Extracto
Los ensayos clínicos han confirmado la seguridad de los adenovirus oncolíticos de forma selectiva para el tratamiento de cánceres avanzados. Sin embargo, los virus cada vez más eficaces podrían resultar en más efectos secundarios y por lo tanto, sería útil si la replicación podría ser anulada si es necesario. Se analizaron los virus que contienen la ciclooxigenasa-2 (COX-2) o factor de crecimiento endotelial vascular promotor (VEGF) para el control de la replicación. Los agentes antiinflamatorios pueden disminuir la Cox-2 niveles de proteína y por lo tanto también la hipótesis de que el promotor podría verse afectada. Como Cox-2 modula la expresión de VEGF, también el promotor de VEGF podría ser controlable. En primer lugar, se evaluó el efecto de los agentes anti-inflamatorios en la actividad del promotor de adenovirus o infectividad
in vitro
. Además, se analizó la potencia de los virus oncolítico
in vitro
y
in vivo
con y sin los reactivos. Por otra parte, se analizó el efecto de la sobre el virus de replicación. Se encontró que el RGD-4C o 3 fibras Ad5 /modificados mejoraron la potencia de los virus oncolítico
in vitro
y
in vivo
. Se encontró que ambos promotores podrían ser regulados a la baja con dexametasona, salicilato de sodio, o ácido salicílico. eficacia oncolítico correlacionada con la actividad promotora y
in vitro
la producción de virus en podría suprime con las sustancias.
In vivo
, vimos una buena eficacia terapéutica de los virus en un modelo de terapia intravenosa de metástasis de cáncer cervical, pero el efecto inhibidor de la dexametasona no fue lo suficientemente fuerte como para proporcionar diferencias significativas en un complejo
in vivo
medio ambiente. Nuestros resultados sugieren que los fármacos anti-inflamatorios pueden afectar a la replicación del adenovirus, lo que podría ser relevante en caso de efectos secundarios asociados de replicación
Visto:. Kanerva A, Lavilla-S Alonso, Raki M, L Kangasniemi, Bauerschmitz GJ, Takayama K, et al. (2008) La terapia sistémica para el cáncer de cuello del útero con Potencialmente regulable Oncolítico adenovirus. PLoS ONE 3 (8): e2917. doi: 10.1371 /journal.pone.0002917
Editor: Alfred Lewin, Universidad de Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de mayo de 2008; Aceptado: 7 Julio 2008; Publicado: 13 Agosto 2008
Derechos de Autor © 2008 Kanerva et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el 6PM THERADPOX UE y APOTHERAPY, Fondos de Investigación HUCH (EVO), Fundación Sigrid Juselius, Academia de Finlandia, Fundación Emil Aaltonen, Sociedad de cáncer de Finlandia, Universidad de Helsinki, Fundación Sohlberg, Fondo de Investigación Instrumentarium, Asociación de Oncología de Finlandia, Helsinki Biomédica de Posgrado escuela, Helsinki escuela de Graduados en Biotecnología y Biología Molecular, Fundación Cultural de Finlandia, la Fundación de Investigación de Bayer Schering Pharma, Deutsche Forschungsgemeinschaft /DFG y Biocentrum Helsinki. A. H. K. es Albin Johansson Profesor de Investigación del Instituto de Cáncer de Finlandia. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La patogénesis del cáncer de cuello de útero se caracteriza por la persistencia de la infección con el virus del papiloma un alto riesgo humano (VPH), generalmente aceptados como se requiere para la iniciación del cáncer de cuello uterino. En una fracción de los pacientes, la infección por VPH progresa de displasia y carcinoma
In situ
a cáncer invasivo y la enfermedad metastásica [1]. Sólo unas pocas cepas virales son específicamente responsables de las neoplasias cervicales, de los que el HPV16 durante más de la mitad de los casos notificados. Por desgracia, ni mejoras en la cirugía ni la radioterapia se han reducido significativamente la mortalidad de los pacientes con avanzado, recurrente o metastásica. La Sociedad Americana del Cáncer estima que alrededor de 9 700 nuevos casos y 3 700 muertes en cáncer de cuello uterino en 2006 [2]. Sin embargo, el cáncer de cuello uterino sigue siendo la principal causa de mortalidad por cáncer ginecológico en todo el mundo con más de 270 000 muertes en 2002 [3].
terapia génica adenoviral se ha propuesto como una nueva alternativa de tratamiento para el cáncer avanzado [4]. Sin embargo, la transducción de tumor eficaz sigue siendo la etapa limitante para lograr resultados clínicos. adenovirus oncolíticos pueden ser útiles en este sentido [5]. Estos virus tienen una naturaleza citolítica,
es decir. Francia El ciclo de vida replicativa de los resultados de virus en la destrucción de la célula huésped. Las modificaciones en el genoma viral reducir la replicación en los tejidos normales, mientras que las células tumorales continúan para permitir la replicación productiva que conduce a la lisis de células de cáncer (oncolisis). Tipo I adenovirus oncolíticos cuentan con mutaciones de pérdida de función en el genoma del virus, que se compensan por mutaciones en el cáncer, pero no las células normales. Esto se puede lograr mediante la incorporación de las deleciones en los genes adenovirales tempranos resultantes en proteínas E1 mutantes incapaces de unirse proteínas celulares necesarias para la replicación viral en las células normales, pero no en las células cancerosas. En los virus de tipo II, promotores de tumores o tejidos específicos reemplazan promotores virales endógenos tales como el promotor E1A, para restringir la replicación viral a los tejidos diana que expresan el promotor.
Aunque los ensayos clínicos han confirmado la seguridad de los adenovirus oncolíticos para el tratamiento de cánceres avanzados [6] - [9], la mayoría de los ensayos han aparecido virus relativamente atenuadas. Por lo tanto, cada vez más eficaces agentes pueden provocar la mayor toxicidad y, por tanto, sería útil si la replicación podría ser anulada si es necesario. La expresión de genes de ciertos promotores puede ser regulada. Por ejemplo, el gen de respuesta de crecimiento temprano 1 (
egr
-1) potenciador /promotor, ha sido utilizado como un promotor regulable para la expresión específica de HSV-TK en células de glioma y puede ser inducida por la radiación [10] . Otra estrategia de regulación es el uso de promotores inducibles por hipoxia [11]. Además, la regulación se puede conseguir con los promotores químicamente inducibles. Por ejemplo, un promotor de tetraciclina activado se puede utilizar para regular la expresión génica y la producción de proteínas posterior por tetraciclina oral. La retirada del fármaco abroga rápidamente la expresión del gen [12].
Cox-2 es la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de prostaglandinas, y que está implicado en el control de las reacciones inflamatorias en respuesta a una lesión o infección. El uso de fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) ha indicado que el nivel de actividad y también de la proteína COX-2 puede ser regulada. Aunque otros factores además de la actividad del promotor a menudo tienen un papel en los niveles de expresión de proteínas, los estudios han demostrado que la actividad del promotor de la Cox-2 se correlaciona bien con la expresión de proteína [13]. Además, la actividad del promotor de la Cox-2 en tejidos normales más saludables es baja, a menos que es inducida por factores de crecimiento (tales como VEGF), citoquinas o factores específicos del tumor [14]. Con respecto a los adenovirus, el órgano más relevante para la toxicidad es el hígado. Por lo tanto, es útil que la expresión hepática de la Cox-2 es baja [15], [16]. Cox-2 puede tener un papel en la carcinogénesis de muchos cánceres epiteliales, y los niveles de expresión se han relacionado con la invasividad tumoral y la angiogénesis [14]. Estas razones han conducido a la utilización del promotor de la Cox-2 como un promotor específico de tumor para el cáncer de la expresión específica de [15] - [20]
VEGF tiene un papel importante en la inducción de la angiogénesis asociada a tumores, como. es un mediador de la proliferación endotelial celular, la diferenciación, y la permeabilidad vascular [21]. VEGF se expresa ampliamente durante la tumorigénesis y se detecta en la mayoría de los tumores epiteliales malignos [18], [19], [21] de la Cox-2 o factores de crecimiento como el TGF-β1 puede regular VEGF [22], [23]. Además, las masas tumorales sólidos voluminosos contienen áreas hipóxicas, que cuentan con altos niveles de factor de transcripción HIF-1, que a su vez induce VEGF y COX-2 expresión [23]. Por lo tanto, la regulación y expresión de la COX-2 y VEGF están vinculados. En consecuencia, no es completamente sorprendente que también el promotor de VEGF ha demostrado utilidad para la expresión específica del tumor [18], [19], [24]. Una posibilidad sin explorar hasta ahora es la regulación de los promotores de VEGF Cox-2 y por los agentes anti-inflamatorios. Esto podría ofrecer un interruptor de seguridad en caso de promotor mediada por efectos secundarios en ensayos clínicos.
clínicos muestras de cáncer de cuello uterino expresan altos niveles de Cox-2, mientras que es indetectable en el revestimiento epitelial normal del cuello uterino. Además, hay un aumento progresivo de la Cox-2 niveles en función de fase de la enfermedad, y también el tamaño del tumor. Cox-2 expresión es también un factor predictivo negativo para la supervivencia [25], [26]. Con respecto a VEGF y el cáncer cervical, un alto nivel de tratamiento previo se ha encontrado que asociar con grandes tumores, invasión del estroma y de la pelvis metástasis en los ganglios linfáticos. La expresión de VEGF también se correlaciona con mal pronóstico [27] - [29]. Por lo tanto, ambos promotores son atractivos candidatos para los enfoques de terapia génica específicos para el cáncer de cuello uterino.
El salicilato de sodio y ácido salicílico son los AINE, que enzimáticamente inhibir la COX-2. Además, se ha informado de que estas sustancias disminuyen Cox-2 niveles de mRNA, que podría estar mediado a través de la modulación de la actividad del promotor [13], [30]. La dexametasona es un esteroide antiinflamatorio que inhibe la expresión tanto de Cox 2-mRNA y de la proteína [30]. Además, la desestabilización del ARNm post-transcripcional puede ser un mecanismo importante en la acción de la dexametasona [31]. TGF-β1 es una citocina factor de crecimiento de péptido y anti-inflamatoria, que es producida por muchas células, pero se encuentra más concentrado en las plaquetas de mamíferos. Se puede modular por para la proliferación celular y la diferenciación ejemplo, la angiogénesis y la metástasis, y se ha demostrado que tienen un efecto sobre la Cox-2 niveles [32].
La hipótesis de que puede ser posible para reducir la replicación del adenovirus con intervención farmacológica. Específicamente, se analizaron los virus oncolíticos que contienen la ciclooxigenasa-2 (COX-2) o el factor de crecimiento endotelial promotor vascular (VEGF) que controla la expresión de
E1A
, y se evaluó el efecto de los reactivos anti-inflamatorias [salicilato de sodio, dexametasona, ácido salicílico y factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1)] en oncolisis y la replicación
in vitro
y
in vivo
eficacia. Como controles, se incluyeron un Retinoblastoma (Rb) -p16 vía selectiva basada en Δ24 tipo I virus oncolítico [33] y un tipo de adenovirus salvaje. Además, como se ha hecho evidente que un importante determinante de la eficacia de los adenovirus replicantes es la eficacia de administración de genes [34], se utilizó fibra modificada, la infectividad del virus mejorada.
Resultados
La infectividad de los recursos humanos líneas celulares de cáncer de cuello uterino
in vitro
cervical líneas celulares de cáncer C33A, SiHa, Caski y HeLa fueron infectadas con el virus de la luciferasa que expresan isogénica que tengan uno la cápside del adenovirus serotipo 5 (Ad5luc1), una cápside quimérica con el dominio de mando del serotipo 3 (Ad5 /3luc1) o la modificación RGD-4C de la cápside (Ad5lucRGD). En tres de cuatro líneas celulares, la infección con Ad5 /3luc1 resultó en 6-14 veces más altos de expresión de luciferasa en comparación con Ad5luc1 (5 000 partículas virales (VP) /célula, Fig. 1b-d). Sin embargo, con células C33A, que cuentan con alta expresión del receptor de coxsackie-adenovirus [19], [35], Ad5luc1 era más eficaz (7 veces, Fig. 1a). Ad5lucRGD no aumentó la infectividad de células de cáncer cervical
in vitro
, excepto en las células SiHa (2,5 a 5,5 veces mejora, Fig. 1b).
(a-d) las líneas celulares se infectado con Ad5luc1, Ad5 /3luc1, y Ad5lucRGD. La actividad de luciferasa se expresa como unidades relativas de luz (RLU) normalizados para la concentración de proteína total. (E-h) El efecto de los reactivos anti-inflamatorios en la eficacia de transducción de adenovirus modificado de la cápside. Se infectaron las células en presencia de sustancias. El valor sin reactivos se fijó en 1, y los valores relativos de luciferasa se muestran. Cada punto representa la media de tres experimentos ± error estándar. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,0001
frente
Ad5luc1
el efecto de los reactivos anti-inflamatorios en la eficacia de transducción de la cápside del adenovirus modificado
líneas celulares de cáncer de cuello uterino se infectaron con adenovirus modificado de la cápside en la presencia de sustancias. Como se muestra en la Fig. 1e-h, dexametasona aumentó la eficacia de la transducción con todos los virus en líneas celulares SiHa y Caski. Otras sustancias analizadas tuvieron un efecto de menor importancia.
Regulación de promotores de VEGF Cox-2 y con reactivos anti-inflamatorios
La actividad transcripcional de los promotores de la COX-2 y VEGF se evaluó en células de cáncer cervical líneas con y sin reactivos anti-inflamatorios salicilato de sodio, dexametasona, ácido salicílico y TGF-β1 (Fig. 2a-h). Ad5luc1, que contiene un promotor de CMV muy fuerte, se utilizó para la comparación, y se muestran las actividades relativas de luciferasa. En general, el promotor de VEGF indujo un mayor nivel de expresión de los transgenes de la Cox-2 (Fig. 2b, d, f, h). expresión del promotor era así de acuerdo con los datos anteriores sobre la COX-2 y la expresión de ARNm de VEGF en estas líneas celulares [19]. Aunque tanto los promotores pueden ser regulados a la baja con sustancias anti-inflamatorias, VEGF era más regularmente afectada (Fig. 2b, d).
Las monocapas se preincubaron con los reactivos, y C33A (a, b), SiHa (c, d ), Caski (e, f) y, células HeLa (g h) se infectaron con 1 000 partículas virales (VP) /célula de Ad5luc1 (con la luciferasa de control de CMV), se analizó Adcox-2Mluc o AdVEGFluc, y la expresión de luciferasa. nivel de expresión del transgen con los promotores de la COX-2 y VEGF se comparan con el promotor CMV (%). Cada punto representa la media de cuatro experimentos ± error estándar. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,0001
frente
ninguna sustancia
adenovirus oncolíticos muestran matanza eficiente de células de cáncer cervical
in vitro
Las monocapas de células de cáncer cervical se infectaron con adenovirus oncolíticos, el virus de tipo salvaje y Ad5luc1, un
E1
virus de control -eliminado (Fig. 3a-d). En todas las líneas celulares, el ensayo de muerte celular cuantitativa mostró citolisis con virus oncolíticos y virus de tipo salvaje, mientras que Ad5luc1 causó la muerte celular mínima. En la mayoría de las líneas celulares, oncolisis mejoró significativamente con la replicación de virus en comparación con Ad5luc1. Además, oncolisis causada por RGDCRADcox-2R fue significativa también en C33A y las células Caski cuando se utilizó la dosis de 10 vp /célula (Fig. 3a, c). En todas las líneas celulares, muerte celular con Ad5-Δ24RGD era comparable a adenovirus de tipo salvaje, mientras que la eficacia de RGDCRADcox-2R y Ad5 /3VEGF-E1 fue más débil.
(a-d) Las monocapas se infectaron con RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD, adenovirus de tipo salvaje y Ad5luc1 (
E1
virus de control -eliminado). La viabilidad celular se midió con el ensayo MTS. La DO
490 valores de las células no infectadas se fijaron como 100%. Los datos se expresan como media ± error estándar de experimentos por cuadruplicado. Se inyectaron células C33A (e-f) por vía subcutánea en ratones desnudos y se les permitió tumores avanzados para desarrollar. Los ratones fueron tratados ya sea con (e) tres inyecciones intratumorales de 1 × 10
9 partículas virales (VP) de Ad5luc1, virus de tipo salvaje o adenovirus oncolíticos en tres días consecutivos, o con (f) de una única inyección intravenosa de 1 × 10
11 vp. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0,0001
frente
Ad5luc1. Las barras indican el error estándar.
adenovirus oncolíticos entregados eficacia terapéutica en modelos murinos de cáncer cervical
in vivo
tumores subcutáneos C33A avanzada fueron tratados con tres inyecciones intratumorales de 1 × 10
9 vicepresidente de Ad5luc1, el virus de tipo salvaje, Ad5 /3VEGF-E1, RGDCRADcox-2R o Ad5-Δ24RGD en tres días consecutivos, o con una única inyección intravenosa de 1 x 10
11 vp de la mismos virus. El tratamiento con virus oncolíticos, proporcionó una eficacia terapéutica significativa en ambos modelos (figura 3e, f:
P Hotel & lt; 0,0001 para RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1 o Ad5-Δ24RGD
frente
Ad5luc1. ). Adenovirus de tipo salvaje no mostró un efecto significativo sobre el crecimiento tumoral (
P = 0,1471
y 0,8297
frente
Ad5luc1 para los modelos intratumoral e intravenosa, respectivamente).
Anti- reactivos inflamatorios mercancía reducida oncolisis causados por Cox-2 y VEGF promotor impulsados adenovirus oncolíticos y
El efecto de los agentes anti-inflamatorios en adenovirus oncolíticos y virus de tipo salvaje se analizó en C33A y monocapas de células SiHa adenovirus de tipo silvestre
. Ninguno de los reactivos analizados (dexametasona, ácido salicílico y el salicilato de sodio) causó la muerte celular significativa por su cuenta o en combinación con replicación deficiente
E1
-eliminado Ad5luc1 (Fig. 4a, e). La muerte celular eficacia de la replicación de virus se redujo con dexametasona (Fig. 4b, c, f-h), ácido salicílico (Fig. 4c) y salicilato de sodio (Fig. 4f, g).
(a- h) Las monocapas celulares se preincubaron con sustancias, y las células C33A (a-d) y SiHa (e-h) se infectaron con Ad5luc1, virus de tipo salvaje, Ad5 /3VEGF-E1 y RGDCRADcox-2R. Cell matar eficacia de la replicación de virus se redujo con dexametasona (b, c, f-h) y salicilato de sodio (c, f, g). Para mostrar el efecto de las sustancias
per se
en la supervivencia celular, un segundo simulacro se ha añadido en los paneles a y e. El punto de cruce del eje Y indica la viabilidad celular sin virus o sustancias, mientras que el "0" a la derecha de la misma indica la supervivencia de células sin virus pero con sustancias. El
in vivo
efecto de la dexametasona sobre la eficacia terapéutica de los adenovirus oncolíticos o de tipo salvaje. Se permitió (i) tumores de cáncer cervical C33A subcutánea para establecer y los ratones fueron tratados con una sola inyección intravenosa de 1 x 10
11 partículas virales (VP) de los virus oncolíticos o no virus. En los grupos de RGDCRADcox-2R, 3 × 10
8 vp se inyectaron por vía intratumoral en los días 1, 3 y 5. Además, los ratones recibieron dexametasona intraperitoneal o PBS. (J) el cáncer de ovario humano (Hey) los tumores se establecieron en ratones desnudos, y se trataron con inyecciones intratumorales de 3 × 10
8 vp de RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD o ningún virus en los días 1 , 3 y 5. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de PBS o dexametasona diaria. Las barras indican el error estándar. A pesar de una tendencia sugerente en algunos puntos de tiempo, la dexametasona no afectó el crecimiento de tumores significativamente en el análisis global de uno u otro modelo. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0,0001
frente
ninguna sustancia. Las barras indican el error estándar.
El
in vivo
efecto de la dexametasona sobre la eficacia terapéutica de los adenovirus oncolíticos o de tipo salvaje
C33A subcutánea tumores de cáncer cervical se les permitió desarrollan y los ratones fueron tratados con una sola inyección intravenosa de 1 × 10
11 vp de Ad5 /3VEGF-E1, Ad5-Δ24RGD o no virus. En los grupos de RGDCRADcox-2R, 3 × 10
8 vp se inyectaron por vía intratumoral en los días 1, 3 y 5. A continuación, los ratones se asignaron al azar a la dexametasona intraperitoneal o tratamiento PBS (Fig. 4i). Ad5-Δ24RGD se utilizó como un modelo de un virus oncolítico sin un promotor específico de tejido. virus de tipo salvaje no podría ser utilizado, porque no dió alguna eficacia en el modelo (Fig. 3). A pesar de algunas tendencias prometedoras aunque de menor importancia, la dexametasona no afectó significativamente el crecimiento tumoral (
P
= 0,5726 hasta 0,9909
contra virus sólo). Sin embargo, todos los adenovirus oncolíticos siguieron mostrando eficacia antitumoral como en el experimento anterior (todos los
P Hotel & lt; 0,0001
frente
maqueta)
Para ver si podíamos. desentrañar la replicación del efecto de la dexametasona atenuante en un modelo subcutáneo de crecimiento rápido, altamente agresivo, se utilizó Hey células de cáncer de ovario (Fig. 4j). El trabajo previo sugiere que los virus utilizados aquí podrían replicarse en las células Hey [36], [37]. Los xenoinjertos fueron tratados con inyecciones intratumorales de 3 × 10
8 vp de virus o no virus en días 1, 3 y 5. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de PBS o dexametasona al día, y se siguió el crecimiento del tumor. Una vez más, aunque hubo una sugerencia de la atenuación de la replicación del virus (
es decir.
Tumores más grandes), dexametasona no tuvo ningún efecto significativo sobre la eficacia terapéutica de los virus analizados (
P
= 0,8897 a 0,9441). La eficacia antitumoral de los adenovirus oncolíticos continuó siendo significativa en comparación con el tratamiento simulado (todo
P
& lt; 0,0001)
El efecto de la dexametasona sobre la replicación de Cox-2 y VEGF promotor impulsado oncolítico. adenovirus y adenovirus de tipo salvaje en células de cáncer cervical
in vitro
Se analizó el
in vitro
la producción de viriones en por RGDCRADcox-2R, Ad5 /3VEGF-E1 y salvaje -type adenovirus en las células SiHa con y sin tratamiento con dexametasona (Fig. 5a-c). En general, la dexametasona redujo la replicación de los virus analizados. La replicación de RGDCRADcox-2R se redujo 2-, 7, y 10 veces a las 24, 60 y 96 h, respectivamente (Fig 5a:
P
& lt; 0,0001 a 60 h.). Un efecto similar pero más débil se observó con Ad5 /3VEGF-E1 (Fig 5b:. 1.5 a 3.5 veces,
P
= 0,0640 a 96 h). La replicación de un virus de tipo salvaje se redujo significativamente a las 96 h (Figura 5c: 40 veces,
P Hotel & lt; 0,0001.): Perfil
(a-c) SiHa monocapas de cáncer de cuello de útero eran. infectado con virus solo (10 partícula viral (vp) /célula) o en combinación con dexametasona, y la producción de virus se analizó por ensayo de placa. A pesar de una tendencia clara en los puntos de tiempo iniciales, no hubo un efecto estadísticamente significativo de la dexametasona sobre la
in vivo
la replicación debido a la variación más grande
in vivo gratis (d-f). tumores de cáncer de ovario humano se establecieron en ratones desnudos y se trataron con una única inyección intratumoral de 3 × 10
8 vp. Los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de dexametasona o PBS diariamente. Cuatro tumores /grupo se recogieron en los días 2 y 4, y la cantidad de partículas infecciosas se analizó mediante TCID
50. ***
P Hotel & lt; 0,0001
frente
solo virus. N.A. = no analizado. Las barras indican el error estándar.
El efecto de la dexametasona sobre la replicación de la Cox-2 y VEGF promotor impulsado adenovirus oncolíticos y adenovirus de tipo salvaje en células de cáncer de
in vivo
regulación de la replicación por la dexametasona
in vivo
se analizó con los tumores de ovario Hey humanos subcutáneos de adenocarcinoma tratados con inyecciones intratumorales en el día 0. la mitad de los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de dexametasona al día. Los tumores se analizaron en los días 2 y 4. Aunque la dexametasona reduce la replicación del Ad5 /3VEGF-E1 y el virus de tipo salvaje en el punto de tiempo temprano, la diferencia no fue estadísticamente significativa (Fig. 5d-f, todos los
P
= 0,1283 a 0,6144).
Discusión
Debido a que el receptor de adenovirus primario puede ser con frecuencia ausente o expresado de forma aberrante en tumores avanzados [34], primero analiza
in vitro
la eficacia de transducción de fibra modificada, de infectividad mejorada vectores de adenovirus que expresan el transgen de la luciferasa (Fig. 1). modificación RGD-4C no parece ser muy eficaz en el aumento de la transferencia de genes, pero el virus receptor Ad3 reorientado era muy eficaz en tres de cada cuatro líneas celulares (figura 1a-d). Además, se evaluó el efecto de los reactivos anti-inflamatorios sobre la eficacia de transducción, y encontramos un cierto aumento en la expresión del transgen después del tratamiento con dexametasona en dos de las cuatro líneas celulares de cáncer de cuello uterino (Figura 1 f, g) como un factor determinante de la eficacia de los adenovirus oncolíticos es la infectividad [34], se utilizó fibra modificaciones genéticas para mejorar la eficacia de destrucción celular. Se evaluó la
in vitro
potencia citolítica de estos adenovirus oncolíticos en líneas celulares de cáncer de cuello uterino, y se encontró correlación entre la potencia oncolítico, la entrega de genes y la actividad promotora,
es decir
más fuerte es el promotor y el más alto es el infectividad, más fuerte era la potencia oncolítico (Fig. 3a-d).
Más importante, todos los adenovirus oncolíticos analizados tenían eficacia terapéutica estadísticamente significativa en ambos esquemas de tratamiento locales y sistémicos de murinos xenoinjertos de cáncer de cuello uterino (Fig. 3e, f). Alguna variación en la eficacia se observó entre
in vitro Opiniones y
in vivo
resultados con algunos de los virus. Esto puede ser debido a los descubrimientos recientes que sugieren que, si bien la administración de genes
in vitro
depende sobre todo de los receptores de adenovirus primarias, problemas de biodisponibilidad parecen dominar en relación con
in vivo
eficacia. Por ejemplo, se acepta cada vez más que mientras que la unión a la República Centroafricana es un determinante importante de la transducción de
in vitro
, otras regiones de la fibra puede ser aún más relevante
in vivo
[38]. En paralelo a los resultados anteriores con otras líneas celulares [37], [39], adenovirus tipo salvaje no era eficaz en las células C33A
in vivo
, a pesar de la actividad
in vitro
. Aunque suponemos esto se relaciona con las diferencias entre los
in vitro
y
in vivo
ambientes (estroma, vasculatura, por ejemplo, la expresión. Receptor), es necesario seguir trabajando para aclarar el tema.
Cuando se evaluó promotor impulsado expresión de los transgenes de la Cox-2 y VEGF, ambos promotores se encontraron activas en líneas celulares de cáncer de cuello uterino. En general, la actividad del promotor de VEGF fue mayor que la Cox-2 en todas las líneas celulares, y comparable a los datos anteriores [19]. Es importante destacar que estudios anteriores han informado de que las células hepáticas normales no expresan VEGF [40]. También COX-2 niveles observados en células de cáncer cervical fueron superiores a lo que se ha reportado para el hígado anteriormente [16]. Reducción significativa del promotor de la expresión de luciferasa mediada por VEGF se observó con salicilato de sodio, dexametasona y ácido salicílico (Fig. 2b, d). El salicilato de sodio también redujo Cox-2 controlado promotor la expresión del transgen (Fig. 2e).
Cuando experimentos de células matar se realizaron en presencia de agentes antiinflamatorios, dexametasona y sodio salicilato fueron eficaces en la reducción de la oncolisis (Fig. 4). Curiosamente, el efecto no se limita a los adenovirus oncolíticos, sino también virus de tipo silvestre representada citolisis más débil cuando la dexametasona estuvo presente. Por lo tanto, el efecto podría no ser completamente relacionado con el promotor que controla la replicación, pero un fenómeno más general en la replicación viral puede ser también implicado. Una de las causas de la replicación reducida podría ser baja regulación de los receptores pertinentes requeridos para la infección. Previamente, nosotros y otros hemos analizado la modulación de la expresión del receptor primario adenovirus en la superficie celular por diversas sustancias incluyendo un número de agentes quimioterapéuticos y reactivos anti-inflamatorias. No se encontraron efectos sobre el nivel del receptor, tal como se evaluó mediante análisis de citometría de flujo, después del tratamiento con dexametasona, mientras que otros detectan una ligera reducción en el nivel de los dos receptores de primaria y alfa
integrinas vβ [41], [42].
el efecto de la dexametasona sobre el receptor de serotipo 3 no se había estudiado, ni tenía las líneas celulares utilizadas aquí sido estudiados antes en relación a los otros receptores de adenovirus pertinentes. Por lo tanto, analizamos el efecto de las sustancias en el suministro de genes y se encontró que en algunos casos la expresión de luciferasa se incrementó (Fig. 1e-h). Por lo tanto, la replicación reducida se ve aquí no era probablemente debido a la regulación a la baja del receptor.
Otra posibilidad mecanicista podría implicar la inducción de la Cox-2 mediante la replicación del virus
per se
. Con respecto a herpes, citomegalovirus y otros virus de ADN, se ha demostrado que la infección por virus induce la Cox-2 [43], [44]. Además, el hallazgo de que la inhibición de la Cox-2 reduce la replicación de estos virus sugiere que la COX-2 de inducción es beneficioso para la propagación de virus. Estos virus pueden utilizar los efectos anabólicos de la COX-2 para la optimización de su eficacia de replicación. Los datos preliminares sugieren que el mismo puede ser cierto para adenovirus, lo que podría ayudar a explicar por qué el efecto oncolítico de adenovirus de tipo salvaje fue atenuada por la dexametasona [45].
A pesar de que es probable que oncolisis correlaciona con la replicación del virus, se determinó esto por separado. Como era de esperar, la replicación del virus se redujo con el tratamiento con dexametasona
in vitro
(Fig. 5a-c). Esto parece apoyar la hipótesis teórica de que oncolisis está estrechamente relacionado con la replicación del virus. A medida que los adenovirus humanos no se replican de forma productiva en los tejidos normales murinos [46], xenoinjertos humanos en ratones fueron utilizados para la replicación de atenuación
in vivo
estudios. En estos modelos, si se reduce la replicación y /o célula eficacia matando
in vivo
con dexametasona, los tumores en los ratones tratados con virus y dexametasona serían mayores que virus sólo tratada. En ambos modelos estudiados, la dexametasona no redujo significativamente la eficacia antitumoral de los adenovirus oncolíticos analizados, a pesar de una tendencia en esa dirección (Fig. 4i-j, todos los
P
≥0.1654). Por último, se analizó la cantidad de partículas infecciosas en los tumores subcutáneos con y sin tratamiento con dexametasona (Fig. 5d-f). A pesar de una tendencia prominente en los puntos de tiempo tempranos, no se observaron diferencias significativas, lo que puede deberse a la variación típica de
in vivo
experimentos.
La razón más probable de la discrepancia entre la observada
in vitro en
y
in vivo
efecto de la dexametasona sobre el potencial de los virus oncolíticos pueden estar relacionadas con la mayor complejidad del
in vivo y modelos. Estas complejidades se pudo observar en un estudio reciente en el que se observó un aumento en los niveles de VEGF en Cox-2 positivo y 2 de la Cox-células cancerosas negativos de páncreas después del tratamiento con altas concentraciones de inhibidores COX-2, lo que sugiere que la relación entre la proteína COX-2 y la inhibición de VEGF o expresión COX-2 promotor no siempre pueden estar estrechamente vinculados [47]. Contrariamente a lo esperado, tanto la COX-2 positivo y negativo
in vitro y modelos visualizan los niveles de VEGF siguientes inhibición de la COX-2 se incrementaron. Sin embargo, en el tumor positivo Cox-2
in vivo
modelo, las células no malignas expresó una marcadamente disminución del nivel de VEGF murino conduce a VEGF total reducido y la angiogénesis tumoral y el crecimiento, mientras que la COX-2 tumores negativos muestran una mayor el crecimiento del tumor. Estos resultados también sugieren que el estroma del tumor puede tener un efecto importante sobre la expresión de COX-2 y los factores relacionados.
Otro aspecto se refiere a la relación no lineal entre los niveles de E1A y la eficacia de la replicación del virus. Estudios clásicos sugieren que los niveles de E1A muy variables permiten la replicación eficaz sin correlación directa entre la expresión de E1A y la producción de viriones [48]. Por lo tanto, es muy posible, que a pesar de la expresión de E1A se vio afectada debido a la inhibición de la dexametasona de los promotores, el efecto no era lo suficientemente dramático para ser visto como una diferencia en las curvas de crecimiento del tumor. Dexametasona regula múltiples componentes de la inmunidad innata y adaptativa.