Extracto
La activación de los circuitos de la transcripción de células madre es un acontecimiento importante en el desarrollo del cáncer. Aunque las células de cáncer mostraron una célula como la expresión de genes firma tallo, la regulación epigenética de los genes pluripotencia asociada en los cánceres sigue siendo poco conocida. En este estudio, se caracterizó la regulación epigenética de los genes pluripotencia asociada a
NANOG
,
Oct4
,
c-MYC
,
KLF4
, y
SOX2
en una variedad de líneas celulares de cáncer y en muestras de tumores primarios, y se investigó la re-activación de circuitos de regulación de pluripotencia en la progresión del cáncer. patrones diferenciales de metilación del ADN, modificaciones de las histonas, y la expresión génica de los genes pluripotentes se demostraron en diferentes tipos de cáncer, lo que puede reflejar sus orígenes tisulares.
NANOG
promotor hipometilación y la regulación positiva de genes fueron encontrados en las células de cáncer de hígado humano y los tejidos tumorales metastásicas primaria carcinoma hepatocelular humano (HCC). La regulación positiva de
NANOG
, junto con el agotamiento de p53, se asoció significativamente con el estadio clínico tardío de HCC. Un papel pro-metastásico de NANOG en células de cáncer de colon también se demostró, mediante un
NANOG
-overexpressing modelo de ratón de la implantación del tumor ortotópico. La desmetilación de
se observó NANOG
promotor en CD133 +
células cancerosas alta. De acuerdo, la sobreexpresión de
NANOG
dado lugar a un aumento en la población de CD133 +
pilas de gran. Además, hemos demostrado una regulación cruzada entre los
Oct4
y
NANOG
en las células cancerosas a través de la reprogramación de la metilación del promotor. En su conjunto, la reprogramación epigenética de
NANOG
puede conducir a la adquisición de propiedades de células madre. Estos resultados subrayan la restauración de los circuitos de pluripotencia en células de cáncer como un mecanismo potencial para la progresión del cáncer
Visto:. Wang XQ, Ng RK, Ming X, W Zhang, Chen L, Chu ACY, et al. (2013) La regulación epigenética de los genes pluripotentes medie características de células en humanos carcinoma hepatocelular y líneas celulares de cáncer de vástago. PLoS ONE 8 (9): e72435. doi: 10.1371 /journal.pone.0072435
Editor: Anil Kumar Tyagi, Universidad de Delhi, India
Recibido: 2 de mayo de 2013; Aceptado: 10 de julio de 2013; Publicado: 4 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Fondos Semilla de Investigación básica en la Universidad de Fondo de Investigación del Consejo general de Ayuda de Investigación Kong Hong (HKU778809M) Hong Kong (11159149) y Wang XQ. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los cambios epigenéticos son considerados como sustitutos potentes a mutaciones en la desregulación de los genes que promueven el crecimiento y genes supresores de tumores [1], [2]. Se ha propuesto que el proceso de la carcinogénesis implica alteraciones epigenéticas en las células madre /progenitoras antes de que ocurran mutaciones genéticas gatekeeper [1], [3], [4]. Este proceso presumiblemente puede afectar tanto a la plasticidad genética y epigenética de una célula y permitir la adquisición de características "stemness", tales como la invasión, metástasis y resistencia a los medicamentos, durante la progresión del cáncer [1], [2]. Además, se encontró inestabilidad genómica causada por la hipometilación del ADN global para ser uno de los cambios más tempranos en el desarrollo de los cánceres humanos [2], [5].
Mientras que la sobreexpresión de
OCT4
,
Sox2
,
KLF4
y
c-MYC
genes inducen la pluripotencia en células somáticas que conducen a la generación de células madre embrionarias (ESC) -como inducidas (células iPS) [6] - [8], es interesante observar que el programa transcripcional ESC-como a menudo se activa en diversos cánceres epiteliales humanos [9], [10]. Tal módulo gen ESC-como también se asoció con la progresión de la enfermedad, por ejemplo, metástasis, y la mortalidad precoz del cáncer de mama [9] y el cáncer de vejiga [11]. Es, por lo tanto, sugiere una vía molecular común implicado tanto en IPSC celular derivación y el cáncer de vástago (CSC) de iniciación [12]. Por otra parte, estudios recientes han demostrado que iPSCs conservan memoria epigenética, como la firma de metilación del ADN, de sus orígenes de tejido [13], [14], lo que indica la importancia de la regulación epigenética en la reprogramación del destino celular y la tumorigénesis [15], [16].
a pesar de que la red de genes de células madre similares se ha demostrado en el cáncer [11], la asociación de la reprogramación epigenética y propiedades CSC sigue siendo poco conocida. A continuación, se determinó la regulación epigenética de los genes pluripotencia asociada a
NANOG
,
Oct4
,
c-MYC
,
KLF4
, y
SOX2
, y su correlación con la expresión génica en líneas celulares de cáncer y muestras de tumor primario. Además, examinó sus posibles funciones en el proceso de metástasis y en la iniciación de las CSC durante la progresión tumoral.
Materiales y Métodos
Muestras
Emparejado tejido no tumoral y tumoral especímenes de carcinoma hepatocelular (HCC) se recogieron de pacientes con HCC quince diagnosticados con la enfermedad en estadio I-IV patológica del tumor-nódulo-metástasis (TNM) [17]. muestras hepáticas normales se obtuvieron de donantes de hígado de cadáver. Todas las muestras fueron proporcionados por el Banco de Tejidos de las Divisiones de Cirugía Hepatobiliar y páncreas y el trasplante de hígado en el Departamento de Cirugía, Hospital Queen Mary. Recogida y almacenamiento de muestras clínicas para el Banco de Tejidos ha sido aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Hong Kong /Autoridad de Hospitales de Hong Kong. hepatocitos normales y líneas celulares de HCC incluyen MIHA y L02 (hepatocitos normales); PLC (HCC primaria); y MHCC97L (97L) y MHCC97H (97H), se derivaron de HCC metastásico [18]. Otras líneas celulares de cáncer no-HCC incluyen HeLa (adenocarcinoma de cuello uterino); MCF7 (adenocarcinoma de mama); AGS (adenocarcinoma gástrico); HCT116 (carcinoma colorrectal); y K-562 (leucemia mielógena crónica). El PLC, HeLa, MCF7, AGS, y líneas HCT116 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). L02 se obtuvo del Centro de China para la Colección de Cultivos Tipo.
aislamiento de ADN genómico
ADN genómico total se aisló a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), líneas celulares, y no tumoral y tumor muestras de hígado de pacientes con HCC, utilizando el QIAamp DNA mini kit (Qiagen).
análisis de secuenciación de bisulfito
el ADN genómico se procesa para la conversión de bisulfito de citosinas no metiladas utilizando el kit de EpiTect bisulfito (Qiagen). El bisulfito modificado con ADN se utilizó para la PCR, con cebadores que reconocen las secuencias de ADN convertidos (Figura 1A; Figura S1 en File S1; Tabla S1). Los productos de PCR se clonaron en pGEM-T fácil vector (Promega Bioscience). Diez clones se seleccionaron y se secuenciaron al azar. secuencias de ADN se analizaron con el software BIO Analyzer (http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de) para la lectura CpG. Porcentaje de metilación se refiere al número de CpG metilados sobre el total de las GPC en la región analizada.
(A) Diagrama esquemático de las regiones reguladoras de genes de
NANOG
,
Oct4
y
c-myc que fueron examinados por secuenciación de bisulfito (bis) (barras rojas) y el chip (barras verdes) experimentos. (I) El
NANOG
región promotora proximal cubre 10 sitios CpG desde -1449 a -952. (Ii) El
Oct4
región promotora está cubierto por 8 pares de cebadores para 50 sitios CpG de -2973 a +320. (Iii) El
c-MYC
región del gen está cubierta por los cebadores bis de islas CpG sitios antes de SAT-1 y SAT-2, y CpG en el exón 2 y 3; y el cebador chip para el exón 3. (B) Análisis de secuenciación de bisulfito de la
NANOG
promotor en líneas celulares de cáncer. la frecuencia de metilación del ADN se presenta como porcentajes en: hígado normal (L02) y cáncer de hígado (PLC, 97L y 97H) células (azul); PBMC normales y las células leucémicas K-562 (naranja); y en HeLa, MCF7, HCT116, y células de cáncer de AGS (verde). (C) clonal
NANOG
patrones de metilación en el promotor 97L, HeLa y células K-562. Los círculos abiertos representan los CpG no metilados; círculos cerrados representan los CpG metilados. (D) la frecuencia de metilación del
Oct4
promotor proximal (-530 a la +7) en: células hepáticas normales y cancerosas (azul); y en HeLa y células HCT116 (verde). (E) la frecuencia de metilación del ADN de las regiones aguas arriba y aguas abajo de
Oct4
en las células hepáticas normales y cancerosas. "En general" abarca 50 sitios CpG de -2973 a +320; "5 'TSS" abarca 10 sitios CpG desde -530 a 7; y "3 'TSS" abarca 12 sitios CpG de +61 a +320. (F) la frecuencia de metilación del exón 3 de
c-MYC gratis (10 sitios CpG) en: células hepáticas normales y cancerosas (azul); PBMC y las células leucémicas K-562 (naranja); y en HeLa, MCF7, HCT116, y las células de cáncer de AGS (verde).
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
El procedimiento chip se describe en Current Protocols [19]. En pocas palabras, el diez a la de veinte millones (1-2 × 10
7) L02, se recogieron las células HCT116 y 97L y se fijaron con formaldehído al 37%. Los lisados celulares sonicados se sometieron a inmunoprecipitación con 5 g de H3K4me3 o anticuerpos H3K27me3 (Abcam), y la IgG normal (entradas como control), respectivamente, en presencia de proteínas perlas de G-Sepharose (GE Healthcare) a 4 ° C durante la noche. Las perlas se lavaron secuencialmente con tampón de lisis FA, tampón de lavado chip, y tampón TE. materiales unidos se eluyeron con tampón de elución chip. El enriquecimiento de la modificación de histonas se cuantificó mediante PCR en tiempo real, utilizando SYBR Green (Applied Biosystems), con los cebadores de chip correspondientes (Figura 1A; Figura S1 en File S1; Tabla S1). Los datos se presentan como el enriquecimiento veces, usando un análisis fórmula de cálculo chip-qPCR (www.sabiosciences.com); entradas y simulacro de IP se utilizaron para la normalización.
La transcripción inversa y PCR en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR)
El ARN total fue aislado utilizando el RNeasy Mini Kit (Qiagen) y se trató con DNasa I , seguido por transcripción inversa con la primera hebra de síntesis de cDNA Kit Transcriptor (Roche). QRT-PCR análisis se realizó utilizando las sondas TaqMan pre-diseñadas para
NANOG gratis (Hs02387400_g1),
POU5F1 gratis (Hs00999634_gH),
MYC gratis (Hs00153408_m1), y
18S rRNA
(4.333.760 hasta 0.807.027), que se selecciona de ensayos de expresión TaqMan Gene (Applied Biosystems). reactivos SYBR Green (Applied Biosystems o Takara Biotecnología) se utilizaron para la detección de
Oct4
,
MYC
,
KLF4, p53
y
β-actina
la expresión de genes (información de imprimación en la Tabla S2). La expresión génica se calcula como CT y se normalizó al nivel de
18S
o
β-actina
.
Lentivirus transducción
Human
NANOG
(NM_024865) y
Oct4 gratis (NM_002701) los genes de la línea de células madre embrionarias humanas fueron clonados en el vector y pWPI fueron transfectadas con pCMV-dR8.91 y pMD2.G plásmidos en la línea celular de empaquetamiento 293T. sobrenadantes virales se cosecharon 48 horas después de la transfección y se precipitaron utilizando PEG-it soluciones para virus Precipitación (Biociencias del sistema). HCT116 p53 - /- células fueron infectadas con lentivirus que expresan
Oct4
o
NANOG Hoteles en presencia de 8 mg /ml de sulfato de protamina. Clasificación de células se realizó utilizando FACSAria (BD Biosciences) para el aislamiento de p53 HCT116 transducidas - /-. Células
Ensayo in vivo de metástasis por la implantación del tumor de colon ortotópico
De cuatro a seis semanas de edad BALB /ratones (Desnudos) Cann-nu se obtuvieron y se mantienen en el Laboratorio Unidad Animal de la Universidad de Hong Kong. Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité para el Uso de Animales Vivos de la Universidad de Hong Kong. Lentivirus infectado p53 HCT116 - células fueron inyectadas por vía subcutánea en ratones desnudos para generar tumores primarios - /. Los tumores primarios fueron disecados en 1-2 mm
3 cubos y luego implantados en el ciego de otros ratones nude [20]. Colon a metástasis de tumores de pulmón, se examinó después de 4 semanas de implantación ciego. enteros los pulmones de los ratones desnudos fueron seccionadas y teñidas con H & amp; E. Las lesiones tumorales de colon en los pulmones fueron examinadas por microscopía.
La citometría de flujo y clasificación de células
CD133-PE (Miltenyi Biotec) marcadas se analizaron las células HCT116 usando FACSCalibur (BD Biosciences). Las células CD133 +
baja, CD133 +
alta, y CD133- fueron sometidos a clasificación de células por FACSAria (BD Biosciences).
El análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± SD y
t
test de Student se realizó utilizando el software SPSS.
P Hotel & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
metilación del ADN diferencial de los genes pluripotencia asociada en las células cancerosas
Los estudios anteriores han demostrado. la activación de los objetivos de abajo
NANOG
,
Oct4
,
Sox2
y
MYC
genes en el agresivo desarrollo de cánceres humanos [11]. Por ello, investigó el patrón de metilación de CpG de
NANOG gratis (también conocido como
NANOG1
),
Oct4
,
Sox2
,
KLF4
y
c-MYC Hoteles en líneas celulares de cáncer humano por secuenciación enfoque bisulfito (Figura 1A; Figura S1 S1 en el archivo). En comparación con L02 células normales del hígado, que muestran un nivel de metilación moderado (39%), hipometilación del ADN de
NANOG
(Figura 1A-i) se observó en líneas celulares de cáncer de hígado de tres, a saber, PLC, 97L y 97H ( 18%, 8% y 14%, respectivamente), entre los que la línea de células de hígado metastásico 97L mostró casi ausencia de metilación del ADN (Figura 1B y 1C). Mientras que en las células leucémicas K-562,
NANOG
metilación (39%) mostraron una disminución de 2 veces en comparación con las células normales mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (81%; Figura 1B y 1C). Las células de cáncer de otros orígenes tisulares muestran diferencial
NANOG
la metilación del promotor; por ejemplo, se observó la hipometilación en HeLa (25%), mientras que la hipermetilación se muestra en MCF7, HCT116 y AGS (71%, 92% y 91%, respectivamente) (Figura 1B y 1C).
siguiente examinado el
Oct4
patrón de metilación del promotor en las células cancerosas. La región del promotor proximal (-503 a 7; Figura 1A-ii) de
se encontró OCT4
hypermethylated en L02 (92%), MIHA (90%), HeLa (90%) y HCT116 (87% ) las células, lo que es en contraste con los niveles reducidos observados en las células PLC y 97L (70% y 41%, respectivamente; Figura 1D). Extendemos el análisis de metilación de un total de 50 CpG que cubren tanto el promotor distal y la región aguas abajo del sitio de inicio de transcripción (TSS, -2973 a +320; Figura 1A-ii). El patrón de metilación reducida se conserva en el
Oct4
región del gen analizado en células PLC y 97L (Figura 1E). Para el
c-MYC
gen, aunque los CpG localizadas aguas arriba de TSS1 y TSS2 y en el exón 2 se mantuvieron sin metilar tanto en las células normales y cancerosas (Figura 1A-iii; Figura S2 en S1 del archivo), el nivel de metilación del exón 3 se redujo drásticamente y se convirtió en hypomethylated en dos líneas celulares de cáncer de hígado, PLC (34%) y 97L (6%), en comparación con el nivel moderado a alto de metilación (51% a 82%) en las células normales del hígado ( Figura 1F). En contraste, las células de cáncer de otros orígenes de tejido, con la excepción de HeLa, muestra el estado de hipermetilación de
c-MYC
exón 3 (que van desde 72% a 99%; Figura 1F). Por otro lado, las islas CpG en las regiones promotoras de
KLF4
y
Sox2
genes metilados se mantuvieron en todas las líneas celulares examinadas (figuras S1, S3, S4 en S1 Archivo). Tomados en conjunto, diferencial patrón de metilación de los genes pluripotencia asociada se observó en líneas celulares de cáncer humano de diferentes orígenes tisulares.
regulaciones epigenética de la expresión génica pluripotentes
A continuación se centró en la expresión de genes en pluripotentes dos líneas celulares de cáncer, 97L y HCT116, que mostraron patrones opuestos de la metilación del ADN. QRT-PCR análisis demostró una mayor expresión de
NANOG
,
Oct4
y
c-MYC
genes en las células 97L, pero no en las células HCT116, cuando se comparó con el control del PLC y L02 células (Figura 2A-C; Figura S5A-C en S1 File), lo que sugiere la expresión de estos genes está regulado negativamente por la metilación del ADN. Para
KLF4
, se observó aumento de la expresión de genes tanto en células HCT116 y 97L (Figura 2D; Figura S5D en S1 de archivos) a pesar de que el patrón de metilación isla CpG era indistinguible entre normal y células cancerosas (Figura S3 en presentar S1)
Los niveles de expresión de (A)
NANOG
, (B)
Oct4
, (C)
c CD -.
MYC
, y (D)
KLF4
genes se determinaron en L02, PLC, 97L, y HCT116 células por QRT-PCR análisis, normalizados con el gen de referencia
18S
. La expresión génica se normalizó a la muestra L02, que se definió como 1. Los datos son la media ± desviación estándar obtenida a partir de 2 a 3 experimentos con duplicados. El enriquecimiento de la modificación de histonas y H3K4me3 H3K27me3 en las regiones promotoras de los genes pluripotencia asociada (E)
NANOG
, (F)
Oct4
, (G)
c
-
MYC
, y (H)
KLF4
se mide en L02, 97L, y HCT116 mediante el análisis de chip. Los datos se representan como el enriquecimiento de pliegue y se normalizó con la entrada y los controles de IgG simuladas. El enriquecimiento fue veces con relación a la muestra L02, que se definió como 1. Los datos se representan con el valor medio obtenido a partir de dos experimentos chip con barras de error de desviación típica.
Las modificaciones epigenéticas en las proteínas histonas también mostraron un fuerte asociación con la expresión génica. Nosotros, por lo tanto, se determinó la presencia de dos tipos de modificaciones de las histonas, el activo /permisiva tri-metil-H3K4 (H3K4me3) y el represor tri-metil-H3K27 (H3K27me3), en 97L y las células cancerosas HCT116. Chip análisis demostró un enriquecimiento significativo de la marca H3K4me3 activa en las regiones promotoras de
NANOG
y
Oct4
y la región del exón 3 de
c-myc en las células
97L, cuando en comparación con las células L02 y HCT116 (Figura 2E-G, paneles de la izquierda). Esto está en contraste con el bajo nivel de marca H3K27me3 represivo observado en estas células (Figura 2E-G, paneles de la derecha). Estos resultados sugieren que ambas modificaciones de las histonas y la función de la metilación del ADN de forma sinérgica en la regulación de
NANOG
,
OCT4
y
c-MYC
la expresión génica. Por otro lado, se encontró H3K4me3 altamente enriquecido en el
KLF4
promotor de células 97L, mientras que las células HCT116 demostraron un nivel moderado de H3K4me3 pero con relativamente menor nivel de H3K27me3 represiva (Figura 2H, panel derecho). Esto puede explicar el alto nivel de
KLF4
la expresión de genes en ambas líneas celulares (Figura 2D), que es independiente de la metilación del ADN.
hipometilación promotor NANOG en humanos HCC tejido tumoral
Dado que el diferencial
NANOG
patrón de metilación en líneas celulares de cáncer puede ser una consecuencia de
in vitro
cultivo en lugar de su asociación con la tumorigenicidad
per se
, nos , por lo tanto, investigado
NANOG
promotor de la metilación en los tumores de HCC primarios combinados con tejidos no tumorales adyacentes (n = 15), en comparación con muestras de hígado normal (Figura 3A). Sorprendentemente, el 73% de los casos no tumorales (11 de 15) eran más del 50% metilado, mientras que el 53% de los casos de tumores (8 de 15) tenían menos de 30% metilado en el
NANOG
promotor (Figura 3B y 3C).
NANOG
niveles de metilación del promotor se redujeron significativamente en los tumores de HCC pareadas en comparación con los tejidos no tumorales adyacentes (
p
= 0,000), mientras que no se detectaron cambios significativos entre el hígado normal y no tumoral tejidos (
p = 0,301
; Figura 3D). De acuerdo con la reducción de la metilación del promotor,
NANOG
expresión se encontró significativamente mayor en el tejido tumoral que en el tejido no tumoral (
p
= 0,021; Figura 3E). Vale la pena señalar que las muestras de HCC en el estadio TNM III y IV, que normalmente está presente con la invasión vascular, los ganglios linfáticos y metástasis a distancia [17], se asoció significativamente con alta
NANOG gratis (
p
= 0,011) y baja
p53 gratis (
p = 0,047
) expresión (Tabla 1, Tabla S3). El bajo nivel de
p53
también se asoció con la infiltración vascular (
p = 0,019
, Tabla 1). Estos resultados sugieren que la metástasis tumoral requiere tanto la regulación al alza de
NANOG
través promotor hipometilación y la supresión de
p53 Hoteles en HCC
(A) H & amp;. Tinción de E humana hígado normal (izquierda) y HCC no tumoral (medio) y el tejido tumoral (derecha). estado (B) La metilación del
NANOG
promotor (-1449--952) en quince tejidos HCC no tumorales y tumorales emparejadas. la frecuencia de metilación de ADN se clasifica en 50 a 69% (negro), 30 a 49% (gris), y 19 a 29% (blanco) en el tumor de HCC y los tejidos no tumorales adyacentes. (C)
NANOG
patrón de metilación del promotor se representa con tumor HCC caso-297 y el tejido no tumoral adyacente. (D) Comparación estadística de
NANOG
promotor de la metilación en el hígado normal (n = 3), HCC adyacente no tumoral (n = 15) y el tumor (n = 15) tejidos; los datos son la media ± SD. (E) La comparación estadística de
NANOG
la expresión génica en emparejado HCC no tumoral y el tejido del tumor (n = 15). Cada tejido tumoral se normalizó con su correspondiente tejido no tumoral.
expresión de NANOG promueve la metástasis tumoral
Tras la identificación de
NANOG
regulación al alza en metastásico HCC células tumorales y muestras, que favorecieron nuestro estudio para examinar la
in vivo
función de
NANOG Hoteles en la progresión del cáncer. Sin embargo, la fuerte expresión de
NANOG Hoteles en células de HCC hace que sea difícil de ser derribado de manera eficiente para
in vivo
estudios funcionales (datos no mostrados). Nosotros, por lo tanto, seleccionamos la línea celular HCT116, que tiene bajo nivel endógeno de NANOG, para estudiar la sobreexpresión. Un establo
NANOG
que expresa p53 HCT116 - /- células (Figura S6A en S1 Archivo) se inyectaron en ratones desnudos para la formación de tumores. Sorprendentemente, un mínimo de 1 × 10
4 células de cualquiera de HCT116 p53 - /- o
NANOG
expresando p53 HCT116 - /- (p53 NANOG-HCT116 - /-) las células fue suficiente para formar tumores subcutáneos (Tabla S4), lo que indica que un mayor nivel de
NANOG
expresión no podía mejorar aún más la formación de tumores primarios. Sin embargo, el uso de un modelo de ratón ortotópico la implantación del tumor, se observó una de colon significativamente mayor a la metástasis de pulmón mediante la implantación de tumores de xenoinjertos de p53 NANOG-HCT116 - /- células en comparación con el p53 HCT116 parental - /- células (Figura 4A-C). Esto proporciona un fuerte
in vivo
evidencia para apoyar la función de
NANOG
en la promoción de la metástasis de las células cancerosas
(A) HCT116 p53 -. /- O NANOG-expresión de p53 HCT116 - /- células (1 × 10
6) se inyectaron en ratones desnudos por vía subcutánea. tejido del tumor de xenoinjerto que se formó se escindió y se diseccionado en 1-2 mm
3 cubos que luego se implantan en las cecums de otros ratones desnudos. se observó la formación de tumor en el ciego después de la implantación. Las flechas apuntan a ciego y el tumor recién formado en el ciego. (B) Colón a la metástasis del tumor de pulmón fue examinado después de cuatro semanas de la implantación de H & amp; E tinción de secciones de tejido pulmonar. En comparación con borrar el tejido pulmonar (izquierda), se observó una lesión tumoral pequeña en el pulmón (medio) de la p53 HCT116 - /- grupo de la implantación; mientras que las lesiones tumorales de colon grandes y múltiples fueron encontrados en el p53-NANOG HCT116 - /- grupo de implantación (derecha). (C) La comparación estadística de la frecuencia de metástasis de pulmón en el modelo de ciego implantación ortotópica derivado de p53 HCT116 - /- (n = 8) y NANOG-HCT116 p53 - /- (n = 11). (D) La citometría de flujo análisis de la expresión CD133 en células HCT116 demostró tres poblaciones de células; a saber, CD133-, CD133 +
baja, y CD133 +
alta. Menos del 1% de las células fueron considerados como CD133 +
alta. (E)
NANOG
patrones de metilación en el promotor CD133-, CD133 +
baja y alta células HCT116 CD133 +
. CD133 +
pilas de gran demostraron una reducción significativa de
NANOG
la metilación del promotor. (F)
NANOG
expresión en CD133-, CD133 +
baja y alta células HCT116 CD133 +
. CD133 +
pilas de gran demostraron un aumento significativo del
NANOG
expresión. El
NANOG
expresión en CD133- se definió como 1, y el aumento de veces CD133 +
baja y CD133 +
alta (frente a CD133-) se calculó como ΔΔCT. Los datos son la media ± SD de tres experimentos con duplicados. (G) células HCT116 se infectaron con
NANOG
lentivirus-GFP y se analizaron para las poblaciones de CD133 por citometría de flujo. Los porcentajes de las poblaciones CD133 se compararon entre las células HCT116 con cualquiera de los niveles endógenos o el nivel de sobreexpresión de NANOG. El CD133 +
alta población (R5) se incrementó en células con sobreexpresión de
NANOG
.
La desmetilación de NANOG en CD133 +
alta población de células HCT116
alta expresión de CD133 es una de las indicaciones de la población CSC en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de colon [21], [22]. Dado que los tres genes pluripotentes
NANOG
,
Oct4
, y
c CD -
MYC
fueron hypermethylated en células de carcinoma colorrectal HCT116, nos preguntamos si la misma patrón de metilación se observa en la población CSC putativo raro en células HCT116. Hemos observado más del 80% de las células HCT116 fueron CD133 +, pero sólo el 1% de las células eran considerados como CD133 +
alta (Figura 4D). Es importante destacar que,
NANOG
metilación del promotor se mantuvo a alto nivel, tanto en CD133- y CD133 +
células HCT116 bajos (89% y 78%, respectivamente), mientras que se redujo drásticamente al 42% en CD133 +
pilas de gran (Figura 4E). La metilación reducida también se encontró de acuerdo con una regulación al alza significativa de
NANOG
expresión en CD133 +
pilas de gran (Figura 4F). Además, la sobreexpresión de exógena
NANOG Hoteles en células HCT116 se tradujo en un incremento de CD133 +
alta población (Figura 4G), lo que sugiere que la desmetilación de
NANOG
promotor contribuye a la iniciación de los CAC en el desarrollo tumoral.
circuitos de regulación pluripotencia de las células cancerosas
Oct4
,
Sox2
, y
NANOG
se ha demostrado que formar un bucle regulador de la transcripción en los CES para el mantenimiento de la pluripotencia [23] - [25]. Nos preguntamos si tal regulación cruzada se conserva en las células de cáncer con los patrones epigenéticos aberrantes. Se utilizaron células HCT116 con fondos genéticos diferentes p53 p53 porque se informó como una barrera para el restablecimiento de la pluripotencia [26]. Curiosamente, la sobreexpresión de exógena
OCT4
aumentó significativamente
NANOG
niveles de mRNA en p53 HCT116 - /- las células, pero no en HCT116 p53 + /+ células (Figura 5A; Figura S6B en S1 archivo). La inducción de
NANOG
expresión se asoció con una disminución de la metilación del promotor en p53 OCT4-HCT116 - /- células (de 95% a 66%; Figura 5B). Por otra parte, la sobreexpresión de la exógena
NANOG
mejora de forma significativa
Oct4
niveles de mRNA en células HCT116 con independencia de su estado de p53 (Figura 5C). Esto sugiere que el circuito regulador pluripotencia se conserva en las células cancerosas y se restauró parcialmente en células de cáncer a través del mecanismo epigenético que reprograma
NANOG
metilación del promotor.
(A) HCT116 p53 + /+ y p53 - /- células fueron infectadas con el
Oct4
GFP-lentivirus. fuerte inducción endógena de
NANOG
se encontró expresión de p53 en células HCT116 que expresan Oct4 - /- células. La expresión génica en células HCT116 sin infección se definió como 1, y Las veces de aumento en las células HCT116 con la infección se calcula? Ct. Los datos son la media ± SD de tres experimentos con duplicados. Se utilizó emparejado Estudiante
t
prueba para el análisis estadístico. (B)
NANOG
patrones de metilación del promotor de p53 HCT116 - células con o sin
Oct4
sobreexpresión - /. Las células HCT116 (C) fueron infectados con
NANOG
GFP-lentivirus. inducción significativa de endógena de
Oct4
se encontró expresión en tanto que expresan NANOG HCT116 p53 + /+ y p53 - /- las células. El cálculo de la expresión génica era el mismo como se describe en (A). Estudiante emparejado
t
prueba se utilizó para el análisis estadístico.
Discusión
La activación de las dianas moleculares de los genes pluripotencia asociada (
NANOG
,
Oct4
,
Sox2
, y
c CD -
MYC
) se observa con frecuencia en los cánceres pobremente diferenciados [11], [27].
Oct4
y
NANOG
expresión también se han encontrado asociados con propiedades CSC en los cánceres humanos [28] - [33]. En este estudio, hemos demostrado una célula madre firma epigenética de los genes pluripotencia asociada en líneas celulares de cáncer; en particular un aumento de la expresión de
NANOG
en células de HCC metastásicos y en los tumores de HCC mal pronóstico humanos (Figura 1B, 1C, 2A, 3, Tabla 1), que presumiblemente se asocia con su promotor hypomethylated estado y la supresión de
p53
. También hay que destacar que
NANOGP8
, codifica una proteína con más del 99,5% de similitud con la proteína auténtica NANOG1, se expresa en una variedad de células cancerosas, incluyendo las células HCT116 [34], [35]. Es posible que
NANOGP8
nivel puede interferir con la detección de
NANOG
expresión en nuestro estudio, ya que la sonda TaqMan utilizados no pueden distinguir entre las dos secuencias de genes. Es importante destacar que nuestros datos indicaban que la fuerte
NANOG
expresión se asoció con el inicio de una población putativo CSC (Figura 4D-G) y promovida
in vivo
metástasis tumoral en la (Figura 4A-C) . Por lo tanto, la hipótesis de que la desmetilación de
NANOG
se produce durante el desarrollo tumoral y la expresión correspondiente de
NANOG
proporciona células tumorales con propiedades metastásicas CSC.
Se han propuesto que las células cancerosas adaptarse a una firma epigenética de "troncalidad". Diferentes células cancerosas exhiben sus patrones únicos de la metilación del ADN, modificaciones de las histonas, y la expresión génica pluripotentes que pueden reflejar los diferentes orígenes tisulares. Interesantemente, CMPI albergan firmas de metilación del ADN residuales de su origen tejido somático [13] - [16]. A pesar de que aún no se ha determinado si el fenómeno de asociados memoria epigenética con el desarrollo del cáncer, nuestros datos sugieren la posibilidad de que diferentes orígenes tisulares de los cánceres podrían contener diferentes potenciales cancerígenos cuando son sometidos a alteraciones epigenéticas, de los cuales algunos son más propensos a volver aCTIVAR genes pluripotentes mediante la adquisición de una firma epigenética de células madre.
Oct4 y Nanog son los componentes básicos de los complejos de proteínas para el mantenimiento de la pluripotencia y la activación del circuito de regulación transcripcional. Nuestra observación de
Oct4
/
NANOG
cruzada de inducción en las células HCT116 demuestra además una conservación de la función de regulación cruzada entre los factores pluripotentes en células cancerosas (Figura 5).