Extracto
Objetivo
aldehído deshidrogenasa (ALDH) que expresan han sido caracterizada como poseedora de propiedades de células madre. Se evaluaron propiedades de células madre del cáncer de ovario ALDH + y su papel en la resistencia de platino.
Métodos
líneas celulares de cáncer de ovario isogénicos de sensibilidad al platino (A2780) y resistente al platino (A2780 /CP70) como así como se analizaron ascitis de pacientes con cáncer de ovario para ALDH + por citometría de flujo para determinar su asociación con resistencia de platino, la recidiva y la supervivencia. Un modelo desmontables shRNA estable para ALDH1A1 se utilizó para determinar su efecto sobre las propiedades madre del cáncer de células similares, punto de control, y los mediadores de reparación del ADN.
Resultados
Estado de la ALDH directamente correlacionada con la resistencia de platino en muestras de cáncer de ovario primario obtenido a partir de la ascitis. Los pacientes con ALDH
ALTA muestran significativamente menor supervivencia libre de progresión de los pacientes con ALDH
células BAJO (9 frente a 3 meses, respectivamente, P & lt; 0,01). ALDH1A1-desmontables atenuó significativamente el potencial clonogénico, PARP-1 los niveles de proteína, y revirtió la resistencia inherente de platino. ALDH1A1-caída resultó en disminución dramática de KLF4 y los niveles de proteína p21 lo que conduce a la acumulación de S y G2 fase de las células. Los aumentos en las células S y G2 demostraron un aumento de la expresión de replicación de estrés asociados proteínas de reparación del ADN La anemia de Fanconi (FANCD2, FANCJ) y el puesto de control de la replicación (pS317 Chk1) se vieron afectados. ALDH1A1-desmontables induce daño en el ADN, lo demuestra la inducción robusta de γ-H2AX y BAX mediada por apoptosis, con aumentos significativos en la expresión de BRCA1, que sugiere la regulación ALDH1A1 dependiente del punto de control y redes de reparación del ADN en las células madre, como el cáncer de ovario.
Conclusión
Estos datos sugieren que las células de cáncer de ovario que expresan ALDH1A1 puede mantener la resistencia de platino por la alteración en la regulación del punto de control y señalización de la red de reparación del ADN
Visto:. Meng e, A Mitra , Tripathi K, Finan MA, Scalici J, McClellan S, et al. (2014) ALDH1A1 Mantiene cáncer de ovario propiedades de células madre-Like de alteración en la regulación del punto de control y reparar el ADN de red de señalización. PLoS ONE 9 (9): e107142. doi: 10.1371 /journal.pone.0107142
Editor: Robertus AM. De Bruin, University College de Londres, Reino Unido
Recibido: 13 de mayo de 2014; Aceptado: August 7, 2014; Publicado: 12 Septiembre, 2014
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Disponibilidad de datos:. Los autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del sus Archivos de soporte de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación del Cáncer Ginecológico Sherri es de un susurro a un rugido, Premio de Investigación del Cáncer Fundación de la motocicleta de ovario de la mujer y el Eleanor Ruth Frenkel Fondo para la Investigación del cáncer de Ovario (RPR); NIH subvención R01GM098956, y la subvención Abraham Mitchell Dotación (K.P.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es el más mortal de todos los cánceres ginecológicos, que afecta a más de 22.000 vidas de mujeres cada año en los Estados Unidos solamente. Aunque la mayoría de los pacientes con cáncer de ovario lograr una respuesta clínica inicial completa a la cirugía citorreductora seguida de quimioterapia de combinación, la mayoría experimentará una recurrencia y por desgracia sucumbir a enfermedad progresiva [1]. Vital para el pronóstico de los pacientes con cáncer de ovario es una sensibilidad distinta de la enfermedad a los agentes de platino. Aunque un continuo, los pacientes se estratifican por respuesta original de su enfermedad a la quimioterapia de platino como "sensible al platino" o "resistente al platino" definido por la longitud del intervalo libre de recaída. Este espectro es altamente predictivo de criterios de valoración clínicos de cuando un cáncer reaparece, el éxito de la cirugía y /o quimioterapia en la recidiva y la supervivencia global del paciente.
Teniendo en cuenta la heterogeneidad de cáncer, no todas las células dentro de un tumor maligno haría se espera que sea resistente a la quimioterapia. La teoría de las células madre del cáncer (CSC) propone que estas células resistentes abarcan sólo una minoría de células dentro de un cáncer, sin embargo, son los únicos responsables de la recurrencia a largo plazo [2]. De este modo, independientemente de las tasas de respuesta inicial, si la quimioterapia no erradicar estas células madre cancerosas resistentes, entonces el cáncer se regenerará y se producirá una recurrencia o progresión de la enfermedad. La identificación de estas células resistentes y la determinación de sus vías moleculares innatas son de suma importancia en la búsqueda de terapias dirigidas más eficaces [3]. Por lo tanto, una estrategia para mejorar el éxito de la terapia del cáncer de ovario es aumentar la sensibilidad de células madre cancerosas a los agentes de platino. La superación de la resistencia de platino sería vital en el tratamiento de cáncer de ovario con los beneficios potenciales de las tasas de respuesta mejorados, sobreviven más tiempo y más curaciones.
Recientemente, aldehído deshidrogenasa actividad (ALDH) se ha demostrado que es un muy atractivo Los CCC marcador en muchos tipos de cáncer como el de pulmón [4], de mama [5], de próstata [6], tiroides [7], cáncer de cabeza y cuello [8], y el cáncer de ovario [9] - [12]. familia ALDH comprende isoenzimas citosólicas responsables de la oxidación de aldehídos intracelulares, contribuyendo así a la oxidación del retinol al ácido retinoico en la diferenciación de células madre temprana [4]. La superfamilia de ALDH humano se compone actualmente de 19 genes conocidos supuestamente funcional en 11 familias y subfamilias 4 con distintas localizaciones cromosómicas. De las grandes familias y subfamilias ALDH, ALDH1A1 ha sido un marcador válido entre varios tejidos malignos. Se tiene la distinción de ser atractivo no sólo es un marcador potencial de stemness pero potencialmente jugar un papel en la biología de las células iniciadoras del tumor así como [13]. Además, la subpoblación ALDH1A1 había demostrado estar asociado con la quimio-resistencia en pacientes con cáncer de ovario [9], [14].
Estudios recientes en modelos de cáncer de mama ha demostrado una relación interesante entre BRCA1 y diferenciación de células madre [15], [dieciséis]. BRCA1 también se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la diferenciación de tejido de la mama mediante la regulación de Notch de señalización y la respuesta del tumor a la terapia anti-endocrino [14]. En particular, existe una relación inversa entre la expresión de los genes BRCA1 y ALDH1A1 es digno de mención en el contexto del estudio de las células madre y la quimio-resistencia, como el cáncer. BRCA1 desempeña un importante papel en la protección del genoma de las lesiones del ADN aberrantes y mutaciones o deleción en este gen conducen a la inestabilidad del genoma y aumento de la incidencia de cáncer de mama, de ovario y otros tipos de cáncer [17]. En respuesta al daño del ADN se localiza rápidamente a los sitios de roturas de cadena doble (DBL) e interviene en varias respuestas de señalización, incluyendo punto de control y la elección de la vía de reparación del ADN para corregir estas lesiones [17] - [19]. Sin embargo, el estado de los genes BRCA1 y ALDH + cáncer de ovario células madre similares a mantenimiento y su resistencia a la quimioterapia no ha sido estudiada.
Se demuestra que la ALDH + fenotipo posee características CSC de invasión mejorada, la formación de colonias, y marcadores de células madre. El isotipo ALDH1A1 específica parece ser responsable de ALDH-mediada por la resistencia de platino, tanto clínica como
In in vitro y modelos. Nuestros datos apoyan un mecanismo de resistencia de platino ALDH1A1 mediada en cáncer de ovario a través de una alteración en la regulación del punto de control y señalización de la red de reparación del ADN.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y cultivos
A2780 y A2780 resistentes línea celular CP70 se generó un cisplatino isogénica /como se describe anteriormente [20].
ALDEFLUOR ensayo y células activadas por fluorescencia Ordenando
Para aislar la población de células con una alta la actividad enzimática de ALDH, ALDEFLUOR kit de ensayo (STEMCELL Technologies Inc.) se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de tripsinización, las células se suspendieron en tampón de ensayo que contiene ALDEFLUOR ALDH sustrato enzimático BODIPY-aminoacetaldehído (BAAA), y se incubaron a 37 ° C durante aproximadamente 40 minutos. Las células se tiñeron usando las condiciones idénticas con el inhibidor específico de ALDH, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), para servir como un control negativo. La citometría de flujo sorting se llevó a cabo utilizando un clasificador celular BD Bioscience Aria II Declaración de práctica recomendada.
propiedades cancerígenas
Después de la clasificación de los fenotipos de ALDH (ALDH + vs ALDH-), la invasión de Matrigel y ensayos de formación de colonias en agar blando se realizaron como se describe anteriormente [21]. Para evaluar el efecto de la quimioterapia sobre la formación de colonias, las células fueron tratadas con medio fresco con carboplatino 20 M añaden cada 3-4 días. colonias visibles (& gt; 50 células). Se contaron en cinco campos microscópicos 40X seleccionados al azar en cada pocillo
CellTiter-Glo luminiscentes viabilidad celular Ensayo
Las células clasificadas A2780 /CP70 se sembraron a una densidad de 4000 células por pocillo en placas de 96 pocillos negro con fondo claro (Corning, NY, EE.UU.). El día siguiente, las células se trataron con varias concentraciones de carboplatino hasta 72 horas. Después de 24, 48 y 72 horas, se añadieron 100 l de reactivo CellTiter-Glo (Promega) por pocillo, se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y la luminiscencia se registró en un lector de híbrido de Synergy H4 (BioTek).
cuantitativa en tiempo real RT-PCR
cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó como se describe anteriormente [21]. Los cebadores y sondas para el sistema TaqMan fueron seleccionados de la página web de Applied Biosystems [BMI1 ensayo ID: Hs00180411_m1, c-myc ensayo ID: Hs00905030_m1, Kruppel-como factor de 4 (KLF4) ID ensayo: Hs00358836_m1, oct3 /4 ensayo ID: Hs01009568_m1, S100 calcio proteína de unión de A1 (S100A1) ensayo de ID: Hs00984741_m1, ALDH1A1 ensayo ID: Hs00946916_m1, CDKN1A (p21) de ensayo ID: Hs00355782_m1, el control interno de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa ensayo ID: Hs99999905_m1]. Los niveles relativos de ARNm de expresión de IMC1, c-myc, Oct3 /4, KLF4, S100A1, ALDH1A1, p21, se calcularon utilizando el método ΔΔCt y normalización a GAPDH.
Lentiviral del shRNA vector de transfección
Seis poblaciones diferentes pGIPZ Lentiviral shRNA glicerol contra ALDH1A1 y un control negativo shRNA (Thermo Scientific) fueron transfectadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células A2780 /CP70 se sembraron a una densidad de 2 × 10
5 células por pocillo de una placa de 6 pocillos durante 18-24 horas. Para cada pocillo, 2 g de ADN plásmido shRNA (pGIPZ) se transfectaron en A2780 /CP70 usando Detención-En reactivo (Thermo Scientific, EE.UU.). Puromicina (0,8 mg /ml) se utilizó para seleccionar las células transfectadas. Después de la optimización, eficiencia desmontables-ALDH1A1 de shRNAs individuales se evaluó mediante PCR en tiempo real cuantitativa y Western Blot. Vector 398453 demostró la transfección más eficaz con eficacia de abatimiento más del 95% de ALDH1A1 y se utilizó para todos los experimentos desmontables shRNA.
se recogieron análisis de transferencia Western
Las células cultivadas en tampón de lisis NP-40 con 10 l cóctel inhibidor /ml de proteasa (Sigma) y se sometieron a análisis de inmunotransferencia por técnicas estándar utilizando anticuerpos contra ALDH1A1, FANCJ, KLF4 (Sigma-Aldrich), FANCD2, PARP-1, XRCC1, β-actina, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), y p21, BRCA1 anticuerpos fosfo-Chk1 (Ser317), (Cell Signaling Technology)
RT
2 matriz de perfiles PCR
El cáncer humano Resistencia & amp Drogas.; Ciclo Celular RT
2 se utilizó el Perfil de PCR Array (Qiagen, EE.UU.) para el perfil de expresión de 84 genes implicados en la resistencia a fármacos contra el cáncer y el ciclo celular con cinco genes de limpieza según las instrucciones del fabricante. también se sometieron a ensayo controles de contaminación de ADN genómico y para la eficiencia de las reacciones de RT-PCR y PCR. Las matrices de PCR se realizaron usando un sistema de detección en tiempo real de Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad).
Análisis del ciclo celular por citometría de flujo
células A2780 /CP70 se transfectaron con el control o shRNAs la orientación a ALDH1A1 usando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) y las células se recogieron y se tiñeron para el análisis del ciclo celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BD Biosciences). Las células en 10
6 se resuspendieron con 300 l de PBS, y 700 l de hielo metanol frío para fijar las células durante la noche a -20 ° C. Las células se lavaron dos veces con PBS, y luego se tiñeron con 500 l de yoduro de propidio (BD Bioscience) a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad. perfiles del ciclo celular se analizaron mediante citometría de flujo.
Ensayo de apóptosis
A2780 /CP70 células transfectadas con el control negativo o shRNA-ALDH1A1 se indujo la apoptosis mediante el tratamiento con 1,0 M estaurosporina durante 6 horas [22 ], [23]. APC-Anexina V y tinción 7-AAD se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada grupo contiene tres controles de isotipo: células sin teñir; APC células teñidas con anexina V solos; Las células se tiñeron con 7-AAD solo. Las muestras se analizaron por citometría de flujo.
PARP Ensayo de actividad
actividad PARP se midió usando PARP HT vivo kit farmacodinámico Ensayo II (Trevigen) en. Después del tratamiento con 100 carboplatino mu M durante 45 minutos, las células A2780 /CP70 transfectadas con control negativo o shRNA-ALDH1A1 se lavaron dos veces con 5 ml de tibia (37 ° C) PBS. Las células se rasparon en 300 l de tampón de lisis de células frío y se incubaron en hielo durante 15 minutos. SDS se añadió a las muestras a una concentración final de SDS de 1% y se incubó a 100 ° C durante 5 minutos. Cuando las muestras se enfriaron a temperatura ambiente, se añadieron 0,01 volumen de 100X de cationes de magnesio y 2 l de ADNasa I (2 Unidades /l) a las muestras y se incubaron durante 90 minutos adicionales a 37 ° C. Después de una breve centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y los niveles polyADP-ribosa (PAR) en los extractos celulares se cuantificaron utilizando el método de ELISA.
Correlación clínica
Todas las participantes proporcionaron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio y la junta de revisión institucional de la Universidad del Sur de Alabama Sistema de Salud aprobado este estudio, así como el procedimiento de consentimiento. Ascitis de 15 pacientes consecutivos sometidos a cirugía de avanzada etapa IIIC /IV cáncer papilar seroso de ovario, así como 2 pacientes con ascitis benignos se recogieron y se procesó de inmediato para llevar a cabo el ensayo ALDEFLUOR después de lavarlas con PBS y la eliminación de los eritrocitos usando tampón de lisis ACK (Lonza , Walkersville, MD, EE.UU.). se recogieron los datos clínico-patológicas de los pacientes respectivos y se correlacionó con el porcentaje de células ALDH + exhibido fenotipo en sus ascitis.
Análisis estadístico
Las comparaciones entre los dos grupos se realizaron mediante la prueba t y ANOVA, donde de Student apropiado. La significación estadística se determinó a
p Hotel & lt; 0,05. Curva de Kaplan-Meier para la supervivencia se realizó con log-rank para la comparación estadística.
Resultados
Estado de la ALDH se correlaciona con la resistencia al cáncer de ovario agentes de platino
líneas celulares isogénicas de platino sensible (A2780) y las células resistentes (A2780 /CP70) de cáncer de ovario se evaluaron para determinar sus tasas de supervivencia en presencia y en ausencia de diferentes dosis de carboplatino. En consonancia con el resultados previamente reportados [24], [25], A2780 células /CP70 requiere hasta un 10 veces más alta dosis de carboplatino para lograr el IC
50 concentración en comparación con sus contrapartes sensibles platino, A2780 (Figura 1A) . Recientemente, en varios modelos de cáncer, el estado de ALDH se ha implicado en la resistencia del tumor a la quimioterapia mediante el mantenimiento de las características de las células de cáncer de tallo como 'tales como el crecimiento agresivo, el aumento de la supervivencia y la re-diferenciación potencial [9]. Con el fin de probar la correlación entre el estado de ALDH y de resistencia de platino en las células de cáncer de ovario, los ensayos ALDEFLOUR se realizaron en estas células isogénicas. Curiosamente resistentes línea celular de cáncer de ovario platino A2780 /CP70 exhibió al menos 110 veces mayor porcentaje de células ALDH + (con un rango de 22-40%) en comparación con los de platino sensible células A2780, que tenían sólo un 0,2% de células ALDH + (Figura 1B) . Del mismo modo, el análisis de transferencia Western de los niveles de proteína ALDH1A1 en estas células reveló resultados similares, lo que sugiere la asociación de la condición de ALDH con resistencia de platino (Figura 1C)
líneas celulares isogénicas (platino sensible A2780- & amp;. Platino A2780 /CP70- resistente) se evaluaron para la respuesta de platino usando el ensayo de sensibilidad a los fármacos como se describe en M & amp; M sección (a). Para evaluar el porcentaje de ALDH + células, en A2780 y A2780 /células CP70 ensayo ALDEFLUOR se llevó a cabo mediante el uso de BODIPY-aminoacetaldehıdo (BAAA) como sustrato para la enzima ALDH, después de 40 minutos de incubación a 37 ° C citometría de flujo El análisis se realizó (B) y occidentales blot muestran los datos que representan los niveles de ALDH1A1 isoenzima en estas células (C).
Para evaluar si las células madre similares a ALDH + cáncer también están presentes en los tumores primarios y su asociación con la supervivencia libre de progresión de los pacientes , hemos recogido ascitis de 15 pacientes con cáncer de ovario con enfermedad avanzada y ascitis 2 benignos de los pacientes con síndrome de Meigs y se analizó el porcentaje de células con expresión de ALDH utilizando el ensayo ALDEFLOUR. De acuerdo con la hipótesis de las células madre de cáncer, las células ALDH + estaban presentes en porcentaje mucho mayor en la ascitis malignos en comparación con sus homólogos benignas. El porcentaje de células ALDH + en la ascitis maligna osciló entre el 1,3 al 25,4% (pacientes 3-17) en comparación con 2 ascitis benignos (pacientes 1 y 2 amp;) (Figura 2A). Lo más importante, el porcentaje de células ALDH + en la ascitis paciente inversamente correlacionada con supervivencia libre de progresión. Los pacientes que mostraron ALDH
ALTA (& gt; 15% de ALDH) en sus ascitis demostró significativamente menor supervivencia libre de progresión en comparación con los pacientes con ALDH
BAJA (& lt; 15% de ALDH) (3 vs 9 meses, respectivamente;
p
= 0,003) (Figura 2B). A pesar de que es difícil sacar una conclusión significativa debido al número limitado de ascitis utilizados en este estudio, estos datos indican una correlación directa entre el estado clínico ALDH con la respuesta del tumor a los agentes de platino y supervivencia libre de progresión de los pacientes con cáncer de ovario.
La ascitis se obtuvo a partir de 15 pacientes consecutivos con estadio avanzado primaria III /IV de cáncer de ovario y de 2 (síndrome Miegs) benigna y se analizó el porcentaje de células ALDH + a través de ensayo ALDEFLUOR. El histograma en recuadro muestra el porcentaje de ALDH + células en ascitis benignos y malignos (A). La información clinicopatológica de los pacientes de cáncer de ovario se correlacionaron con el porcentaje de células ALDH + en sus ascitis y se evaluó la supervivencia libre de progresión con ALDH
HIGH (& gt; 15% ALDH) para ALDH
LOW (& lt; 15% ALDH) 3 pacientes (frente a 9 meses, respectivamente;
p Hotel & lt; 0,01). (B)
propiedades de células
ALDH + células de cáncer de ovario exhibe madre
estos resultados nos llevaron a caracterizar mejor ALDH como un marcador de células madre potencial en el cáncer de ovario. La progresión tumoral puede estar asociada con la presencia de un subconjunto de células que expresan marcadores de células madre y exhiben propiedades de comportamiento agresivos, incluyendo la formación de colonias potencial invasivo y aumentado. Para investigar sus propiedades invasivas, se evaluaron células clasificadas (ALDH + vs ALDH-) usando el ensayo de invasión de Matrigel. Como se muestra en las figuras 3A & amp; 3B, las células ALDH + demostró más de 1,7 veces mayor (
p
& lt; 0,01). En la invasión a través de Matrigel comparación con las células ALDH-
A2780 células /CP70 se clasificaron en ALDH- y ALDH + fenotipos y evaluado por sus habilidades para la invasión utilizando cámaras de invasión Matrigel (a), los datos cuantitativos, como se representa (B) y el potencial de formación de colonias en la presencia y ausencia de carboplatino (20 mM) se evaluaron usando agar blando ensayos de formación de colonia (C). Con el fin de determinar la posible mecanismo para características de las células madre de cáncer en ALDH + células, se evaluaron múltiples marcadores de "stemness". células A2780 /CP70 se clasificaron en ALDH- y ALDH + fenotipos, se aisló RNA total, se preparó ADNc y se realizó cuantitativa en tiempo real RT-PCR (D). ** Indica significancia estadística (
p Hotel & lt; 0,01).
Otra medida sustituta para caracterizar las células madre, como el cáncer es la capacidad de formar colonias, especialmente en presencia de agentes quimioterapéuticos [26]. En consonancia con su potencial invasivo, las células ALDH + demostraron la capacidad de formación de colonias mejorada en comparación con los fenotipos ALDH- (aumento de 2 veces,
p Hotel & lt; 0,01). Es importante destacar que los fenotipos ALDH + que se muestra mejoraron la capacidad de formación de colonias en presencia de carboplatino (aumento de 5,4 veces,
p Hotel & lt; 0,01) (Figura 3C). Con el fin de profundizar en los posibles mecanismos madre similar de estas células, se evaluaron las posibles vías de células madre de interés en estas células. Los datos de RT-PCR mostraron casi 3 veces más alta expresión nivel de Krüppel-Como Factor 4 (KLF4) en ALDH + células en comparación con sus homólogos ALDH-. KLF4 pertenece al zinc dedo familia de factores de transcripción, que se ha informado que son críticos para el mantenimiento de las células madre de cáncer de mama y su comportamiento agresivo tales como la migración y la invasión resistencia anuncio a cisplatino [27] [28]. Sin embargo, otros mediadores de células madre como IMC1, c-myc, Oct3 /4 y S100A1 no mostraron cambios notables en su expresión en comparación con fenotipos ALDH- (
p Hotel & lt; 0,01). (Figura 3D)
isotipo ALDH1A1 promueve propiedades
células madre de cáncer de ovario-como '
de acuerdo con la literatura CSC, nuestros datos revelaron una expresión elevada de ALDH1A1 isoenzima en el platino células A2780 resistente /CP70. A fin de evaluar el papel de ALDH1A1 en el mantenimiento de las células madre de cáncer-como propiedades de las células de cáncer de ovario resistentes a platino, hemos downregulated ALDH1A1 isoenzima específica usando shRNAs (Figura S1). Contrariamente a su alta expresión, regulación a la baja de ALDH1A1 no ha mostrado diferencias considerables en las propiedades invasivas de estas células (Figura 4A & amp; 4B). Sin embargo, ALDH1A1 knockdown afectada su capacidad de formar colonias en agar blando, lo que demuestra una disminución de 2,5 veces en las colonias (
p
& lt; 0,01) (Figura 4C). Del mismo modo, la regulación negativa de ALDH1A1 solo sensibilizado significativamente células de platino inherentemente resistente A2780 /CP70 al carboplatino. Teniendo en cuenta IC
50 dosis requeridas (82,9 M 43,8 M y para el control negativo y las células shALDH1A1 respectivamente) para estas células, una reducción de aproximadamente el 50% de la dosis de carboplatino es evidente para las células ALDH1A1 desmontables (
p Hotel & lt; 0,001 ) (Figura 4D). En conjunto, estos datos sugieren que el estado ALDH1A1 es uno de los factores críticos en el mantenimiento de las propiedades de células madre similares y de resistencia de platino en el cáncer de ovario.
Células
Los vectores lentivirales que expresan shRNAs específicos ALDH1A1 o nontargeting shRNAs se transfectaron en A2780 /CP70 y su efecto sobre las propiedades de células madre-como se evaluó el potencial invasivo utilizando cámaras de invasión de Matrigel (a), los datos cuantitativos como representado (B), el potencial clonogénico utilizando la formación suave de colonias en agar (C, y la inhibición del crecimiento dependiente de carboplatino por CellTiter-Glo luminiscentes ensayo de viabilidad celular (D). la significación estadística se evaluó utilizando
prueba t de Student.
ALDH1A1 controla punto de control de regulación de KLF4 y proteínas p21
el aumento de expresión de KLF4 en ALDH + células (Figura 3D) nos llevó a evaluar cualquier relación funcional entre ALDH1A1 y KLF4. Aunque ALDH1A1 caída no afectó el nivel de KLF4 mRNA, una disminución significativa en los niveles de proteína KLF4 se puso de manifiesto en estas células (Figura 5A ). Teniendo en cuenta que el estado funcional de la p21 regulador del ciclo celular está íntimamente relacionada con la función de KLF4, también se evaluaron los niveles de ARNm y proteína de p21. Como se esperaba, ambos ALDH1A1 de transcripción y los niveles de proteína de p21 se redujeron dramáticamente en ALDH1A1 A2780 deficiente /células CP70 (Figura 5A). Desde el estado de ALDH1A1 influenciada expresión de ciclo celular control de las proteínas p21 /CDK4, que además analiza los perfiles del ciclo celular de estas células. Los datos de citometría de flujo indican claramente disminuido población de células G1 (50,25% a 42,10%) y un aumento compensatorio en la acumulación de células en fases S y G2 (Figura 5B). Debido al hecho de que las células en replicación activa (fases S y G2) son más vulnerables a estrés genotóxico en comparación con su no se dividen o otras fases inquietas (G0 y G1), el re-sensibilización de las células deficientes ALDH1A1 puede ser en parte atribuible a los cambios en la distribución del ciclo celular. Por otra parte, también hemos confirmado que el estado KLF4 afecta p21 niveles de expresión en las células A2780 /CP70 (Figura S2A & amp; S2 B). Sin embargo, la evaluación de la actividad de ALDH y expresión ALDH1A1 en las células no mostraron cambios notables, lo que sugiere KLF4 probable que sirve para ALDH1A1 aguas abajo (Figura S2C).
ALDH1A1 A2780 deficientes y no deficientes /CP70 se evaluaron las células para la expresión de la madre marcador -como celular KLF4 y ciclo celular p21 proteína de punto de control por RT-PCR y análisis de transferencia Western (A). distribuciones del ciclo celular de las células se analizaron después de la fijación de las células en la tinción de metanol y yoduro de propidio 70%, seguido por citometría de flujo (B). Se detectaron células apoptóticas después de la tinción de las células con APC-Anexina V y 7-AAD de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se analizaron por citometría de flujo (C).
A fin de evaluar los genes responsables de la quimiorresistencia celular y la regulación del ciclo basado en el estado de ALDH1A1, hemos utilizado RT
2 matriz de perfiles PCR para la resistencia humana & amp droga contra el cáncer; Ciclo Celular (Ambion). Los perfiles de expresión de los genes en comparativos ALDH1A1 desmontables vs. células de control revelaron una disminución significativa en la expresión de la reguladores del ciclo celular CDKN1A (P21) (0,27 veces) y CDK4 (0,26 veces), lo que confirma su papel en conjunción con KLF4 ( Tabla 1).
Es de destacar que, con sensibilidad al platino restaurada a partir de ALDH1A1 caída, la expresión del factor pro-apoptótica BAX fue regulado hasta casi 3.95 veces. ALDH1A1 knockdown demostró mayor número de células en la fase temprana de apoptosis en comparación con el control. Después de la exposición de las células a 1,0 mM estaurosporina durante 6 horas, se observó un aumento espectacular de las células apoptóticas tempranas en las células deficientes ALDH1A1 en comparación con sus homólogos ALDH1A1 competentes (35,3% vs. 20,3%) (Figura 5C). Estos datos sugieren que las células ALDH1A1 desmontables son más susceptibles a la apoptosis inducida por BAX, que ha sido bien descrito en la inhibición de punto de control del ciclo celular p21 [29].
resistencia de platino ALDH1A1 mediada correlaciona a las redes de reparación del ADN alterado
puntos de control del ciclo celular intacta y respuesta al daño del ADN (DDR) los mecanismos de señalización son importantes para la capacidad de la célula para contrarrestar con diferentes tipos de insultos genómicas y la progresión ordenada del ciclo celular. regulación Sin embargo, una característica común de las células de cáncer se altera de estas cascadas de señalización para adquirir cambios genéticos adicionales requeridos para la re-diferenciación y supervivencia de este modo mostrar resistencia terapéutica. Del mismo modo, las células ALDH1A1 muestran alteración en la regulación de KFL4 /p21 mediada por mecanismo del ciclo celular puesto de control, que principalmente dirige la inhibición de G1 a S y G2 a M progresión en respuesta al daño del ADN para dar más tiempo a la célula para reparar. Teniendo en cuenta la asociación de PARP-1 en la reparación del daño en el ADN inducido por carboplatino, evaluamos su implicación en las células ALDH1A1. PARP-1 en los niveles aumentaron progresivamente hasta 45 minutos después del tratamiento carboplatino (Figura 6A y 6B). Sin embargo, la regulación negativa de ALDH1A1 causó una disminución significativa (1,8 veces) en los niveles totales de PAR (actividad de PARP) (Figura 6C) en comparación con células capaces de ALDH1A1 (
p = 0,012
).
ALDH1A1 competentes (control) y células CP70 deficientes (shALDH1A1) A2780 /fueron evaluados por su capacidad para reparar carboplatino inducida solo filamento se rompe al ver la inducción dependiente del tiempo de la PARP-1 los niveles de proteína mediante transferencias Western (a), densitometría de los borrones de la imagen J ( B) y la actividad total de PARP se ensayó midiendo los niveles de PAR (C). Para evaluar las proteínas dependientes de DDR expresión y reparación ALDH1A1, lisados de células enteras fueron normalizados para las proteínas totales y análisis de transferencia de Western se realizaron utilizando anticuerpos tal como se representa (D).
Varios estudios recientes sobre el cáncer de mama stem- células indican regulación de las redes de reparación del ADN, en particular una relación inversa entre el nivel ALDH1A1 y la expresión de genes BRCA1 [15], [16] alterados. Por otra parte, en respuesta al daño del ADN, BRCA1 es conocido para gobernar los puntos de control del ciclo celular y la elección de las vías de reparación del ADN para la reparación puntual de estas lesiones del ADN [16]. En consonancia con los datos de las células madre del cáncer de mama, Western blot reveló una relación inversa entre ALDH1A1 y expresión de BRCA1 en las células A2780 CP70 /, lo que sugiere ALDH1A1 expresando células madre similares a cáncer de ovario más probabilidades de perder o expresar bajos niveles de BRCA1. Un análisis más detallado reveló en la regulación de la respuesta inducida por daño en el ADN espontánea ALDH1A1 expresando la proteína γ-H2AX (un marcador de doble filamento se rompe). Esto también se coincidió con los niveles disminuidos de proteína de reparación por escisión (XRCC1), la replicación de punto de control de la proteína quinasa 1 (Chk1) y otra replicación de estrés asociado anemia de Fanconi (FA) -BRCA productos génicos FANCD2 y FANCJ [30] - [32]. En conjunto, estos datos sugieren que las células madre como cáncer de ovario puede mantener la resistencia terapéutica expresando ALDH1A1 y el agotamiento de los cuales, anula G1 y puntos de control de la fase S (Figuras 5A y 6C) que conducen a la replicación de estrés (Figura 5B). se vieron afectadas las células agotadas Aunque ALDH1A1 acumulados en las fases S y G2, el estado de fosforilación de la proteína de replicación punto de control Chk1 (Ser317) y la expresión de la horquilla asociada FA proteínas de la vía de replicación FANCD2 y FANCJ. Esto también es conferida por la inducción de γ-H2AX, un marcador de OSD y la supervivencia celular reducida. Dado que las proteínas de Chk1 y FA son importantes para el puesto de control de la replicación y la estabilidad de las horquillas de replicación atascadas, la respuesta al daño de ADN espontánea en estas células se puede atribuir a defecto en estas proteínas (Figura 6D). Para identificar las señales de la red moleculares que se expresan diferencialmente en las células que expresan ALDH1A1, se evaluó inicialmente la expresión de Fanconi anemia vía y la resistencia del tumor a agentes quimioterapéuticos. Constantemente, nuestros resultados demuestran una correlación directa entre el estado y la expresión ALDH1A1 FANCD2. En conjunto nuestros datos indican una conexión entre el estado ALDH1A1 a la resistencia stemness y platino de células de cáncer de ovario por la alteración en la regulación de las obras de reparación del ADN.
Discusión
Varios marcadores de superficie específicos potenciales CSC de ovario se han descrito tales