Extracto
177Lu-DOTA-HH1 (
177Lu-HH1) es una novela radioinmunoconjugado anti-CD37 desarrollado para tratar el linfoma no Hodgkin. Los ratones con xenoinjertos Ramos subcutáneos fueron tratados con diferentes actividades de
177Lu-HH1,
177Lu-DOTA-rituximab (
177Lu-rituximab) y no específicos
177Lu-DOTA-IgG
1 (
177Lu-IgG
1) y efecto terapéutico y la toxicidad del tratamiento se controlaron. retraso del crecimiento tumoral significativa y aumento de la supervivencia de los ratones se observaron en los ratones tratados con 530 MBq /kg
177Lu-HH1 en comparación con los ratones tratados con actividades similares de
177Lu-rituximab o no específica
177Lu-IgG1 , 0,9% de NaCl o no marcados HH1. Todos los ratones inyectados con 530 MBq /kg de
177Lu-HH1 tolera bien el tratamiento. En contraste, 6 de cada 10 ratones tratados con 530 MBq /kg
177Lu-rituximab experimentado toxicidad severa radiación. La retención de
177Lu-rituximab en los órganos del sistema de fagocitos mononucleares era más largo que para
177Lu-HH1, lo que explica la alta toxicidad observada en los ratones tratados con
177Lu-rituximab.
in vitro
estudios demostraron que la internalización
177Lu-HH1 internaliza más rápido y en un grado más alto que
177Lu-rituximab lo que podría ser la razón para el mejor efecto terapéutico de
177Lu-HH1.
Visto: Repetto-Llamazares AHV, Larsen RH, Patzke S, Fleten KG, Didierlaurent D, Pichard A, et al. (2015) dirigida la terapia del cáncer con una novela anti-CD37-beta que emite partículas radioinmunoconjugado para el tratamiento del linfoma no Hodgkin. PLoS ONE 10 (6): e0128816. doi: 10.1371 /journal.pone.0128816
Editor Académico: Ken Mills, la Universidad Queen de Belfast, Reino Unido
Recibido: 9 Febrero 2015; Aceptado: 30 de abril de 2015; Publicado: 11 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Repetto-Llamazares et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue financiado en parte por los números de subvención del Consejo de Investigación de Noruega (http://www.forskningsradet.no) 213633 y 219454 y por Nordic nanovector ASA ( http://www.nordicnanovector.com). Los co-autores Ada H. V. Repetto-Llamazares y Jostein Dahle se emplean por Nordic nanovector ASA. Nordic nanovector ASA prestado apoyo en forma de salarios de los autores AHVR-L y JD, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Co-autor Roy H. Larsen está afiliado a Sciencons AS. Sciencons AS es accionista de Nordic nanovector ASA. Sciencons AS no proporcionar apoyo en forma de salario para el autor de la BSR, y no tenía ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. Este estudio fue financiado en parte por Nordic nanovector ASA (http://www.nordicnanovector.com/). Los autores Jostein Dahle y Ada H. V. Repetto-Llamazares se emplean por Nordic nanovector ASA, y Roy H. Larsen es un miembro de la Junta de Nordic nanovector ASA y Sciencons AS y los tres de ellos son accionistas de Nordic nanovector ASA. 177Lu-HH1 es el principal producto de Nordic nanovector ASA. No hay patentes, otros productos en desarrollo o los productos comercializados más que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales
Introducción
A pesar de la promesa de la terapia con el anticuerpo monoclonal rituximab desnuda (MAB), un número considerable de los pacientes tratados con las dosis convencionales de rituximab solo o en combinación con quimioterapia no obtener una respuesta completa y eventualmente puede recaer [1]. Los tratamientos alternativos han sido mAb anti-CD20 conjugado con
131I (tositumomab) o
90Y (ibritumomab tiuxetan-). El tratamiento con las actividades convencionales de los anticuerpos monoclonales radiomarcados ha producido mayor respuesta global y las tasas de remisión completa en comparación con los anticuerpos monoclonales desnudos [2-5]. Teniendo en cuenta que la radioinmunoterapia (RIT) se utiliza sobre todo después de que los pacientes han sido tratados con varias rondas de rituximab y que los dos radioinmunoconjugados aprobados (RIC) para uso clínico,
90Y-ibritumomab-tiuxetan (Zevalin) y
131 I-tositumomab (Bexxar), destinatarios con el mismo antígeno CD20 como rituximab, es deseable diseñar un nuevo RIC que se centrará en un antígeno diferente que CD20. El antígeno CD37 se expresa abundantemente en las células B, pero está ausente en las células plasmáticas y células madre normales [6-8]. Por lo tanto, CD37 parece ser una diana terapéutica adecuada en pacientes con neoplasias derivadas de células B con recaída, tales como CLL de células B, leucemia de células peludas (HCL) y de células B NHL.
RIT con CD37 como objetivo previamente se ha explorado el uso de un
anticuerpo marcado con 131I murino monoclonal (MB-1), tanto en un modelo de ratón y en pacientes [9-14]. A mayor grado de internalización y degradación de
131I-etiquetado RIC se encontró para CD37 que para CD20 [14]. A pesar de las respuestas clínicas prometedores observados en estos estudios clínicos para el anticuerpo anti-CD37, un mayor desarrollo de RIT se centró en CD20 como el antígeno diana y no se han hecho esfuerzos para desarrollar posteriores RIT con CRI basados en anti-CD37. Un número limitado de otras inmunoterapias basadas anticuerpo CD37 dirigida haber, sin embargo, ha evaluado en pacientes. La pequeña proteína immunopharmaceutical modular Otlertuzumab ha avanzado en los ensayos clínicos [15], y recientemente reportado en fase de datos II en combinación con bendamustina [16]. Además, el anticuerpo CD37.1 Fc de ingeniería (BI836826) [17] ha entrado recientemente en la fase I [18]. Además, dos conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) se han desarrollado que covalentemente enlazar agentes citotóxicos a anticuerpos CD37 segmentación para mejorar su potencia antitumoral: IMGN529 [19] y AGS-67E [20]. ADC están diseñados para dar la liberación específica de compuestos citotóxicos a células que expresan el antígeno diana, a través de ADC de unión, internalización y liberación de la carga útil intracelular. Los datos clínicos han demostrado el potencial de ADCs para la terapia del cáncer de CD30 y HER2 tumores positivos [21,22]. Todos estos fármacos CD37 orientación habían mostrado resultados prometedores, que valida aún CD37 como un objetivo para el tratamiento de NHL y CLL. Una ventaja de RIT en comparación con los anticuerpos monoclonales desnudos y ADCs es el rango de la radiación emitida, lo que da un efecto de fuego cruzado de modo que las células tumorales con menos antígenos o células tumorales no accesibles también son golpeados por la radiación citotóxica. Queda por ver si el mecanismo de acción de RIT es mejor que la de los ADC.
La potencia de RIT contra el antígeno CD37 internalización podría haber sido subestimado por el uso del radionucleido
131 I, el cual tiende a ser escindido del anticuerpo y se excreta de las células tras la internalización y el catabolismo cuando se utiliza como "no residualizante" radiomarcador tirosina-incorporado, como se hizo en los primeros estudios con
131I-MB-1 [23]. radiomarcadores "residualizante", por otro lado, se encuentran atrapados en las células después del metabolismo de la RIC. En un esfuerzo por volver a evaluar y mejorar RIT contra CD37 hemos desarrollado una nueva RIC (Betalutin) en base a la "residualizante" radiomarcador
177Lu vinculada a la anti-CD37 anticuerpo HH1 [24]. El tratamiento con 100 MBq /kg
177Lu-HH1 dio lugar a un aumento de tres veces en la supervivencia de ratones SCID que fueron por vía intravenosa inyectado con células de linfoma Daudi en comparación con los ratones de control no tratados [7]. ratones SCID no son capaces de reparar el ADN de doble filamento se rompe [25], lo que limita la cantidad de radiactividad que puede ser administrado, mientras que los ratones desnudos pueden tolerar dosis más altas de radiación. Un xenoinjerto de tumor subcutáneo en ratones desnudos es un modelo más relevante para el tipo voluminoso de la enfermedad que se encuentra a menudo en los pacientes con LNH que el modelo intravenosa en ratones SCID. Por lo tanto, el efecto terapéutico y la toxicidad de
177Lu-HH1 se evaluó en ratones desnudos con xenoinjertos Ramos subcutánea en el presente documento.
Materiales y Métodos
Las células tumorales
células de linfoma Ramos (Normas LGC, Boras, Suecia) que expresa los receptores CD20 y CD37 se cultivaron en RPMI 1640 complementado con Glutamax (Gibco, Paisley, Reino Unido), 10% inactivado por calor FCS (Gibco) y 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco) en una atmósfera húmeda con un 95% de aire /5% de CO
2.
el radiomarcado de anticuerpos
Los anticuerpos HH1 (anti-CD37, Nordic nanovector ASA, Oslo, Noruega ), Rituximab (anti-CD20, Roche, Pharma Schweiz, Basilea, Suiza) y el anticuerpo de control de isotipo no específico murino (IgG
1) (MAB002, R & amp; D Systems Inc., Minneapolis, EE.UU.) se marcaron con el quelante p-SCN-Bn-DOTA (DOTA, macrocíclicos, TX, EE.UU.) y posteriormente etiquetados con
177Lu (ITG, Garching, Alemania) como se describe anteriormente [26]. Etiquetado con
125I (Hartmann Analytic, Braunschweig, Alemania) se realizó utilizando yodógeno tubos (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) como se describe anteriormente [23].
La inmunorreactividad (IRF) de todos los tumores CRI específicos se verificó utilizando un método de Lindmo modificado [27] con la concentración de una célula de 75 millones de células /ml. La IRF de todos los CRI específicos fue entre 57% y 76%.
El número de receptores de la superficie celular
Scatchard análisis se realizaron utilizando
177Lu-HH1 o
125I-rituximab. Una concentración de 10 millones de células /ml de células de linfoma de Ramos se incubaron durante 1 hora con cantidades crecientes de radioinmunoconjugados (entre 0 y 6,25 nM). Las células previamente bloqueados con anticuerpo no marcado se utilizaron para dar cuenta de la unión no específica. Cada muestra se midió por duplicado y los resultados se promediaron. Después de la incubación con el RIC, la actividad en cada muestra se midió usando un contador gamma (Cobra gamma; Packard Instrument Co, Meriden, CT, EE.UU.) y se lavaron las células dos veces con DPBS (Gibco, Paisley, Reino Unido) suplementado con 0,5% en peso de albúmina de suero bovino (BDH Prolabo, VWR, Lutterworth, Leicestershire, Reino unido), después de lo cual la actividad unido a las células se contó en el contador gamma. La disociación constante de equilibrio (K
d) y la densidad media máxima de antígenos (B
max) se calculó de la conexión de los datos experimentales. Se realizaron tres experimentos usando
177Lu-HH1 y 2 experimentos utilizando
125I-rituximab. Los resultados de todos los experimentos para cada RIC se promediaron para obtener un valor medio de K
D y B
máximo para cada RIC.
experimentos de internalización
HH1-DOTA fue etiquetado con Alexa Fluor 488 y rituximab con Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, Invitrogen, Paisley, UK). Un millón de células Ramos por ml en medio de cultivo se incubaron con 10 mg /ml de HH1 o 20 mg /ml de rituximab, ya sea para 19 horas a 37 ° C o 1 hora a alrededor de 4 ° C. Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) se añadió a las células a una concentración de 2 mg /ml 1 hora antes de formación de imágenes. Las celdas eran imágenes con un sistema de microscopio AxioImager Z1 ApoTome (Carl Zeiss, Jena, Alemania) usando un PlanApo 63 × lente /DIC N.A.1.4, filtros ópticos adecuados, una cámara AxioCam MRm y Axiovision 4.8.2 (Carl Zeiss). Z se obtuvieron secciones por cada 1 m a través de todo el volumen de la celda. Las imágenes se presentan como superposiciones de imágenes de fluorescencia de imagen DIC-z sección central y. 20 a 40 células fueron escaneadas para cada tratamiento.
Animales y xenoinjertos
A nivel institucional criado hembra desnudos atímicos Fox1
nu se utilizaron ratones. La edad y el peso de los ratones se dan en la Tabla 1. Los animales se mantuvieron en condiciones libres de patógenos con un ciclo de luz de 12 horas a una temperatura ambiente de 23 ° C y humedad relativa del aire de 55% en jaulas de plástico. Alimentos y agua fueron suministrados
ad libitum
y ropa de cama se cambian regularmente. Los ratones se anestesiaron con inyecciones subcutáneas de 70 a 100 l de la mezcla Tiletamin-zolazepam (Virbac, Carros Cedex, Francia) diluido 1: 5 con agua estéril antes de la implantación de piezas de Ramos tejido linfoma de xenoinjerto de ratones portadores, (diámetro 1,5-2 mm) en los flancos. Todos los procedimientos y los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por la Autoridad de Investigación de Animales de Noruega (NARA). El Departamento de Medicina Comparada veterinario institucional ha establecido las normas para la alimentación, monitoreo, manejo y sacrificio de animales de acuerdo con las normas establecidas por el Ministerio de Agricultura de Noruega y "La Convención Europea para la Protección de los animales vertebrados utilizados para experimentación y otros fines científicos ". El veterinario institucional ha delegado autoridad de la Autoridad de Investigación Animal de Noruega (NARA). Las instalaciones de los animales de laboratorio están sujetos a un programa de rutina de vigilancia de la salud y la prueba de los organismos infecciosos acuerdo con una modificación de la Federación de Asociaciones Europeas de Laboratorio de Ciencia Animal (FELASA) recomendaciones.
Terapia y experimentos de toxicidad
Los animales que tienen tumores que crecen con diámetros entre 4 y 12 mm fueron asignados al azar en jaulas según el grupo de tratamiento y se les administró por vía intravenosa con 100 l de soluciones de inyección ajustados por peso individual del ratón. Dos experimentos preliminares se realizaron con la inyección de las actividades entre 50 y 1000 MBq /kg
177Lu-HH1 (S1 File). Estos experimentos se utilizan para decidir los parámetros experimentales elegidas para los dos experimentos presentados en este trabajo (Tabla 1) que incluía inyectados actividades de 410 y 530 MBq /kg
177Lu-HH1, 300 y 530 MBq /kg
177Lu -rituximab, 530 MBq /kg
177Lu-IgG
1 y 15 mg /kg HH1 y 0,9% de NaCl como grupos de control.
Los ratones se pesaron y se observaron clínicamente dos a tres veces a la semana para un máximo de 109 días. Además, los ratones se controlaron diariamente para detectar cualquier signo de enfermedad o malestar. El nivel de actividad, estado de la piel (eczema, hemorragias, etc.) y la salud general de los ratones se observaron diariamente. Los ratones se sacrificaron por dislocación cervical bajo anestesia de gas Sevoflurane si se alcanzaron cualquiera de los siguientes puntos finales humanas: diámetro del tumor superó 20 mm, el peso corporal disminuyó en un 20% de mayor peso corporal o los animales de lo contrario mostraron síntomas de enfermedad grave y la incomodidad
el crecimiento del tumor se monitorizó hasta la primera medición del volumen del tumor mayor que 2.000 mm
3 en cada ratón (tumores más grandes generalmente se desarrollan heridas necróticas). La remisión completa se definió como no tumor observable. Los ratones llegar a esta etapa se consideraron como respondedores a largo plazo.
Hematología.
muestras de sangre fueron tomadas antes de la inyección, la muerte y cada 4 a 7 semanas después de la administración del tratamiento. El muestreo de sangre se realizó como se describe anteriormente [26]. toxicidad de la radiación se definió como el recuento de glóbulos blancos por debajo de 1 × 10
9 1 /L, los recuentos de plaquetas por debajo de 400 × 10
9 1 /L, peso repentina pérdida alrededor del 5% en el lapso de 2 a 3 días - acompañado de un bajo nivel de actividad, y un estado general de la enfermedad. Las comparaciones entre los valores medios de los diferentes grupos de tratamiento se realizaron mediante pruebas t con un nivel de significación de 0,05.
Un ratón tratado con 530 MBq /kg
177Lu-HH1 fue sacrificado 11 días después de la inyección de tratamiento con el fin para obtener los datos de la hematología y la histología en este punto de tiempo particular. Por otra parte, para obtener más datos hematológicos 3 ratones que tienen diámetros de los tumores entre 12 y 15 mm (800 y 1300 mm 3) también se incluyeron en el experimento 2.
Histopatología.
Los ratones se realizó la necropsia y el corazón, los pulmones, el hígado, el estómago, el bazo, los intestinos delgado y grueso, los riñones, el fémur, músculo, cráneo, cerebro, tumor, piel, ovarios y los ganglios linfáticos se fijaron y se envían a Accelera, Milano, Italia para la fundición, el corte, la tinción y examen patológico .
experimentos de biodistribución
Los conjugados fueron administrados por inyección en la vena de la cola de una solución de 100 l (0,2 y 0,9 MBq) a cada animal. Entre 4 y 7 los ratones fueron sacrificados por dislocación del cuello con anestesia gas sevoflurano en cada punto de tiempo después de punción cardíaca para el muestreo de sangre. el tamaño del tumor en la inyección de conjugados variaron entre 120 y 1800 mm
3. Se realizaron estudios como se describe en la referencia [28]. Las comparaciones entre los valores medios se realizaron mediante pruebas t con un nivel de significación de 0,05.
Un piloto
En vivo
SPECT /CT se realizó el 2 de ratones con xenoinjertos subcutáneos Ramos con diámetros de alrededor de 12 mm en su flanco derecho en un NanoSPECT /CT (Bioscan, Inc., Washington DC, EE.UU.). adquisiciones SPECT /CT se realizaron a los 3, 24 y 48 horas después de la inyección en el tratamiento 1 del ratón y después de 24 horas en el ratón 2. Actividades medidos por SPECT /CT se compararon con las mediciones ex vivo realizados a las 48 horas después de la administración del tratamiento. Los ratones fueron inyectados i.v. con 150 l de 10 MBq de
177Lu-HH1 y fueron anestesiados con isoflurano al 2% para la adquisición de imágenes.
Dosimetría
La tasa de dosis absorbida y dosis de
177Lu-HH1 y
177Lu-rituximab en ratones se calcularon como se describe en la referencia [28] para una inyección de 1 MBq /ratón (40 MBq /kg) y suponiendo que la energía de las partículas beta significa, Auger- y conversión electrones sean 0.1473 MeV [29]. La fracción de auto-radiación para el tumor se estimó en 0,944 (200 mg tumor [30]).
El análisis estadístico
La supervivencia de los diferentes grupos de tratamiento se comparó mediante análisis de supervivencia de Kaplan-Meyer utilizando SigmaPlot para Windows versión 12.0 (Systat Software Inc, California, EE.UU.), utilizando el tiempo para alcanzar un volumen tumoral superior a 4 veces el volumen inicial del tumor o la eutanasia debido a los síntomas de toxicidad por radiación como los criterios de valoración. Hematología y datos de biodistribución se compararon mediante ANOVA de una vía. Se realizaron comparaciones múltiples utilizando el método de Holm Sidak. Un nivel de significación de p & lt; 0,05 se utilizó en todas las pruebas.
Resultados
Terapia y toxicidad experimentos
El crecimiento del tumor y la supervivencia.
Hubo un retraso en el crecimiento tumoral en ratones marcada tratados con 530 MBq /kg
177Lu-HH1 en comparación con ratones tratados con
177Lu-IgG
1 o 0,9% de NaCl (Fig 1A). El crecimiento del tumor también se retrasó en algunos de los ratones tratados con 530 MBq /kg
177Lu-rituximab, pero este tratamiento demostrado ser tóxico: 60% de los ratones tenían que ser sacrificados debido a los síntomas de toxicidad por radiación grave entre 11 y 18 días después de la inyección de tratamiento (Tabla 2). Ninguno de los ratones fueron sacrificados debido a los síntomas de toxicidad radiación en cualquiera de los otros grupos de tratamiento. El crecimiento del tumor en los ratones de control tratados con 0,9% de NaCl o 15 mg /kg desnudo HH1 era no homogénea, con 30% y 10% de remisión completa, respectivamente. Por otra parte, los tumores en los ratones tratados con 530 MBq /kg
177Lu-IgG
1 creció de forma homogénea y no mostró ningún regresiones naturales. El número de respondedores a largo plazo fue más alto en los ratones tratados con 530 MBq /kg
177Lu-HH1 (Fig 1B). Además, el tratamiento con 530 MBq /kg
177Lu-HH1 extendió significativamente la supervivencia de ratones en comparación con
177Lu-IgG
1, 0,9% de NaCl y HH1 (p & lt; 0,05) (Fig 1C, la Tabla 2 ). La supervivencia de los ratones tratados con
177Lu-IgG
1 fue significativamente más corto que para los tratados con 0,9% de NaCl (p & lt; 0,05), lo que fue debido a la homogeneidad de crecimiento y la falta de la regresión del tumor observado en los ratones tratados con
177Lu-IgG
1, lo que podría estar relacionado con la radiación inducida por la inmunosupresión. Se ha demostrado previamente que el crecimiento de xenoinjertos en ratones se puede mejorar por irradiación de todo el cuerpo (WBI) [31-34] u otros agentes inmunomoduladores [32,35-38]. regresiones naturales de xenoinjertos en ratones desnudos en los grupos de control se han observado anteriormente [33,35], especialmente en ratones desnudos con xenoinjertos subcutáneos Ramos [39,40]. RIT puede ser considerado como un tipo de tratamiento WBI, por lo tanto, que puede resultar en una mejor toma y crecimiento de xenoinjertos en ratones tratados que en los ratones de control. Por lo tanto, la eficacia terapéutica de RIT puede ser subestimada en modelos de ratones donde la irradiación total del cuerpo aumenta el crecimiento del tumor, especialmente cuando se compara el efecto terapéutico de los CRI con agentes que tienen baja toxicidad sistémica tal como NaCl o mAbs sin marcar. Puede ser que sea más conveniente, por lo tanto, para comparar el efecto de los CRI a dosificaciones de CRI no específico, de control correspondientes en su lugar.
(A) el crecimiento del tumor individual (n = número de tumores en remisión al final del estudio /número total de tumores iniciales); (B) Porcentaje de pacientes que respondieron a largo plazo (ratones sacrificados debido a los síntomas de toxicidad por radiación o para mediciones de hematología antes de que uno de sus tumores alcanzaron un volumen de 2000 mm
3 no fueron considerados en el análisis); curva de supervivencia (C) de Kaplan-Meier. Punto final: tumor de volumen ≥ 4 veces el volumen inicial del tumor. Cruces representan los animales que fueron sacrificados antes de llegar a 4 veces el volumen inicial del tumor censurados. N = 9-10. Se realizaron comparaciones múltiples utilizando el método de Holm Sidak. El nivel de significación: p & lt; 0.05.
Dada la alta toxicidad observada durante las dos primeras semanas en algunos de los ratones tratados con
177Lu-rituximab, uno más experimento se realizó a través de las actividades más bajas. Los tratamientos con 410 MBq /kg
177Lu-HH1 y 300 MBq /kg
177Lu-rituximab (aproximadamente 50% de la DL50 de cada RIC) resultó en un retraso del crecimiento tumoral leve (Fig 2A). Los ratones tratados con 410 MBq /kg
177Lu-HH1 tuvo el mayor número de pacientes que respondieron a largo plazo, mientras que no hubo respuesta a largo plazo en los ratones tratados con 300 MBq /kg
177Lu-rituximab debido a la inhibición del crecimiento del tumor ( Fig 2B). La mediana de supervivencia fue mayor en los ratones tratados con 410 MBq /kg
177Lu-HH1 (más de 15 veces en comparación con el grupo control), pero la diferencia no fue estadísticamente significativa en comparación con los otros grupos de tratamiento (p & gt; 0,05) (Fig 2C, Tabla 2). La mediana de supervivencia de los ratones tratados con 300 MBq /kg
177Lu-rituximab fue de alrededor de 3 veces más largo que para los ratones del grupo de control, mientras que la mediana de supervivencia de los ratones tratados con 530 MBq /kg
177Lu-rituximab fue similar a los ratones en el grupo de control. Incluso cuando la cantidad de pacientes que respondieron a largo plazo fue mayor para la mayor actividad inyectada de
177Lu-rituximab la toxicidad del tratamiento tuvo un fuerte impacto en la supervivencia media. La actividad inyectada óptima para
177Lu-rituximab podría estar en entre 300 y 530 MBq /kg, en donde una cantidad óptima de respondedores a largo plazo podría ser encontrado sin toxicidad potencialmente mortal.
(A) del tumor individual crecimiento (n = número de tumores en remisión al final del estudio /número total de tumores iniciales) (B) Porcentaje de pacientes que respondieron a largo plazo; curva de supervivencia (C) de Kaplan-Meier. Punto final: tumor de volumen ≥ 4 veces el volumen inicial del tumor. Cruces representan los animales que fueron sacrificados antes de llegar a 4 veces el volumen inicial del tumor censurados. N = 5-6. Se realizaron comparaciones múltiples utilizando el método de Holm Sidak. El nivel de significación: p & lt; 0.05.
El peso corporal.
El peso corporal medio de los ratones tratados con CRI disminuyó drásticamente después de la inyección. La pérdida media de peso corporal duró alrededor de 7 días para el tratamiento con 530 MBq /kg y alrededor de 4 días de tratamiento con 410 y 300 actividades MBq /kg (figura 3). Posteriormente, el peso corporal medio de los ratones tratados comenzó a aumentar, tendiendo hacia el peso corporal medio de los grupos de control.
peso corporal promedio de los ratones desnudos con xenoinjertos Ramos tratados con 530 MBq /kg
177Lu -HH1, 530 MBq /kg
177Lu-rituximab, 530 MBq /kg
177Lu-IgG
1 no específica de control de isotipo, 15 mg /kg HH1, NaCl al 0,9%, 410 MBq /kg
177Lu-HH1 y 300 MBq /kg
177Lu-rituximab.
Hematología.
Los números medios de glóbulos blancos (WBC) y glóbulos rojos (RBC) para los ratones tratados con 530 MBq /kg de los diferentes CRI estaban por debajo de los valores para el grupo de control NaCl para 4 y 8 semanas pero normalizado al final del estudio (Fig 4A). El número medio de plaquetas (PLT) no varió significativamente entre los grupos de tratamiento y control. Sin embargo, entre los 11 y 25 días después del tratamiento con CRI, números de PLT WBC, RBC y fueron considerablemente menor en los ratones tratados con 530 MBq /kg, lo que indica un nadir alrededor de 2 semanas después de la administración del tratamiento. No había animales sacrificados de control en este intervalo de tiempo, pero los valores de control se puede suponer que estar cerca de los medidos al inicio del estudio y alrededor de 4 semanas después de la inyección en el grupo de tratamiento de NaCl.
El número de células blancas de la sangre (WBC ), glóbulos rojos (RBC) y plaquetas (PLT) en ratones con Ramos xenoinjertos tratados con 530 MBq /kg
177Lu-HH1, 530 MBq /kg
177Lu-rituximab, 530 MBq /kg
177Lu -IgG
1 no específica de control de isotipo, 15 mg /kg HH1, 0,9% de NaCl (A) y 410 MBq /kg
177Lu-HH1 y 300 MBq /kg
177Lu-rituximab (B). El área de cada círculo representa el número de ratones utilizados para calcular los valores medios. Círculos con reborde oscuro y conectada con las líneas representan muestras tomadas en los puntos fijos de tiempo durante el estudio en el que se tomaron muestras de todos los ratones vivos. Círculos sin borde oscuro y que no están conectados por líneas representan las muestras de sangre tomadas antes de la eutanasia, donde por lo general se sacrificaron uno o dos ratones. N = 1-10. Las barras de error = error estándar. *: Significativamente diferente del valor de NaCl grupo que corresponde al 0,9% (control) (ANOVA de una vía con el método de Holm Sidak para comparaciones múltiples, p & lt; 0,05) guía empresas
El número medio de WBC en ratones. tratados con 410 MBq /kg
177Lu-HH1 y 300 MBq /kg
177Lu-rituximab fue significativamente menor que para el grupo control 4 semanas después de la administración del tratamiento, pero los valores normalizados hacia el final del experimento (Fig 4B ). El número medio de RBC y PLT fueron similares para todos los grupos de tratamiento (p & gt; 0,05). No hubo muertes asociadas a síntomas graves de toxicidad de la radiación en este experimento. Sin embargo, el recuento de leucocitos en los ratones tratados con
177Lu-rituximab que fueron sacrificados a los 13 y 17 días debido a diámetro del tumor mayor que 20 mm tenía WBC, RBC y los valores PLT considerablemente más bajos que los valores medidos para el NaCl en los puntos de tiempo similares.
Histopatología.
los principales órganos afectados por el tratamiento con CRI con actividades iguales o superiores a 530 MBq /kg fueron la médula ósea, los ganglios linfáticos, el bazo y los ovarios. Los animales tratados con 530 MBq /kg
177Lu-rituximab mostraron cambios graves en los tejidos hemato-linfopoyético, incluyendo la disminución de la hematopoyesis extramedular, el agotamiento linfoide en el bazo y la atrofia de la médula ósea (Fig 5A), lo que indica el daño por radiación (Tabla 3). Estas observaciones fueron más graves cuanto más pronto los ratones tuvieron que ser sacrificados después de la inyección de tratamiento. Se hicieron observaciones similares para los tratamientos con 800 y 1000 MBq /kg de
177Lu-HH1 [26]. La mayoría de los ratones que muestran graves síntomas de toxicidad de radiación también se presentan hemorragias de la piel (figura 5B) que se inició como una erupción en la piel unos días antes de la eutanasia. Las observaciones histopatológicas estaban en buen acuerdo con las mediciones de hematología. Para las actividades de 530 MBq /kg y superiores ovarios fueron afectados [26]. Los ratones sacrificados entre los 11 a 25 días después de la administración del tratamiento, sin embargo, no mostró anormalidades en los ovarios, lo que indica que estas lesiones tienen más de 3 semanas para desarrollar
(A) Representante imágenes de:. Una médula ósea normal de un ratón en el grupo de NaCl (sacrificados 109 días después del tratamiento), marcada celularidad reducida en un ratón tratado con 530 MBq /kg
177Lu-HH1 sacrificados 11 días después del tratamiento, moderada reducción de la celularidad en un ratón tratado con 530 MBq /kg
177Lu-IgG
1 eutanasia 25 días después del tratamiento y severa celularidad reducida en un ratón tratado con 530 MBq /kg
177Lu-rituximab sacrificados 15 días después del tratamiento. (B) Ejemplo de un ratón con hemorragias graves en la piel 11 días después de la administración de 530 MBq /kg
177Lu-rituximab. El ratón fue sacrificado el día que se tomaron las imágenes.
biodistribución y la dosimetría
liquidación de sangre fue ligeramente más rápido para
177Lu-rituximab que para
177Lu -HH1 (figura 6A), que dio una dosis absorbida por la sangre en ratones tratados con
177Lu-rituximab alrededor de la mitad de la de
177Lu-HH1 (Tabla 4, figura 6B). La retención de
177Lu-rituximab en el hígado, el bazo y el fémur fue significativamente más largo que el de
177Lu-HH1 o
177Lu-IgG
1 (Fig 6A y 6B) y por consiguiente la dosis absorbida a estos Los órganos fueron 2-3 veces mayor para el tratamiento con
177Lu-rituximab que para
177Lu-HH1. La mayor absorción de
177Lu-rituximab en el fémur (Tabla 4), probablemente resultado en una dosis absorbida superior a la médula roja, que es consistente con la mayor toxicidad y la reducción de la celularidad de la médula ósea observada en los ratones tratados con
177Lu-rituximab . La captación en el tumor fue más rápido para
177Lu-rituximab, pero la retención fue más corto (no estadísticamente significativa, p & gt; 0,05) que para los
177Lu-HH1 (Fig 6A). Las dosis absorbidas a tumores estaban cerca de 2 Gy para ambos
177Lu-HH1 y
177Lu-rituximab (Tabla 4). La captación y retención de
177Lu-HH1 y
177Lu-IgG
1 de control fueron similares para todos los órganos /tejidos excepto para los riñones y el tumor (Figura 6A).
(A) Captación de
177Lu-HH1 (N = 6-8),
177Lu-rituximab (N = 4-5),
Control 177Lu-IgG1 (N = 5) en una selección de órganos /tejidos de los ratones nude con Ramos xenoinjertos en porcentaje de actividad inyectada por gramo de tejido (% IA /g). Las barras de error = error estándar. *: Significativamente diferente de
177Lu-HH1 (ANOVA de una vía con el método de Holm Sidak para comparaciones múltiples, p & lt; 0,05). (B) Tasa de dosis por MBq de actividad inyectada en los órganos seleccionados de ratones desnudos con xenoinjertos tratados con Ramos
177Lu-HH1 (N = 6-8) y
177Lu-rituximab (N = 4-5). (C)
En vivo
SPECT /CT multiplanar vista renderizada de un ratón desnudo con un xenotrasplante Ramos en su flanco derecho inyectado con 10 MBq de
177Lu-HH1.
imágenes SPECT /CT mostraron una elevada captación y heterogéneo de tumores en comparación con otros tejidos 48 horas después de la inyección de
177Lu-HH1 (figura 6C). La absorción en los pulmones, el corazón y la aorta fue alta 3 horas después de la inyección y disminuyó con el tiempo cada vez mayor, reduciéndose considerablemente después de 48 horas. La captación en el tumor fue baja 3 horas después de
administración 177Lu-HH1 pero aumentó con el tiempo y fue más alta que en otros tejidos después de 48 horas. La diferencia de captación tumoral medida por SPECT y contador gamma fue inferior al 10%, lo que muestra una buena concordancia entre las mediciones realizadas
in vivo
con SPECT y
ex vivo fotos: por recuento gamma.
experimentos de internalización
HH1 fue casi completamente internalizados después de 19 horas de incubación a 37 ° C, mientras que no hubo interiorización significativa después de 1 hora de incubación a 4 ° C.