Extracto
A pesar de que el aumento del estrés oxidativo y la hipometilación del elemento-1 (LINE-1) asociado nuclear a largo intercalados con el desarrollo del cáncer de vejiga (BCA), la relación entre estas alteraciones es desconocido. Se evaluó el estrés oxidativo y la hipometilación del LINE-1 en 61 pacientes BCa y 45 individuos normales. Para medir los niveles de metilación y para diferenciar el loci LINE-1 en hypermethylated, parcialmente metilada y hypomethylated, células de sangre periférica, células exfoliadas urinarias y tejidos cancerosos se evaluaron mediante análisis de restricción combinado con bisulfito PCR. Se determinaron el estado antioxidante urinaria total (TAS) y el contenido de carbonilo de proteínas plasmáticas. Las LINE-1 los niveles de metilación y los patrones, especialmente loci hypomethylated, en las células de la sangre y la orina de los pacientes BCa eran diferentes de los niveles y patrones en los controles sanos. La TAS urinaria se disminuyó, mientras que el contenido de carbonilo de proteínas de plasma se incrementó en los pacientes CaV relativos a los controles. Una correlación positiva entre la metilación de LINE-1 en el ADN derivado de la sangre y TAS urinaria se encuentra tanto en los grupos de CaV y de control. El urinaria hypomethylated LINE-1 loci y el contenido de proteínas carbonilo de plasma proporcionan el mejor potencial de diagnóstico para la predicción BCa. Sobre la base de muestras post-diagnóstico, la prueba de combinación mejoró el poder de diagnóstico para una sensibilidad del 96% y una especificidad del 96%. En conclusión, la disminución de LINE-1 metilación se asocia con un aumento del estrés oxidativo tanto en sujetos sanos y BCa en los distintos tipos de tejido, lo que implica una asociación dosis-respuesta. Los aumentos en los niveles de hipometilación LINE-1 y el número de loci hypomethylated tanto en las células de sangre y de orina derivados y aumento en el estrés oxidativo se encontraron en los pacientes CaV. La prueba de la combinación urinaria hypomethylated LINE-1 loci y el contenido de proteínas carbonilo plasma puede ser útil para el cribado BCa y el seguimiento del tratamiento
Visto:. Patchsung M, Boonla C, Amnattrakul P, Dissayabutra T, A Mutirangura , Tosukhowong P (2012) largos períodos de actividad nuclear Elemento-1 hipometilación y el estrés oxidativo: Correlación y diagnóstico del cáncer de vejiga potencial. PLoS ONE 7 (5): e37009. doi: 10.1371 /journal.pone.0037009
Editor: Kin Lau Mang, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 13 de diciembre de 2011; Aceptado: April 11, 2012; Publicado: 15 de mayo de 2012
Derechos de Autor © 2012 Patchsung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por Ratchadapisake Fondo Sompote, Universidad de Chulalongkorn (PT), por la Bioquímica y Biología Molecular de la Unidad de Investigación de Enfermedades metabólicas y por el Fomento de la Investigación de Educación Superior y el Proyecto Nacional de Investigación de la Universidad de Tailandia, Oficina de la Comisión de Educación Superior y el Ratchadaphiseksomphot Dotación Fondo (HR 1162A). AM se apoya en silla de la investigación de Grant 2011, la Agencia de Tecnología para el Desarrollo (NSTDA) Nacional de Ciencia y Tailandia, y diversión el 4 de caridad Cancer Care el Four Seasons Hotel de Bangkok ejecutar en coordinación con la Cruz Roja de Tailandia y el Centro de Excelencia en Genética Molecular del Cáncer y Enfermedades humanas, Universidad de Chulalongkorn. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Carcinogénesis de la vejiga urinaria es compleja debido a que ambas mutaciones genéticas y alteraciones epigenéticas juegan un papel importante. Además, la inflamación y el estrés oxidativo contribuye críticamente para el desarrollo de cáncer de vejiga (BCA) [1] - [3]. Varias líneas de evidencia informan de un aumento del estrés oxidativo en pacientes con BCa [3] - [6]. El estrés oxidativo es una condición de la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) y /o una reducción de los antioxidantes. ROS daña directamente el ADN celular y promueve el desarrollo de tumores no sólo a través de mutaciones genéticas, sino también a través de alteraciones epigenéticas [7]. alteraciones epigenéticas comunes en cánceres humanos incluyen hipometilación global y (promotor isla CpG específica de sitio) regional hipermetilación de los genes supresores de tumores [8], [9]. La hipometilación del genoma del cáncer se produce en las secuencias repetitivas y elementos retrotransposable [10], lo que acelera la inestabilidad genómica [10] - [13] y altera la expresión del gen [14]. La mejor retrotransposon caracterizado y más abundante en el genoma de los mamíferos es el largo intercaladas elemento-1 nuclear (LINE-1 o L1), y se sabe que LINE-1 la hipometilación se asocia con muchos tumores malignos [15], [16].
en el cáncer urotelial, la hipometilación del LINE-1 se demostró por primera vez en líneas de células uroteliales y tejidos tumorales por Schulz y colegas sobre la base de experimentos utilizando enzimas de restricción sensibles a la metilación (
Hpa II
/
Msp
I) y transferencia Southern [17], [18]. La hipometilación LINE-1 correspondió bien con un aumento en el line-1 transcripciones y una disminución en el gen que contiene LINE-1 mRNA [14]. Más tarde, nuestro grupo empleó un análisis de restricción combinado con bisulfito (COBRA) PCR para demostrar LINE-1 hipometilación en diversos tejidos carcinomas incluyendo el cáncer de vejiga [15]. Choi et al. usada con bisulfito PCR pirosecuenciación y mostró una hipometilación evidente de LINE-1 en los tejidos tumorales de vejiga con respecto a los tejidos normales adyacentes [19]. La reducción de los niveles de 5-metilcitosina en el ADN de leucocitos se muestra en pacientes españoles con cáncer de vejiga con respecto a los controles de la misma [20]. Recientemente, la hipometilación del LINE-1 en células de sangre periférica se asoció con un mayor riesgo de cáncer de vejiga, especialmente en las mujeres [21]. Entre los chinos que no fuman, resultado similar que LINE-1 en linfocitos hipometilación se asoció con un mayor riesgo de cáncer de vejiga se demostró [22]. Anteriormente, la metilación de LINE-1 en células exfoliadas urinarios y su implicación en el cáncer de vejiga no se ha investigado. A pesar de LINE-1 hipometilación y el aumento de estrés oxidativo son bien reconocidos en pacientes bca, la asociación entre estos dos fenómenos no ha sido explorado.
Hasta la fecha, las técnicas más utilizadas para medir LINE-1 nivel de metilación son pirosecuenciación y COBRA PCR. Estos dos métodos tienen una eficacia similar tenido en la detección de los niveles de metilación y han márgenes de error [23] limitado. La pirosecuenciación de LINE-1 detecta un poco más dinucleótidos CpG, por lo general tres CpG [24], que detecta la PCR COBRA (generalmente dos GPC). Sin embargo, el LINE-1 metilación de cada locus no es homogénea [23], [25], lo que puede influir en la expresión y la estabilidad del genoma en cis [16]. En consecuencia, los niveles de metilación LINE-1 no representan con precisión las funciones biológicas de la modificación epigenómico [16]. Para mejorar LINE-1 Evaluación metilación, además del nivel de metilación global, se utilizó COBRA PCR de LINE-1 para clasificar el genoma de toda LINE-1 loci en cuatro grupos,
mC
mC (hypermethylated),
uC
uC (hypomethylated),
mC
uC y
uC
mC (parcial metilado), y calcular los porcentajes de cada grupo (Fig. 1) [26]. Es de destacar que ciertos LINE-1 ensayos de metilación tienen una base de control de metilación positivo que se puede utilizar para determinar la eficacia del tratamiento con bisulfito
A:. La detección 5 'UTR de la secuencia LINE-1 contiene dos CpG dinucleótido loci, y el tamaño de amplificación por PCR de LINE-1 es de 160 pb. B: Hay 4 posibles patrones de metilación de la secuencia LINE-1 (una célula contiene dos alelos). Las estrellas representan sólidos citosinas metiladas y las estrellas representan huecos citosinas no metiladas. C: COBRA LINE-1 separa la región de detección en cuatro productos:
mC
CM,
UC
UC,
mC
UC y
UC
CM. D: Después de que el tratamiento con bisulfito, los residuos de citosina unmethylatated se convierten en uracilo, pero los residuos de citosina metilados son inalterada. Esto conduce a la retención o la pérdida de CpG que contiene sitios de enzimas de restricción, respectivamente. E: Los productos de PCR se digieren con Taq I (secuencia de reconocimiento: TCGA) y TasI (secuencia de reconocimiento: AATT) enzimas de restricción. Un compendio de TaqI positivo produce dos fragmentos de ADN de 80 pb, mientras que un compendio TasI positivo presenta un 62- y un fragmento de 98 pb. F: gel imagen Representante para COBRA LINE-1 ensayo. Los carriles 1-2: ADNs de pacientes bca, carriles 3-5: los ADN de los controles sanos, Carril 6: ADN a partir de células HeLa como control positivo y la muestra de normalización, Carril 7: control negativo (N), Carril 8: marcadores de 25 pb.
Para evaluar la asociación entre el estrés oxidativo y LINE-1 hipometilación, determinamos los niveles de metilación de LINE-1 en las células de la sangre y de orina obtenidas de los pacientes BCa y de los individuos sanos. El estrés oxidativo, lo indica el estado antioxidante urinaria total (TAS) y el contenido de carbonilo de proteínas plasmáticas, se comparó entre los dos grupos. Se evaluó la asociación de los niveles LINE-1 metilación con el estado de estrés oxidativo, y se evaluó la utilidad de la detección LINE-1 en las células hipometilación urinarios exfoliada y el estrés oxidativo en general como marcadores para el diagnóstico BCa.
materiales y Métodos
los participantes
Sesenta y un pacientes con BCa que fueron ingresados en el hospital Memorial rey Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia entre 2009 y 2010 fueron reclutados para el estudio. Todos los pacientes tenían una prueba histológica de un carcinoma de células transicionales superficiales. Cualquier paciente BCa que presentaban un fenotipo invasivo muscular fueron excluidos de este estudio. individuos sanos por edad y sexo (n = 45) se utilizaron como controles. Los controles fueron seleccionados de entre los miembros de la comunidad de ancianos sanos en Lumpini Park, Bangkok, de dónde venían todos los días para hacer ejercicio. La condición saludable fue confirmado por entrevista directa y su chequeo médico anual para asegurar que no había antecedentes de trastornos urinarios y los tumores malignos. Todos los sujetos participaron voluntariamente en el estudio. El protocolo de estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chulalongkorn, Bangkok, Tailandia. consentimientos informados escritos se obtuvieron de todos los participantes.
recogida y extracción de muestras de ADN
La sangre heparinizada y orina a la mitad punto de la mañana (08 a.m.-12:00p.m.) se obtuvieron de todos los participantes . Las muestras de sangre se centrifugaron para recoger el plasma y la capa leucocitaria. Las muestras de plasma se mantuvieron a -80 ° C hasta el ensayo. Las muestras de la capa leucocitaria se sometieron inmediatamente a la extracción de ADN. Para aislar las células urinarias exfoliada, se centrifugó 50 ml de las muestras de orina a 4.000 rpm durante 20 min a 4 ° C. Se recogió el sedimento celular y se almacena en el ARN estabilizador (QIAGEN, Alemania) a -80 ° C hasta su análisis. De los 61 pacientes bca, 14 tenían tejidos cancerosos disponibles, que se han obtenido durante la operación de la resección transuretral, almacenados inmediatamente en estabilizador de ARN y se mantuvo a -80 ° C para la medición LINE-1. Debido a la baja cantidad de células nucleadas en la orina, especialmente en las orinas sanas, los ADN de las células exfoliadas urinarios se extrajeron con éxito de 30 pacientes BCa y 14 controles sanos. El ADN se extrajo a partir de capas de sangre periférica anteado, células exfoliadas urinarias y tejidos cancerosos utilizando el Kit de alta Pure PCR Template Preparation (Roche Diagnostics, Indianápolis, USA). La recogida de muestras incompletas se consideró como una debilidad del estudio. En el grupo BCA, la sangre, las células urinarias exfoliada y tejidos cancerosos que se contabilizaron 61 (100%), 30 (49,18%) y 14 (22,95%), respectivamente. Catorce pacientes BCA (22,95%) tenían todo tipo de muestras para el análisis. En el grupo de control sano, se analizaron 45 (100%) de la sangre y 14 (31,11%) de las células urinarias exfoliada muestras. Catorce sujetos control (31,11%) tenían ambas muestras para análisis. El poder para detectar la correlación observada para un n = 14 se calculó utilizando el software G * Potencia 3.1.3 [27], y la salida está representada la potencia de 0,66 (entradas: dos colas, el tamaño del efecto = 0.56, = 0,05 , el tamaño total de la muestra = 14).
LINE-1 metilación mediante PCR COBRA
En resumen, ADN genómico (250 ng) derivados de la sangre, orina y muestras de tejidos cancerosos fueron tratados con bisulfito de sodio como se describe anteriormente [15]. El ADN tratado con bisulfito se sometió a 35 ciclos de PCR con '(5'-RTAAAACCCTCCRAACCAAAT ATAAA-3 y LINE-1-R) cebadores LINE-1-F (5'-AAG ciclo combinado GGGTTAGGGAGTTTTT-3) "con una temperatura de hibridación de 50 ° C para generar 160 pb amplicones de PCR. Los amplicones fueron digeridos con más
Taq
I (2 U) (extremo cohesivo) y
TAS I (2 U) (extremo pegajoso) en tampón NEB3 (MBI Fermentas, Glen Burnie, MD ) a 65 ° C durante la noche. Los productos digeridos fueron entonces a electroforesis en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 8% y posteriormente se tiñeron con SYBR verde. El experimento se realizó por duplicado.
Las intensidades de las COBRA LINE-1 fragmentos en el gel de poliacrilamida se cuantificaron usando un fósforo y se ImageQuant software (Molecular Dynamics, GE Healthcare, Slough, Reino Unido). Como se detecta por COBRA, estado de metilación de los dinucleótidos CpG de 2 LINE-1 loci se clasificó en cuatro grupos de la siguiente manera: (1) LINE-1 loci que contienen CpG no metilados 2 (
UC
UC); (2) LINE-1 loci que contienen 2 CpG metilados (
mC
MC); (3) LINE-1 loci que contiene CpG metilado 5 'y 3' no metilados (
mC
UC); y (4) loci LINE-1 que contienen CpG no metilados y 5'-3'-metilados (
UC
MC). Los detalles para la cuantificación de la intensidad de banda se describen en detalle en otra parte [28]. En resumen, cuatro bandas que diferían en sus estados de metilación, incluyendo 98 pb (
UC
UC), 160 (
mC
UC), 80 (
MC) y 62 (
uC) pb, se cuantificaron (Fig. 1). La intensidad de cada banda fue dividida por su longitud se combina como sigue: 160 pb /160 (A), 98 pb /94 (B), 80 pb /79 (C) y 62 pb /62 (D). El nivel de metilación LINE-1 (global o total) se calculó como el porcentaje de las bandas metilados (
CM) Intensidad dividido por la suma de la
MC y bandas no metilados (
UC) intensidades, (C + A) /(C + A + A + B + D) x 100. El porcentaje de
UC
UC (loci hypomethylated) se calculó a partir de la ecuación sigue: B /(((C-D + B) /2) + A + D) x 100. La
mC
UC (loci metilado parcial) fue calculada a partir de la ecuación: A /(((C-D + B) /2) + A + D) x 100. La
mC
mC (loci hypermethylated) fue calculada a partir de la ecuación: ((C-D + B) /2) /(((C-D + B) /2) + D + A) x 100 . El CV de los niveles de metilación LINE-1 en la sangre, las células y los tejidos urinarios exfoliada ADN cancerosas fueron 7,31% (rango: 2,33 a 12,91%), 7,64% (rango: 2,50 a 13,17%) y 8,00% (rango: 3,56 a 10,54 %), respectivamente. Se utilizó el ADN de células HeLa como control para normalizar la variación metilación inter-ensayo para todos los experimentos (Fig. 1F). El porcentaje de LINE-1 metilación detectado en HeLa ADN era 28,59%, y se utilizó este valor para la normalización entre las carreras. La media de LINE-1 metilación del ADN en células HeLa fue de 27,74 ± 2,33%, y el% CV inter-ensayo fue 8,41.
estado antioxidante total (TAS)
La 2, 2-difenil ensayo de reducción de -1-picrilo-hidracilo (DPPH) se realizó para determinar el TAS en muestras de orina. Brevemente, se añadió una muestra de orina (20 l) a de 400 l de fosfato mM solución salina tamponada con 10 (PBS, pH 7,4) y 400 l de recién preparada DPPH 0,1 mM en metanol. Los tubos de reacción se incubaron a temperatura ambiente durante 20 min en la oscuridad. Se midió la densidad óptica (DO) a 520 nm. La capacidad antioxidante de la muestra se calculó basándose en el% de inhibición de radicales DPPH utilizando la siguiente ecuación:% de inhibición = (OD
blanco-DO
muestra /DO
en blanco) × 100. se utilizó ácido L-ascórbico (vitamina C) a concentraciones de 0,25, 0,5 y 1 mM para generar una curva estándar (% de inhibición frente a la concentración). El valor TAS de la muestra de orina se expresó como la vitamina C equivalente capacidad antioxidante (VCEAC mM). Todos los experimentos se realizaron por duplicado. El CV para la determinación TAS urinaria fue 7,81% (rango: 1,02 a 14,59%).
Proteína carbonilo determinación
El contenido de proteínas carbonilo se usa como un indicador de la oxidación de proteínas por ROS en el plasma. Se diluyó una muestra de plasma (1:20) con PBS (10 mM, pH 7,4) y después se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 min. Se añadió el sobrenadante de plasma (250 l) a 1 ml de 10 mM de 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) en HCl 2N. Para un control de blanco de reactivo, se añadió 1 ml de HCl 2 N a 250 l del sobrenadante de plasma. Las mezclas se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 45 min y se sometieron a vórtice a intervalos de 10 min. Después, se añadieron y se incubaron durante 10 min en hielo 1,2 ml de ácido tricloroacético frío al 20%; esto fue seguido por centrifugación a 3000 rpm durante 15 min para recoger los gránulos de proteína. Los pellets se lavaron tres veces con 2,5 ml de etanol /acetato de etilo (01:01, v /v) cada uno para eliminar no reaccionado DNPH. Los sedimentos lavados que contienen 2,4-dinitrofenilhidrazona se resuspendieron en guanidina 6 M clorhidrato /fosfato monobásico 0,5 M de potasio, pH 2,5, a 37 ° C durante 15 min con agitación. La absorbancia a 375 nm se midió utilizando el correspondiente blanco de reactivo para una puesta a cero. El coeficiente de extinción para el 2,4-dinitrofenilhidrazona a 375 nm es 22.000 M
-1 cm
-1 y la concentración de proteínas carbonilo (nmol /ml) se calculó como la absorbancia x 45,45 [29]. El contenido de carbonilo de proteínas en el plasma se expresó por mg de proteínas totales (medidos por el método de fijación de colorante). El CV para la determinación del contenido de proteínas carbonilo plasma fue de 8,43% (rango: 2,72 a 13,80%).
El análisis estadístico
Los datos con distribución normal se presentan como la media ± desviación estándar, y los datos con distribución asimétrica se presentaron como (rango intercuartil, IQR) mediano. Para las comparaciones entre dos grupos independientes, la muestra independiente
t-test
se utilizó para los datos distribuidos normalmente, y se utilizó la prueba de Mann-Whitney para datos asimétricos. Se utilizó la prueba de correlación de Pearson para evaluar la correlación entre las variables continuas. Un receptor de funcionamiento característico análisis (ROC) se realizó para probar la capacidad de la LINE-1 prueba de metilación COBRA para diferenciar sujetos CaV de sujetos sanos. Un área bajo la curva ROC (AUC) de 1,0 indica una precisión perfecta, mientras que una AUC de 0,5 indica que la prueba carece de poder discriminatorio. Se seleccionó un valor de corte para el cálculo de los valores de diagnóstico. SPSS versión 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL) y STATA versión 8.0 (StataCorp, College Station, Texas) se utilizaron para todos los cálculos. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Los pacientes BCA (n = 61) tenían entre 42 y 89 años de edad (65.11 ± 12,16 años) y consistió en 52 (85.25. %) hombres y 9 (14.75%) mujeres. En el grupo control, hubo 45 sujetos sanos de entre 46 y 81 años de edad (61,00 ± 13,25 años); este grupo contaba con 37 (82,22%) hombres y 8 (17,78%) mujeres. La media de índice de masa corporal (IMC) de los grupos de pacientes y de control fueron 22,24 ± 3,71 y 23,15 ± 2,45 (kg /m
2), respectivamente. La distribución por sexo, la edad y el IMC entre los dos grupos no fueron significativamente diferentes.
El nivel de metilación de LINE-1 se midió en el ADN derivado de sangre periférica, células exfoliadas urinarias y tejidos cancerosos. El porcentaje de LINE-1 metilación en las células de sangre periférica de los pacientes CaV fue significativamente menor que la de los controles sanos (P = 0,001) (Fig. 2A). Del mismo modo, la línea-1 los niveles de metilación en las células exfoliadas urinario de los pacientes BCa fueron significativamente inferiores a los de los controles sanos (P = 0,044) (Fig. 2B). Las LINE-1 en los niveles de metilación en los tejidos cancerosos BCa fueron significativamente inferiores a los de las células urinarias exfoliada de los sujetos BCA (P = 0,038) y sanos (P = 0,001) (Fig. 2B). El porcentaje de
uC
uC loci en las células de sangre periférica y células urinario exfoliada de los pacientes CaV fue significativamente mayor que los controles (P = 0,013 y & lt; 0,001, respectivamente) (Figura 2C y 2D.). El número de
mC
uC loci de las células urinarias exfoliada de los pacientes CaV fue significativamente menor que la de los controles (P = 0,006), pero los niveles de
mC
loci uC de la las células de sangre periférica de los grupos BCa y sanos no fueron diferentes (P = 0,133) (Figura S1). Estos datos confirman la presencia de LINE-1 hipometilación en el cáncer de vejiga y mostraron resultados similares a los reportados previamente para el cáncer oral [26] demostró que la especificidad de
UC
loci de la UC con el ADN del cáncer.
a: el porcentaje de LINE-1 los niveles de metilación en el ADN de la sangre periférica de pacientes BCA (n = 61) fue significativamente menor que la de los controles sanos (n = 45). B: Los LINE-1 los niveles de metilación en el ADN derivadas de las células urinarias exfoliada de pacientes BCA (n = 30) se redujo significativamente con respecto a los de los controles sanos (n = 14). Las LINE-1 en los niveles de metilación en los tejidos cancerosos (n = 14) fueron significativamente más bajos que los niveles de metilación LINE-1 en las células exfoliadas urinarios tanto de BCa y sujetos sanos. C: La
uC
niveles uC en el ADN de la sangre periférica de pacientes CaV fueron significativamente más altos que los de los controles sanos. D: La
UC
niveles de PD en las células exfoliadas urinarios de pacientes BCa se aumentó significativamente en comparación con los de los controles sanos. El tejido canceroso
UC
niveles de la UC no fueron significativamente diferentes de la
UC
niveles de comunicaciones unificadas de las células BCa urinaria exfoliadas (P = 0,721), pero fueron significativamente más altos que los de la orina exfoliada las células de los controles sanos.
las determinaciones del contenido de carbonilo TAS y la proteína plasmática urinaria se realizaron en ambos grupos sanos y BCa. Se observó una reducción significativa en el nivel TAS urinaria en los pacientes de BCA en relación con los controles sanos (P & lt; 0,001) (Fig 3A.). El contenido de carbonilo de proteínas plasmáticas en los pacientes CaV fue significativamente mayor que en los controles sanos (P & lt; 0,001) (Fig 3B.). Nuestros resultados indican un incremento en el estrés oxidativo en los pacientes CaV
A:. El nivel de TAS urinario en los pacientes CaV fue significativamente menor que en los controles sanos. B: El nivel del contenido de carbonilo de proteínas plasmáticas en los pacientes BCa fue significativamente mayor que la de los controles sanos
En los pacientes bca, hemos encontrado una correlación fuerte y positiva y lineal entre el urinaria. TAS y LINE-1 metilación en las células sanguíneas circulantes (coeficiente de regresión = 8,017) (r = 0,618, P & lt; 0,001) (Fig. 4A). Por otra parte, se observó una correlación positiva significativa entre los tejidos LINE-1 los niveles de metilación TAS y cancerosas urinario (coeficiente de regresión = 5.519) (r = 0,567, p = 0,034) (Fig. 4B). Curiosamente, también encontramos una correlación positiva entre la TAS urinaria y el nivel de LINE-1 metilación en las células de sangre periférica de los individuos sanos (coeficiente de regresión = 8,937) (r = 0,469, P = 0,001) (Fig. 4C). Las correlaciones entre TAS urinaria y los otros patrones de LINE-1 metilación (
mC
CM,
UC
UC,
UC
mC y
mC
uC ) fueron evaluados (Figura S2). Las correlaciones inversas significativas entre TAS urinaria y el
UC
niveles de CU en células BCa de sangre periférica (r = -0,440, p = 0,001), los tejidos cancerosos BCA (r = -0,440, p = 0,001) y la sangre periférica las células de los controles sanos fueron observados (r = -0,315, p = 0,035)
R: El TAS. urinaria se correlacionó linealmente con los niveles de metilación LINE-1 en las células de sangre periférica de los pacientes BCa. B: El TAS urinaria se correlacionó linealmente con los niveles de metilación LINE-1 en el tejido canceroso obtuvo de los pacientes CaV. C: En el grupo sano, el TAS urinaria fue también linealmente correlacionada con los niveles de metilación LINE-1 en las células de sangre periférica. b: coeficiente de regresión, r: coeficiente de correlación de Pearson. Los valores de p se muestran corresponden a la prueba de correlación de Pearson.
El uso de una vía ANOVA, diferencias significativas de LINE-1 en los niveles de metilación en la sangre, la orina y los ADN de tejidos cancerosos no fueron observados en los pacientes con BCa diferente tipo de consumo (los no fumadores, los fumadores actuales y salió de los fumadores) (p = 0,477, 0,711 y 0,964, respectivamente). Del mismo modo, los niveles de contenido de carbonilo TAS y la proteína plasmática urinaria entre los diferentes estados de fumar no fueron significativamente diferentes (P = 0,053 y 0,093, respectivamente). TAS urinario (P = 0,055 para la salud, P = 0.879 para la BCA) y el contenido de proteínas carbonilo de plasma (P = 0,634 para la salud, P = 0,072 para la BCA) no fueron significativamente diferentes entre hombres y mujeres, tanto en los grupos sanos y BCa. Sin embargo, la correlación positiva entre el TAS urinaria y la edad en el grupo sano (r = 0,374, p = 0,011) y la correlación negativa entre el contenido de carbonilo de proteínas plasmáticas y el IMC en el grupo BCA (r = -0,261, p = 0,044) fueron revelados.
se realizó un análisis ROC para evaluar qué tan bien la determinación de la metilación LINE-1 puede discriminar entre los pacientes BCa e individuos sanos. Entre los diversos patrones de LINE-1 metilación, la
UC
nivel de la UC en el urinaria células exfoliadas tuvieron el mayor valor diagnóstico de la más alta AUC en 0,848 (IC del 95%: 0,719 a 0,977) (tabla 1 y figura . 5A). En un 38,43% corte, la sensibilidad, especificidad y exactitud de la orina
UC
determinación de la UC fueron 80,00%, 85,00% y 81,82%, respectivamente. Los valores de AUC de la metilación% tanto en la sangre (0,684) y la orina (0,691) las células fueron inferiores a la de la orina
uC
uC (Figura S3). Por lo tanto, la determinación de
UC
UC en las células urinarias exfoliada proporcionados el potencial más alto respecto de diagnóstico para las otras formas de metilación
A:. El%
UC
UC en el urinaria células exfoliada. B: El TAS urinaria. C: El contenido de carbonilo de proteínas plasmáticas. La determinación de
UC
UC en las células exfoliadas urinario tuvo el mayor AUC, lo que sugiere el potencial diagnóstico más alto.
Las curvas ROC de la proteína urinaria y plasma TAS contenido de carbonilo también se generaron. La TAS urinaria tenía una AUC de 0,800 (IC del 95%: 0,711 a 0,888) y tenía sensibilidad, especificidad y exactitud de 88,52%, 60,00% y 76,42%, respectivamente, en un punto de corte de 1,32 VCEAC mM (Tabla 1 y Fig. 5B). Un valor de AUC para el contenido de carbonilo de proteínas plasmáticas (IC del 95%: 0,733 hasta 0,905) 0,819, y su sensibilidad, especificidad y exactitud, a un punto de corte de 0,44 nmol /mg de proteína, eran 81,97%, 73,33% y 78,30%, respectivamente (Tabla 1 y Fig. 5C).
además, evaluó si la combinación de
uC
uC en las células urinarias exfoliada y el contenido de proteína del plasma carbonilo mejoraría el potencial de diagnóstico para BCa. Los criterios de ensayo revelaron que dos resultados positivos mostraron una especificidad mayor (96,00% con una sensibilidad del 65,58%) y una sensibilidad más alta (96,39% con una especificidad del 62,33%) cuando al menos un marcador fue positivo (Fig. 6).
se logró un aumento de la sensibilidad (96,39%), cuando sea el%
uC
uC en células exfoliadas urinario o el contenido de carbonilo de proteínas plasmáticas fue positiva. Además, se logró una mayor especificidad (96,00%) de la prueba cuando al menos uno de los dos marcadores fue positiva.
Discusión
La pérdida de metilación del ADN en el LINE-1 elementos se sugiere a ser un evento cardinal en el desarrollo del cáncer, ya que promueve la inestabilidad genómica y altera la expresión de genes [12] - [16]. El mecanismo que provoca la pérdida de la metilación del ADN es desconocida. La evaluación de la correlación de los niveles LINE-1 metilación entre varios loci sugirió que el mecanismo de hipometilación LINE-1 es generalizada [23]. El momento en que la metilación del ADN y el cáncer de vejiga aún no está claro. Por el contrario, se ha demostrado que es un biomarcador en la muestra post-diagnóstico y análisis, sin embargo, esta relación no se ha demostrado en el uso de muestras de pre-diagnóstico, y aún no está claro si la metilación más baja observada fue causado por el proceso carcinogénico en sí [30]. En el presente estudio, hemos demostrado aquí por primera vez una correlación positiva significativa entre LINE-1 la hipometilación y el estrés oxidativo no sólo en pacientes con cáncer, sino también en individuos sanos. Por lo tanto, el estrés oxidativo puede ser una de las causas o consecuencias de LINE-1 hipometilación.
En la actualidad, hasta donde sabemos, no existe un mecanismo bioquímico que implica cómo LINE-1 hipometilación puede producir ROS. Sin embargo, el mecanismo de estrés oxidativo cómo reduce la metilación del ADN se ha propuesto [31], y la tensión inducida por el cambio de metilación del ADN oxidativo parece ser temporal [32], [33]. lesiones del ADN oxidadas que son inducidos por ROS, tales como 8-OHdG (en dinucleótidos CpG), pueden inhibir fuertemente la metilación por una metiltransferasa de ADN en los residuos C adyacentes [34]. Además, un sin fijar 8-OHdG puede introducir un transversión G-T que resulta en la pérdida de dinucleótidos CpG [35]. Además, en una condición de estrés oxidativo, se aumenta la resíntesis de glutatión (GSH) en respuesta al agotamiento de GSH a través de la ciclo de la metionina en la vía de metabolismo de un carbono. Esta vía requiere
S
-adenosylmethionine (SAM) para la síntesis de la homocisteína para ser utilizado para la síntesis de GSH, lo que lleva a una menor disponibilidad de SAM para la metilación del ADN [36]. Los agentes y las condiciones que inducen el agotamiento de GSH se han demostrado para deteriorar la metilación del ADN [37], [38]. Por lo tanto, se cree que el estrés oxidativo para alterar la metilación de ADN, lo que conduce a cambios en la expresión de genes que podrían contribuir al desarrollo de tumores [7]. Además de la disminución de la disponibilidad de SAM, el agotamiento de la piscina de metilo en modelos con deficiencia de folato se ha demostrado que causa la hipometilación del ADN [39], [40].
Los niveles de metilación LINE-1 se han estudiado en varias fuentes de ADN para mejorar el diagnóstico del cáncer. Por desgracia, hay tejidos específicos de los niveles de metilación y que éstos varían dependiendo de la metilación biomarcador utilizado para medir la metilación [15].