL16 /CXCR6, inflamación y cáncer muestran que CXCL16 está regulado en lesiones pre-neoplásicas asociadas con la inflamación, que la expresión de CXCL16 y CXCR6 puede ser inducida en el epitelio de la próstata por citoquinas inflamatorias, y que CXCL16 /CXCR6 son más altos en las células de cáncer de próstata rodeadas por, es decir estroma post-inflamatoria reactiva. También puso de manifiesto que las células T adyacentes a las células cancerosas expresan CXCL16 /CXCR6, que CXCL16 se produce preferentemente por CD4
+ CXCR6 + células T
, y que CXCL16 podemos aumentar la proliferación de células T. Finalmente demostramos CXCL16 en varios cánceres humanos asociados con la inflamación. Juntos, nuestros datos sugieren que CXCL16 y CXCR6 pueden contribuir a la progresión tumoral directamente a través de efectos sobre el crecimiento de células de cáncer, e indirectamente, mediante la mejora de reclutamiento de leucocitos y la proliferación y las interacciones entre leucocitos y células pre-malignas /malignas.
Resultados
células prostáticas malignas expresan CXCL16 y CXCR6
con el fin de investigar los papeles de quimiocinas en el cáncer de próstata, se proyectará líneas celulares de cáncer de próstata y xenoinjertos para la expresión de ARNm para 37 quimiocinas, y encontró que el ARNm para CXCL16 fue el expresado más consistente (Figura 1A, B). expresión en la superficie celular de CXCL16 fue encontrado el PC3, DU145 y 22Rv1 líneas celulares de próstata (Figura 1C). El análisis inmunohistoquímico de tejido prostático mostró poca o ninguna tinción para CXCL16 y baja tinción para su receptor, CXCR6 en el epitelio de próstata humano normal, pero la expresión prominente en el cáncer (Figura 1D). Además, una correlación entre los niveles de expresión de CXCL16 y CXCR6 se encontró mediante el análisis de una matriz de cuarenta casos de cáncer de próstata, y CXCL16 y CXCR6 puede demostrar ser co-expresado en las células cancerosas individuales por microscopía de inmunofluorescencia confocal (Figura 1E) .
(a) La expresión de ARNm para 37 quimiocinas se estudió por RT-PCR en xenoinjertos (CWR22, DESEO PC14) y las líneas de células tumorales de próstata (PC3, DU145, LNCaP). Se muestran los nombres sistemáticos y no sistemáticos de quimiocinas. Los amplicones fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa y la inspección visual después de la tinción con bromuro de etidio. Las secuencias de los cebadores están disponibles bajo petición. Los niveles de expresión se evaluaron como sigue: ninguna expresión (-), una baja expresión (- +), la expresión moderada (+), y de alta expresión (++). Dependiendo de la quimiocina, el análisis se realiza de una a cuatro veces. expresión (B) mRNA de quimiocinas en líneas celulares de cáncer de próstata. La expresión de ARNm para 14 quimiocinas se estudió por tiempo real de RT-PCR en líneas de células tumorales de próstata (PC3 cuatro, DU145, LNCaP, 22Rv1). El valor de 2
-ΔCT se calculó y luego normalizó al número más alto para una línea celular dada, que se le dio el valor de 100, donde Ct = CT (quimiocinas) -CT (GAPDH). Los números son la media de dos determinaciones de un experimento representativo de dos realizados. Análisis de citometría de (C) de flujo de la expresión en superficie de CXCL16 en líneas celulares de cáncer de próstata. PC3, las células se incubaron 22Rv1 y DU145 y sin anticuerpo primario (sombreado negro), con la cabra CCl4 anti-humano como un control adicional (luz línea gris), o con la cabra CXCL16 (línea gris oscura) anti-humano y luego teñidas con anti conejo -goat IgG-FITC. Los datos provienen de un experimento representativo de tres realizados. (D) La tinción para CXCL16 y CXCR6 en piezas de prostatectomía utilizando DAB (marrón) para la detección se muestra para: normal de la próstata y el cáncer de próstata. Los paneles son representativos de más de 80 casos de cáncer de próstata examinados. Cada panel incluye un amplificador H &; E mancha en la izquierda. Las matrices (E) que contiene el tejido de cáncer de próstata de 40 pacientes fueron teñidos para CXCL16 y CXCR6. Se calcularon fueron analizadas (I) Las muestras como se describe en Materiales y Métodos, agrupados de acuerdo con las puntuaciones de CXCL16 en el eje X (n = muestras en cada grupo CXCL16), y la media de las puntuaciones para la expresión CXCR6. Las barras de error muestran SEM. Barras transversales indican las comparaciones que son significativos. *, P & lt; 0,05 y **, p & lt; 0,01. (II) La inmunofluorescencia y confocal de imágenes de una sección que muestra las células de cáncer de próstata muestra anti-CXCL16 (488 tiramida) como verde, anti-CXCR6 (594 tiramida) como el rojo, y la tinción nuclear con Hoechst 33258 en azul. Doble tinción en amarillo muestra co-localización. Los paneles son representativos de más de 15 casos de cáncer de próstata. magnificaciones originales se observan en estas y todas las microfotografías posteriores.
La expresión de CXCL16 y CXCR6 se correlaciona con la etapa del cáncer y el grado
La etapa (I-IV) y grado (puntuación de Gleason) del cáncer de próstata se determinan al momento del diagnóstico, y fueron reportados por el proveedor de los casos utilizados en las matrices. etapa superior corresponde a una mayor extensión anatómica del cáncer, y la puntuación de Gleason se describen las características histológicas que se correlacionan con el resultado clínico. Puntuación de Gleason de 2-4 son de baja calidad, las puntuaciones de 5-7 son de grado moderado, y las puntuaciones de 8-10 son el cáncer de próstata de alto grado. El análisis de la matriz 40 de los casos para los niveles de tinción para CXCL16 y CXCR6 reveló que su expresión por las células cancerosas correlacionados tanto con el cáncer de próstata de alto grado (Figura 2A) y en estadio alto.
Las matrices (A) que contiene el tejido de cáncer de próstata de 40 pacientes fueron teñidos para CXCL16 y CXCR6. Las muestras se obtuvieron para la expresión CXCL16 y CXCR6 como se describe en Materiales y Métodos. Las muestras se agrupan de acuerdo con el escenario o puntuación de Gleason (ejes X) según lo determinado por el proveedor, y las puntuaciones medias para CXCL16 y expresión CXCR6 se calcularon. Se muestra el número de muestras (n) en cada fase de grupos o puntuación de Gleason. Las barras de error muestran SEM. Barras transversales indican las comparaciones que son significativos. *, P & lt; 0,05 y ***, p & lt; 0,001. (B) células PC3 se transfectaron con el plásmido CXCR6-YFP, se cultivaron durante 48 horas sin quimioquinas (control, ctrl) o con 0,05 a 5 g CXCL16 /ml y el número de CXCR6-YFP
+ (R6YFP
+ ) vs. CXCR6YFP
- (R6YFP
- se contaron las células) como se describe en Materiales y Métodos. Los valores se normalizaron con el control, muestra sin tratar para producir la diferencia de veces en el número de células. Las barras muestran las medias ± SEM de tres experimentos combinados. **, P & lt; 0,01 y ***, p & lt; 0,001 vs. valores de control. (C) Después de la transfección con el plásmido CXCR6-YFP, las células PC3 se cultivaron como en (B), sin o con 5 mg CXCL16 /ml. Panel izquierdo, apertura de puerta se muestra para separar las células no tratadas y tratadas CXCL16-en "baja" (L) o "alta" (H) para CXCR6-YFP. se muestran los porcentajes de células en las altas puertas. Un experimento representativo se muestra de tres realizados. Panel derecho, CXCR6-YFP
+ bajo (CXCR6 + baja) y CXCR6-YFP
+ de alta células de (CXCR6 + alto) CXCL16-tratadas y se contaron los cultivos de control después de 48 horas como en (B). Se combinaron los datos de tres experimentos. *, P & lt; 0,05 y ***, p & lt; 0,001 frente a células no tratadas. (D) muestra la imagen confocal anti-CXCL16 o anti-CXCR6 (488 tiramida) como verde, anti-Ki67 (594 tiramida) como el rojo, y la tinción nuclear con Hoechst 33258 en azul. Panel es representativa de más de 15 casos.
El papel de CXCL16 /CXCR6 en la proliferación de células de cáncer de próstata
La co-expresión de CXCL16 y CXCR6 en las células del cáncer de próstata, y su correlación con la etapa del cáncer y grado, sugirió que el ligando y el receptor pueden aumentar la proliferación a través de una vía autocrina. Para investigar esta posibilidad, transfectadas las células PC3 con un plásmido CXCR6-YFP que codifica una proteína de fusión C-terminal CXCR6 con una proteína fluorescente de color amarillo-verde mejorada (YFP), y se incubaron las células con CXCL16. Como se muestra en la Figura 2B, el número de CXCR6-YFP
+ células aumentaron, frente a control CXCR6-YFP
- células, como una función de la concentración de CXCL16. También se analizó la relación entre el nivel de expresión de CXCR6-YFP y la respuesta a CXCL16. Se encontró que mientras que las células que expresan los más altos niveles de CXCR6-YFP fueron los más sensibles a CXCL16, CXCL16 aumentó la proliferación incluso de aquellas células que eran CXCR6-YFP
baja (Figura 2C). De acuerdo con estos datos in vitro, las células cancerosas que expresan Ki67, un marcador celular para la proliferación, expresan también tanto CXCL16 y CXCR6 (Figura 2D).
Expresión de CXCL16 /CXCR6 se asocia con inflamación
el análisis inmunohistoquímico de múltiples especímenes de prostatectomías radicales mostró expresión prominente de CXCL16 y CXCR6 en prostatitis crónica y en la atrofia con prostatitis crónica asociada (PIA), así como en la neoplasia intraepitelial prostática (PIN) y el cáncer, lo que sugiere que la expresión de CXCL16 y CXCR6 en células epiteliales de la próstata está relacionado con la inflamación, además de cualquier forma de asociación con la malignidad per se (Figura 3A). Hemos investigado esta relación in vitro mediante el tratamiento de cultivos de epitelio (PrEC) y las células del estroma (PRSC) de próstatas normales con citoquinas inflamatorias. TNF-α y IFN-γ, particularmente en combinación, inducida CXCL16 mRNA y la secreción de CXCL16 por PrEC (pero las células no estromales) (Figura 3B, C) - y llevado a dramático sobre regulación en PrEC del ARNm para CXCR6 (Figura 3D .)
(a) La tinción para CXCL16 y CXCR6 en piezas de prostatectomía utilizando DAB (marrón) para la detección se muestra para: prostatitis crónica, PIA y PIN. Los paneles son representativos de más de 80 casos de cáncer de próstata examinados. Cada panel incluye un amplificador H &; E mancha en la izquierda. (B) CXCL16 secretada por las células primarias normales epiteliales (PrEC) y las células del estroma (PRSC), y el DU145 y líneas de células PC3 se midió 48 horas después de la ausencia de tratamiento (control), o el tratamiento con 5 ng /ml de IFN-γ y 0.5 g /ml de TNF-α por sí solo y en combinación. Las barras muestran las medias ± SEM de los pocillos por duplicado, de un experimento representativo de tres realizados para cada uno de los tres donantes (D1-D3). *, P & lt; 0,05 y **, p & lt; 0,01 frente a células no tratadas. (C) la expresión de CXCL16 mRNA en PrEC de tres donantes y dos líneas de células de tumor de próstata (DU145 y PC3) tratados con 5 ng /ml de IFN-γ y 0,5 g /ml de TNF-α solo y en combinación se analizaron usando tiempo real RT -PCR. Los valores se normalizaron mediante el establecimiento de la muestra de control con la expresión más baja igual a 1. Cada barra representa la media ± SEM obtiene a partir de pocillos por duplicado, a partir de un experimento representativo de tres realizados. **, P & lt; 0,01 frente a células no tratadas. (D) la expresión de mRNA en CXCR6 PrEC de tres donantes tratados con 5 ng /ml de IFN-γ y 0,5 mg /ml de TNF-α solo y en combinación fueron analizados utilizando en tiempo real de RT-PCR. Los valores se normalizaron mediante el establecimiento de la muestra con la expresión más baja igual a 1. **, p & lt; 0,01 frente a células no tratadas. (E) Cada fila contiene secciones seriadas de las mismas regiones de las piezas de prostatectomía teñidas utilizando DAB (marrón) para αSMA, CXCL16, y CXCR6 incluyendo un H & amp; E mancha en la izquierda. Los paneles son representativos de más de 120 especímenes de próstata. (F) se desliza por separado de las matrices que contienen el tejido prostático de 40 pacientes se tiñeron para αSMA, CXCL16 y CXCR6 y obtuvo tal como se describe en Material y Métodos para αSMA en el estroma y CXCL16 y CXCR6 en células de cáncer. Las muestras se agrupan en función de las puntuaciones para CXCL16 o CXCR6 (n = muestras en cada grupo), y la media se calcularon las puntuaciones para αSMA en el estroma. Los datos se muestran y se analizaron como en la Fig. 1E.I. *, P. & Lt; 0,05
Además de la asociación de CXCL16 /CXCR6 con infiltrados inflamatorios en la próstata, nuestra impresión inicial del análisis de más de 80 casos de cáncer de próstata fue que la expresión de CXCL16 fue más alta en células de cáncer rodeadas de estroma reactivo. Estroma se describe como "reactivo" si muestra aumentos en miofibroblastos, fibroblastos para suavizar la relación muscular y la densidad vascular local [36]. Esto ocurre después de la inflamación, e identifica el cáncer, ahora relativamente pobre en células inflamatorias, que han surgido en un microambiente inflamatorio. Hemos confirmado nuestra impresión inicial mediante la tinción de secciones en serie para CXCL16, CXCR6 y alfa actina de músculo liso (α-SMA), un marcador de células del músculo liso, que se pierden de estroma reactivo. Hemos encontrado una asociación entre la pérdida de las células del músculo liso y de alta expresión de CXCL16 y CXCR6 (Figura 3E), lo cual fue confirmado al anotar muestras de la matriz 40 de los casos para α-SMA, CXCL16, y CXCR6 (Figura 3F). Estos datos apoyan la asociación entre la expresión de CXCL16 y CXCR6 y evidencia de inflamación previa en el microambiente tumoral. En conjunto, los datos de la Figura 3 indican una fuerte correlación entre la expresión de CXCL16 /CXCR6 y la inflamación en todas las etapas en la evolución del cáncer de próstata.
Un papel para CXCL16 /CXCR6 en las interacciones entre las células cancerosas y las células T
Los posibles efectos directos de CXCL16 /CXCR6 en las células de cáncer de próstata no obstante, debido a CXCR6 se describe mejor como un receptor de quimioquinas de las células T, que investigaron las actividades de CXCL16 /CXCR6 en las células T asociado con cáncer de próstata que podrían contribuir indirectamente a la la formación y el crecimiento del cáncer. La tinción inmunofluorescente reveló que tanto CXCL16 y CXCR6 se expresan en CD3
+ células adyacentes a las células cancerosas (Figura 4A). De interés, se encontró que algunos CD3
+ células también teñidas para Ki67 (Figura 4B), lo que demuestra la proliferación de células T en el sitio del tumor. Por otra parte, la doble tinción de Ki67 y CXCR6 reveló células inflamatorias que fueron positivos para ambos (Figura 4C).
(A, B) de formación de imágenes confocal muestra anti-CXCL16 (A, panel izquierdo) o anti-CXCR6 (A , panel derecho) o anti-Ki67 (B) como verde (488 tiramida), anti-CD3 (594 tiramida) como el rojo, y la tinción nuclear con Hoechst 33258 en azul. Doble tinción en amarillo muestra co-localización. En (A), las flechas apuntan a las células cancerosas y las células T. Los paneles son representativos de más de 15 casos por cada doble mancha. (C) La tinción de Ki67 y CXCR6 en una región de la prostatitis usando DAB (marrón, dos paneles de la izquierda) o inmunofluorescencia (panel de la derecha) para la detección. de formación de imágenes confocal muestra anti-CXCR6 como verde (488 tiramida) y anti-Ki67 como rojo (594 tiramida), y la tinción nuclear con Hoechst 33258 como azul. Panel es representativa de más de 15 casos.
Hemos examinado si CXCL16 y CXCR6 podrían funcionar de forma autocrina para aumentar la proliferación de células T análoga a los efectos sobre las células cancerosas. Para determinar si o no CXCL16 podría ser producido por CXCR6
+ células, que se encuentran sólo en el subconjunto efectoras /de memoria, se solucionaron poblaciones de sangre periférica CD4
+ células T en base a la expresión de marcadores de memoria y no tratados previamente y CXCR6. Después de la activación
ex vivo
, se encontró que el ARNm para CXCL16 se indujo preferentemente dentro del efector /subconjunto de memoria y, dentro de ese subconjunto, en las células que expresan CXCR6 (Figura 5A). Estamos próximos a prueba las posibilidades de acción de CXCR6 sobre las células T mediante la transfección de la línea celular Jurkat E6.1 T con ADN que codifica CXCR6-YFP o GFP. CXCR6-YFP
+, pero no CXCR6-YFP
- células, emigró a CXCL16 en un G
i manera dependiente /o-proteína (Figura 5B), y mostró un aumento progresivo en el número de células con el aumento dosis de CXCL16, pero no a una quimiocina control (Figura 5C). CXCL16 no tuvo ningún efecto sobre las células transfectadas para expresar GFP como un control adicional (datos no mostrados). CXCL16 /CXCR6 una mayor proliferación de por sí, ya hemos visto ningún efecto sobre la muerte celular (Figura 5D) y encontramos un aumento en concreto dentro de la población de células que se dividían (Figura 5E).
(A) CD4
+ células T fueron ordenados en naïve (CD45RO-), efectoras /memoria total (CD45RO +), CD45RO
+ CXCR6
- (CXCR6-) y CD45RO
+ CXCR6
+ (CXCR6 +) subconjuntos y se estimularon con PMA e ionomicina durante 4 horas antes de medir los niveles de CXCL16 mRNA por tiempo real de RT-PCR. Los valores se normalizaron mediante el establecimiento de la muestra con la expresión más baja igual a 1. Los datos son medias de muestras duplicadas de un experimento representativo de tres realizados. Se analizaron las células Jurkat E6.1 T (B) transfectadas con el plásmido CXCR6-YFP para la migración a CXCL16. Algunas muestras se pre-incubaron durante dos horas con 400 ng de toxina /ml pertussis como se indica. El número de células que migran YFP + y YFP- se analizaron por citometría de flujo. Cada barra representa la media ± SEM obtiene a partir de pocillos por triplicado, a partir de un experimento representativo de tres realizados. ***, P & lt; 0,001 vs. el valor de control correspondiente. (C) Después de la transfección con el plásmido CXCR6-YFP, las células Jurkat E6.1 T se cultivaron durante 48 horas sin quimioquinas (control, ctrl) o con 1 g CXCL8 /ml como un control adicional, o con 0,05-5 g /ml CXCL16 antes de contar el número de CXCR6-YFP
+ vs CXCR6-YFP
- células. Las barras muestran las medias ± SEM combinados de tres experimentos diferentes. *, P & lt; 0,05 y ***, p & lt; 0,001. (D) Las células transfectadas se trataron como en (C) y se tiñeron con anexina V y yoduro de propidio (PI) antes de contar el número de CXCR6-YFP
+ células dentro de los subgrupos como se ha señalado. Las barras muestran las medias ± SEM de tres experimentos combinados. **, P & lt; 0,01 y ***, p & lt; 0,001 vs. células no tratadas de control. (E) De acuerdo con transfecciones CXCR6-YFP plásmido, las células Jurkat E6.1 T se cargaron con 2 M de colorante rojo lejano DDAO y cultivadas sin quimioquinas (control, ctrl) o con 0,05-5 mg /ml CXCL16 o 1 mg /ml de CXCL8 . Números de CXCR6YFP
+ vs CXCR6YFP
+ DDAO
- (proliferado) y CXCR6YFP
+ DDAO
+ (no proliferaron) se determinaron las células después de 48 horas utilizando contar bolas y citometría de flujo . Las barras muestran medias ± SEM de los pocillos por triplicado, a partir de un experimento representativo de tres realizados. ***, P & lt; 0,001 y *, p & lt; 0,05 frente a células no tratadas de control
Por otra parte, cuando se examinó el efecto de CXCL16 unido a la placa sobre la proliferación de células CD3 activados por el principal T CD4. células, se encontró un efecto estimulante significativo en la proliferación que fue inhibida por el tratamiento con toxina pertussis o anticuerpos contra CXCR6 o CXCL16 (Figura 6A). Es notable, dado que CXCL16 se sintetiza como una quimiocina transmembrana, que a pesar de CXCL16 unido a la placa fue estimulante, CXCL16 soluble no tuvo ningún efecto (datos no mostrados).
células (A) de CD4
+ T purificada a partir de linfocitos elutriated de donantes sanos se estimularon durante 3 días con unido a la placa anti-CD3 (OKT3, 10 mg /ml) con o sin 5 mg /ml CXCL16 unido a la placa (BL16). Tratamientos de células activadas con anti-CD3 con PTX, anti-CXCR6 (Ar6) y anti-CXCL16 (AL16) sin BL16 se realizaron como controles. IgG de ratón (mIgG) y de rata IgG (rIgG) se utilizaron como controles para el anticuerpo anti-CXCR6 anticuerpo y anti-CXCL16, respectivamente. Las barras muestran las medias ± SEM de un experimento representativo de cinco, utilizando cinco donantes. Anti-CXCL16 se utilizó en un total de cuatro, y anti-CXCR6 en dos experimentos. ns, no significativo y ***, p & lt; 0,001. (B) CXCR6 y CXCL16 ARNm se midieron por tiempo real RT-PCR en células activadas con CD3 y CD4 no activado
+ T después de 3 días. Los valores se normalizaron mediante el establecimiento de la muestra no activado con la expresión más baja igual a 1. Las barras muestran medias ± SEM combinados de los pocillos duplicados de siete donantes diferentes. **, P & lt; 0,01 y ***, p & lt; 0,001 frente a células no activadas. (C) anti-CD3-activan o se analizaron las células CD4 + T no activado
para la migración a CXCL16, expresados como porcentajes de células que migran de entrada. Cada barra representa la media ± SEM obtenida de pozos por triplicado de un total de tres experimentos realizados. ***, P & lt; 0,001 en las barras transversales están indicados para las comparaciones entre las células activadas - 0 frente a 50 ng /ml CXCL16 y 50 ng /ml frente a 500 ng /ml CXCL16
A pesar de la. datos de los efectos de CXCL16 en CD4 activado
+ células T, no pudimos detectar la tinción para CXCR6 mediante citometría de flujo en un porcentaje grande o aumento de estas células después de la activación. Sin embargo, en apoyo de CXCR6 funcional en estas células, encontramos un aumento significativo en la expresión de ARNm de CXCR6 y (menos) de CXCL16 en células CD3 activados (Figura 6B), y un aumento de la migración de las células CD3 activado a CXCL16 (Figura 6C). La respuesta a la dosis en la figura 6C tiene el patrón en forma de campana típica de la quimiotaxis.
CXCL16 y /o CXCR6 se expresan ampliamente en los cánceres asociados con la inflamación
Con el fin de investigar la posibilidad de una mayor asociación general entre CXCL16 y el cáncer asociado con la inflamación, se estudió la expresión de CXCL16 en 582 casos de cáncer que cubren 12 tipos de tumores (Figura 7). Encontramos un sesgo para la expresión de alto CXCL16 en los cánceres asociados con la inflamación:. Ovario, mama, próstata, colon y cánceres de hígado
(A) * La intensidad de la tinción de CXCL16 se obtuvo como se describe en Materiales y Métodos. El% de los casos con tinción alta se muestra para cada tipo de cáncer. ** CCR, el carcinoma de células renales; GBM, el glioblastoma multiforme. (B) la expresión de CXCL16 en matrices de múltiples cánceres humanos por inmunohistoquímica utilizando AEC (rojo) o DAB (marrón) para la detección. Los paneles son representativos de los números de las muestras de los diversos tipos de cáncer como se indica en (A).
Discusión
El cáncer se origina a partir de mutaciones genéticas y eventos epigenéticos en las células proliferantes y los cambios en microambiente del tumor que incluye capilares, células de músculo liso, fibroblastos y células inflamatorias [4]. En 1863, el médico alemán Rudolf Virchow señaló leucocitos en los tejidos neoplásicos y planteó la hipótesis de que el cáncer comienza en los sitios de inflamación crónica [37]. No obstante, los inmunólogos cáncer han visto generalmente como agentes de leucocitos con el potencial para limitar o eliminar el cáncer [38]. Del mismo modo, en su papel de mediadores de reclutamiento de leucocitos, las quimioquinas se han estudiado como estimuladores de la inmunidad contra el cáncer y la inflamación [11], [39], [40].
condiciones inflamatorias crónicas tienen, sin embargo, ha sido demostrado que predispone a múltiples tipos de cáncer y la inflamación recurrente o crónica ha sido implicado en una variedad de cánceres humanos [5]. Los modelos recientes de ratón han hecho un vínculo funcional entre el cáncer y la inflamación, que muestra que la supresión de las células inmunitarias o genes inmunorreguladores reducir la progresión del cáncer [1] - [3]. En conjunto, estos datos plantean la posibilidad de un papel adicional para las quimiocinas proinflamatorias en el cáncer, es decir, como promotores tumorales.
Hemos investigado el cáncer de próstata, que se describe como que surgen en el contexto de la inflamación. Nuestra pantalla preliminar para la expresión de quimioquinas sugerido un papel para CXCL16, y se encontró que tanto CXCL16 y CXCR6 fueron co-expresado en las células cancerosas, que sus niveles de expresión correlacionadas entre sí, y que estos niveles también se correlacionó con estadio alto y alto cáncer de próstata -Grado. Además, CXCL16 mejora la proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata que expresan CXCR6. Nuestros datos sugieren posibles efectos directos de CXCL16 /CXCR6 sobre el crecimiento de células de cáncer y por lo tanto en el desarrollo de tumores.
En un segundo aspecto de nuestro estudio, se investigó posibles funciones para CXCL16 /CXCR6 en el contexto de la contribución postulado de inflamación a la enfermedad pre-malignas y malignas en la próstata. Encontramos una alta expresión de CXCL16 en la prostatitis crónica, lesiones pre-neoplásicas y cáncer de próstata primario rodeado de reactivo, es decir, estroma post-inflamatoria. Por otra parte, TNF-α y IFN-γ induce la expresión de CXCL16 y CXCR6 en las células epiteliales de la próstata primario. Además, hemos encontrado correlaciones significativas entre la presencia de la expresión estroma y de alto nivel de reactivo de CXCL16 y CXCR6 en las células cancerosas. Estos resultados sugieren que la regulación de CXCL16 /CXCR6 en el epitelio de la próstata está fuertemente asociada con la inflamación actual y anterior en el estroma de la próstata.
En una tercera parte de nuestro estudio, se investigaron las posibles funciones de CXCL16 y CXCR6 en linfocitos asociados a tumores. Se encontró que CXCL16 y CXCR6 se expresan en células T adyacentes a las células del cáncer de próstata. Hemos demostrado que CXCL16 puede ser inducida preferentemente en CXCR6
+ CD4
+ células T primarias, y que las células Jurkat T transfectadas para expresar CXCR6, así como se activa, primaria CD4
+ células T proliferaron en presencia de CXCL16. Estos datos sugieren la posibilidad de que ambos efectos autocrinos y paracrinos de CXCL16 en la infiltración de células T, así como en células de la próstata pre-malignas y /o malignas.
Finalmente, para investigar una asociación más general entre CXCL16 y inflamación- cánceres asociados, se estudió la expresión de esta quimiocina en muestras de varios tipos de cánceres humanos. Hemos encontrado altos niveles de expresión de CXCL16 en los cánceres de ovario, mama, próstata, colon y el hígado -. Todos los cánceres descritos como que surgen en el contexto de la inflamación
CXCL16 se ha descrito previamente en gliomas humanos, colon y de mama cáncer, y CXCR6 se informó en los cánceres de nasofaringe y el melanoma [41] - [46]. Varios documentos adicionales han aparecido recientemente la investigación de CXCL16 y /o CXCR6 en el cáncer [45] - [50]. Varios de estos informes se centraron en CXCR6 en el cáncer de próstata, y como el nuestro mostraron alta expresión de CXCR6 en células de cáncer de próstata [47] - [49]. Uno de papel, también como el nuestro, demostró una correlación positiva entre los niveles CXCR6 y puntuaciones de Gleason, informó la expresión de CXCL16 en los cánceres de próstata, y mostró un incremento en la secreción de CXCL16 partir de líneas celulares de próstata después del tratamiento con TNF-α [47]. Un segundo documento mostró efectos sobre la invasión de líneas de próstata soluble CXCL16 [48]. Un tercio de papel demostró efectos de CXCR6 sobre el crecimiento de líneas celulares de cáncer de próstata en ratones [49]. En general, nuestros hallazgos sugieren un papel pro-tumorigénicos para CXCL16 y CXCR6 en cáncer de próstata son consistentes con estos informes publicados.