Extracto
expresión y función de lectina-como lipoproteína oxidada de baja densidad del receptor-1 alterado (LOX-1) se ha asociado con varias enfermedades tales como la disfunción endotelial, la aterosclerosis y la obesidad. En estas patologías, oxLDL /LOX-1 activa las vías que promueven la proliferación celular, la motilidad celular y la angiogénesis de señalización. Estudios recientes han indicado que
OLR
1 mRNA se sobre-expresa en estadio III y IV de adenocarcinomas prostáticos humanos. Sin embargo, la función de LOX-1 en la angiogénesis del cáncer de próstata que queda por determinar. Nuestro objetivo fue analizar la contribución de LDLox y LOX-1 a la angiogénesis tumoral usando C4-2 células de cáncer de próstata. Se analizó la expresión de moléculas pro-angiogénicos y la angiogénesis en xenoinjertos de tumores de cáncer de próstata, el uso de modelos celulares de cáncer de próstata con sobreexpresión o desmontables de LOX-1 receptor. Nuestros resultados demuestran que la activación de LOX-1 usando oxLDL aumenta la proliferación celular, y la expresión de las moléculas pro-angiogénicos VEGF, MMP-2 y MMP-9 en una forma dependiente de la dosis. Notablemente, se impidió a estos efectos en el modelo de cáncer de próstata C4-2 cuando LOX-1 de expresión fue derribado. El efecto angiogénico de LOX-1 activado con oxLDL se demostró adicionalmente usando el ensayo de anillo aórtico y el modelo de xenoinjerto del crecimiento del tumor en membrana corioalantoidea de embriones de pollo. En consecuencia, proponemos que el LOX-1 de activación por oxLDL es un evento importante que mejora la angiogénesis tumoral en las células de cáncer de próstata humano
Visto:. González-Chavarría I, Cerro RP, Parra NP, Sandoval FA, FA Zuñiga, Omazábal VA, et al. (2014) Al igual que la lectina-LDL oxidada del receptor-1 es un promotor de la angiogénesis tumoral en células de cáncer de próstata humano. PLoS ONE 9 (8): e106219. doi: 10.1371 /journal.pone.0106219
Editor: V. Salvatore Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Febrero, 2014; Aceptado: July 29, 2014; Publicado: 29 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 González-Chavarría et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación recibió el apoyo de subvención Fondecyt 1121159, Conicyt, Chile. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
lectina-como lipoproteína de baja densidad oxidada receptor-1 (LOX-1) es un miembro de la familia de receptores scavenger [1], que media el reconocimiento y la internalización de las LDL oxidadas (ox-LDL) [2 ]. LOX-1 se expresa principalmente en las células endoteliales, aunque este receptor también se puede encontrar en muchos otros tipos de células tales como monocitos, cardiomiocytes, adipocitos, plaquetas, macrófagos y células musculares lisas vasculares [3]. La expresión alterada y la función de LOX-1 receptor se ha asociado con enfermedades tales como disfunción endotelial, aterosclerosis, obesidad, y recientemente también con el desarrollo de tumores [4] - [6]. La activación de LOX-1 por oxLDL en las células endoteliales humanas induce la expresión de moléculas de adhesión; vías de señalización pro inflamatorias; y las proteínas pro-angiogénicos, tales como la metaloproteinasa-2 y 9 (MMP-2 y MMP-9), la angiotensina II (Ang II) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [7] - [10]. La angiogénesis es un proceso fisiológico, que determina la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes [11]. Se considera un fenómeno normal durante el desarrollo embrionario, el crecimiento del organismo y la cicatrización de heridas [12]. Sin embargo, la angiogénesis también es un proceso fundamental para el desarrollo y la progresión de varios tipos de tumores [13]. La angiogénesis tumoral es regulada por el equilibrio entre moléculas pro y anti-angiogénicos liberados por las células tumorales y las células estromales tumorales, tales como fibroblastos y macrófagos, que determinan el encendido de la angiogénesis del tumor [14], [15]. La expresión de genes en la angiogénesis tumoral se regula adicionalmente en respuesta a varios estímulos, incluyendo la hipoxia, estrés oxidativo y la inflamación. En esta conexión entre estímulos y la expresión de proteínas pro-angiogénico, VEGF ha sido identificado como un factor importante en la angiogénesis del tumor [16], [17]. La hipoxia, la secreción de citoquinas y el estrés oxidativo en las células tumorales aumentan la expresión de VEGF, lo que induce la angiogénesis del tumor [18].
LOX-1 se ha sugerido como una posible relación entre la obesidad, la dislipidemia y el cáncer [19] . En consonancia, las condiciones clínicas de la obesidad y la aterosclerosis se han asociado con la progresión tumoral y la metástasis en el cáncer de próstata [20] - [22]. Los pacientes diagnosticados con síndrome metabólico, enfermedades inflamatorias crónicas y enfermedades autoinmunes mostraron una alta incidencia y la agresividad en el desarrollo de tumores [23]. De hecho, estudios recientes han demostrado un aumento de la expresión de LOX-1 en adenocarcinomas de próstata humanos en las etapas III y [5] IV, que requieren nueva vascularización y la angiogénesis para la invasión local. Sin embargo, el efecto específico de LOX-1 en la angiogénesis tumoral aún no se ha descrito.
Este trabajo demuestra que el LOX-1 y su activación mediante oxLDL inducir la angiogénesis tumoral y estimular la proliferación celular en las células del cáncer de próstata. Específicamente, se demuestra que la activación de LOX-1 usando oxLDL promueve la proliferación celular, y la expresión de moléculas pro-angiogénicos VEGF, MMP-2 y MMP-9 en una forma dependiente de la dosis. En particular, se impidió a estos efectos en el modelo de cáncer de próstata C4-2 cuando LOX-1 de expresión fue derribado. Además, el efecto angiogénico de LOX-1 activado por oxLDL se demostró usando el ensayo de anillo aórtico y el modelo de xenoinjerto de tumor de crecimiento en las membranas corioalantoideas (CAM) de embriones de pollo. Por lo tanto, proponemos que el LOX-1 de activación por oxLDL es una vía de activación de los elementos que permitan la mejora angiogénico del desarrollo de tumores de las células de cáncer de próstata humano.
Resultados
Generación de líneas celulares de cáncer de próstata sobreexpresan LOX-1 y shRNA contra olr1
las líneas celulares de cáncer de próstata C4-2 fueron transducidas con el vector de expresión lentiviral LvCW-LOX-1, que codifica la
olr1
gen bajo el control del citomegalovirus promotor (CMVP), y aislado utilizando el método de clonación por dilución limitante. La sobreexpresión de LOX-1 en las células C4-2 se determinó usando PCR en tiempo real, inmunotransferencia, e inmunofluorescencia. Se obtuvieron siete clones diferentes con LOX-1 sobreexpresión, de estos, se seleccionaron 3 clones después de los experimentos de Western blot y se analizaron mediante PCR en tiempo real (fig. 1A y D). El clon de células seleccionado C4-2 /LOX-1 (+) (clon 5) tenía un 1,2 × 10
3 veces más que la expresión de LOX-1 los niveles basales de mRNA de la línea celular nativo C4-2 o C4-2 /control de la sobreexpresión de GFP. Además, LOX-1 sobreexpresión en este clon se immunolocalized en la membrana celular mediante microscopía confocal (Fig. 1F). Para determinar si la sobreexpresión mediada por partículas lentivirales tuvo un efecto sobre la expresión de LOX-1, se generó un control de sobreexpresión (células C4-2 /GFP). No se observaron cambios significativos en la expresión de LOX-1 en este control en comparación con la línea celular nativa C4-2 (Fig. 1C y F).
A) Western blot para LOX-1 (40 kDa ) expresión en clones de CaP humanos con sobreexpresión de LOX-1. B) Western blot para LOX-1 (40 kDa) expresión en clones de células de cáncer de próstata humanos con LOX-1 desmontables C) PCR en tiempo real para LOX-1 expresión en tres clones con sobreexpresión de LOX-1. D) PCR en tiempo real para LOX-1 de expresión se determinó en tres clones que expresan shRNA /LOX-1 (A), y tres clones que expresan shRNA /LOX-1 (B). Los datos representan las medias ± S. D. de tres experimentos independientes realizados por triplicado, y se analizaron estadísticamente usando el análisis unidireccional de varianza y post-test de Dunnett; (***
p≤0.001
, **
p≤0.01
, *
p = 0.05
).
El LOX- 1 caída en células C4-2 se logró utilizando un shRNA contra el ARNm codificado por el
olr1
gen. C4-2 células fueron transducidas con vectores lentivirales para la expresión de cada shRNA (LVW-U6 /
OLR
1) contra la secuencia
olr1
bajo el control del promotor U6. Se aislaron las células transducidas mediante el método de clonación de dilución limitante, y LOX-1 abajo-expresión se analizó utilizando PCR en tiempo real, inmunotransferencia, e inmunofluorescencia (Fig. 1). Dos secuencias diferentes shRNA, shRNA-A y shRNA-B, fueron analizados. 1-LOX caída se obtuvieron tres clones diferentes de shRNA-A y B-shRNA. El clon ARNhc-B seleccionado disminuyó LOX-1 de expresión en un 98%, en comparación con los basales LOX-1 los niveles de mRNA de la línea celular nativa C4-2 o la línea celular de control desmontables C4-2 /LvEmpty (fig. 1B-E). Además, la baja expresión de LOX-1 en este clon fue verificado por inmunohistoquímica (Fig. 1F). Para determinar si la caída mediada por partículas lentivirales tuvo un efecto sobre la expresión de LOX-1 un control de caída fue generado (C4-2 /LvEmpty). No se observaron cambios significativos en la expresión de LOX-1 en este control en comparación con la línea celular nativa C4-2 (Fig. 1C y F).
Los modelos celulares de cáncer de próstata obtenidos, a saber C4-2 /LOX-1 (+) [clon 5], C4-2 /LOX-1 (-) [clon ARNhc-B1] y la línea celular C4-2 nativa, fueron utilizados como modelos en todos los ensayos realizados en este trabajo
LDLox no tiene efectos de citotoxicidad en modelos celulares de cáncer de próstata
a partir de la oxidación de LDL nativa de paciente normolipemic se obtuvo una fracción de medio nivel LDL oxidada (LDLox), que fue verificado por la generación de dienos conjugados y electroforesis en tampón de borato de sodio en 1% de agarosa (Fig. 2A). Para determinar si la oxLDL obtenido tenía algún efecto citotóxico se incubaron los modelos celulares de cáncer de próstata con oxLDL (25 a 150 mg /ml) durante 12 horas. Nuestros resultados no mostraron efectos citotóxicos de oxLDL en cualquiera de los modelos celulares de próstata para el rango de concentraciones ensayadas (Fig. 2B). Sin embargo, se observó un aumento significativo en la proliferación celular de C4-2, C4-2 /GFP, C4-2 /LvEmpty y C4-2 /LOX-1 (+) modelos celulares para todas las concentraciones utilizadas LDLox, en comparación con el mismo sin tratar modelos celulares de cáncer de próstata. Además, se observó un aumento significativo de la proliferación celular en C4-2 /LOX-1 (+) en comparación con el C4-2, o la sobreexpresión y controles desmontables para todas las concentraciones de LDLox analizados. Sin embargo, el efecto proliferativo se evitó totalmente en el /-1 LOX C4-2 (-) modelo de células, sobre todas las concentraciones analizadas (Fig 2B).
A) oxLDL obtenido a partir de plasma humano se oxidó con 7. M de CuSO
4, supervisado por espectrofotometría a 243 nm y λ a electroforesis en geles de agarosa al 1% con tampón de borato de sodio. B) Ensayo de citotoxicidad de modelos celulares de cáncer de próstata tratados con 25, 50, y 100 mg /ml oxLDL durante 12 horas. Los datos representan las medias ± S. D. de tres experimentos independientes realizados por triplicado y estadísticamente analizados utilizando ANOVA de una vía y posterior a la prueba de Dunnett (* o#
p = 0.05
).
El ligando LDLox aumenta la expresión de marcadores pro-angiogénicos
la línea celular de cáncer de próstata C4-2 se incubó con concentraciones crecientes de LDL-ox (25, 50, 100 mg /ml) durante 12 horas, y la expresión del VEGF marcadores pro-angiogénicos , MMP-2 y MMP-9 se analizaron mediante PCR en tiempo real. Nuestros resultados mostraron un aumento significativo en la expresión de VEGF, MMP-2 y MMP-9, proporcional a las concentraciones utilizadas LDLox, con una respectiva de 3,5, de 2,5, y aumento de 3 veces, cuando 100 g /ml de oxLDL era usado. Por otra parte, LOX-1 de expresión también se aumentó proporcionalmente con las concentraciones de oxLDL utilizados, mostrando un aumento de 3 veces en 100 mg /ml (Fig. 3).
cuantificación relativa de LOX-1, VEGF, MMP -2, y MMP-9 expresión se realizó mediante PCR en tiempo real en la línea celular de cáncer de próstata humano C4-2 se incubaron con una concentración creciente de oxLDL (25, 50, 100 mg /ml) durante 12 horas. Los datos representan la media ± S. D. de tres experimentos independientes realizados por triplicado, y se analizaron estadísticamente mediante análisis de varianza de una sola vía y post-test de Dunnet; (***
p≤0.001
, **
p≤0.01
, *
p = 0.05
).
El aumento de expresión de marcadores pro-angiogénicos en las células del cáncer de próstata requiere la activación de LOX-1 por LDLox
Los modelos de células de cáncer de próstata C4-2 /LOX-1 (-) y C4-2 /LOX-1 (+) se incubaron con 100 mg /ml oxLDL durante 12 horas, y la expresión de los marcadores pro-angiogénicos (VEGF, MMP-2 y, MMP-9) se analizó. La expresión de VEGF, MMP-2 y, MMP-9 en la línea celular C4-2 incubaron con oxLDL aumentó significativamente (2-, 2-, y 2,5 veces, respectivamente), en comparación con las células no tratadas C4-2 (Fig. 4A ). Curiosamente, la expresión de marcadores pro-angiogénicos inducidos por oxLDL, se evitó en el LOX 1-C4-2 /(-) de próstata modelo de células de cáncer. Por otro lado, la estimulación de C4-2 /LOX-1 (+) con oxLDL aumentó significativamente la expresión de todos los marcadores pro-angiogénicos analizados (VEGF y MMP-2, 2 veces; MMP-9 3 veces), en comparación con las células no tratadas C4-2. La expresión de VEGF, MMP-2 y MMP-9 células en C4-2 /LOX-1 (+) también se incrementó significativamente (de 1,6, 1,5, y 1,4 veces, respectivamente), incluso en ausencia de oxLDL estimulación, y se redujo en 20%, 50%, y 20% en C4-2 /LOX-1 (-) las células, en comparación con la expresión endógena en la línea celular C4-2 sin estimulación oxLDL (Fig 4A).
C4-2, C4-2 /LOX-1 (-), y C4-2 LOX-1 (+) modelos de células de cáncer de próstata humano se incubaron en la con o sin oxLDL [100 mg /ml] durante 12 horas. A) cuantificación relativa de VEGF, MMP-2, y la expresión de MMP-9 se analizaron mediante PCR en tiempo real. Los datos representan las medias ± S. D. de tres experimentos independientes realizados por triplicado y estadísticamente analizados usando análisis unidireccional de varianza y post-test de Dunnet; (***
p≤0.001
, **
p≤0.01
, *
p = 0.05
). B) Western blot para la expresión de VEGF (30 kDa). C) Zimogramo para la MMP-2 (72 kDa pro-forma; 64 kDa activa-forma) y MMP-9 (92 kDa pro-forma;. 84 kDa activa-forma) las actividades en el medio condicionado
El medio acondicionado a partir de modelos celulares de cáncer de próstata incubadas con oxLDL [100 mg /ml] se recogieron y se concentró. Más tarde la expresión de VEGF se evaluó por inmunotransferencia, y la actividad de MMP-2 y MMP-9 se analizó por zimografía. Nuestros resultados acusados que la expresión de VEGF se incrementó en las células incubadas con C4-2 oxLDL, al comparar con las células C4-2 sin oxLDL, mientras que la expresión de VEGF se impidió en C4-2 /LOX-1 (-) células incubadas con oxLDL [ ,,,0],100 mg /ml]. Por otra parte, la expresión del VEGF se incrementa en células C4-2 /LOX-1 (+) con o sin tratamiento oxLDL (Fig. 3B). Análisis de la actividad metaloproteinasa mostró un incremento en la actividad de la gelatinasa de MMP-2 y MMP-9 en el medio acondicionado a partir de células incubadas con C4-2 oxLDL, y se impidió en medio condicionado de /LOX-1 C4-2 (-) células se incubaron con oxLDL. Además, LOX-1 sobreexpresión en C4-2 /LOX-1 (+) células mostró un aumento de la actividad de MMP-2 y MMP-9 con o sin estimulación oxLDL (Fig. 4C).
Activación de LOX -1 por oxLDL promueve la generación de brote en anillos de aorta de ratón
se analizaron C4-2 células modelo incubadas con oxLDL para determinar si la generación de brotes endoteliales podría ser estimulada en el ensayo de anillo aórtico por la secreción diferencial de marcadores pro-angiogénicos. La C4-2, C4-2 /LOX-1 (-) y C4-2 /LOX-1 (+) modelos de células se incubaron con 100 mg /ml se recogió de oxLDL durante 12 horas, y el medio acondicionado, se concentró y utilizado para el tratamiento de anillos de aorta de ratón.
la estimulación de los anillos aórticos con medios condicionados a partir de C4-2 y las células tratadas con oxLDL C4-2 /LOX-1 (+) mejora de forma significativa la generación de brotes en comparación con la línea de células sin tratar C4-2. (-) No, con o sin estimulación LDLox, fueron significativas Sin embargo, las diferencias entre la generación de brotes anillo aórtico Uso de los medios de C4-2 LOX-1 /condicionadas. Por lo tanto, la sobre expresión de LOX-1 promovió la generación de brotes con o sin estimulación oxLDL (Fig. 5A).
A). Microfotografía de anillos de aorta de ratón y la cuantificación de los brotes por anillo incubadas con medio condicionado de cáncer de próstata C4-2, C4-2 /LOX-1 (-), y las células C4-2 LOX-1 (+) estimularon previamente con o sin oxLDL [100 mg /ml]. B) LOX-1 de activación por LDLox promueve la angiogénesis tumoral en modelos de xenoinjertos de CaP en la membrana corioalantoidea de embriones de pollo. Microfotografía y cuantificación de los vasos sanguíneos tumorales en xenoinjertos de C4-2, C4-2 /LOX-1 (-), y las células C4-2 LOX-1 (+), incubadas previamente con o sin oxLDL [100 mg /ml], en las membranas corioalantoidea de embriones de pollo de 10 días de edad. Los datos representan las medias ± S. D. de tres experimentos independientes realizados por triplicado, y se analizó estadísticamente mediante análisis de varianza de una sola vía con el post-test de Dunnett (***
p≤0.001
, **
p≤0.01
, *
p = 0.05
).
La activación de LOX-1 por LDLox promueve la angiogénesis en xenoinjertos de células de cáncer de próstata en la membrana corioalantoidea de embriones de pollo
Para los estudios de la angiogénesis en la membrana corioalantoidea (CAM) de embriones de pollo, los clones de células de cáncer de próstata C4-2, C4-2 /LOX-1 (-), y C4-2 LOX-1 (+) se pre-incubaron con oxLDL 100 mg /ml para 2 horas. Aproximadamente 1 × 10
6 células fueron inoculados en la CAM de embriones de pollo de 10 días de edad. Cinco días después de la inoculación, los tumores se extrajeron de las CAM y se analizó el grado de vascularización del tumor. células C4-2 pre-incubadas con oxLDL mostraron un aumento significativo de la vascularización del tumor en comparación con las células no tratadas C4-2. Además, LOX-1 sobreexpresión en C4-2 /LOX-1 (+) células también mostró un aumento de la vascularización del tumor cuando las células se incubaron con o sin oxLDL en comparación con las células no tratadas C4-2. Notablemente, C4-2 /LOX-1 (-) las células tratadas con oxLDL no mostraron variaciones significativas en la vascularización del tumor, en comparación con tanto C4-2 y C4-2 /LOX-1 (-) las células no tratadas (Fig. 5B).
el
olr1
gen se sobreexpresa en bases de datos públicas de matriz de cáncer de próstata metastásico
con el objetivo de determinar si los efectos observados en la angiogénesis tumoral mediados por LDLox /LOX-1 en C4-2 células de cáncer de próstata tenían alguna relevancia clínica en los pacientes, que utiliza la base de datos NCBI gene Expression Omnibus (GEO) para determinar la expresión de
olr1
receptor en el conjunto de datos GDS2545, que tiene diferentes fases de la progresión del cáncer de próstata . Estos datos permiten el análisis comparativo de los tumores metastásicos humanos de próstata, tumores primarios de próstata y el tejido donante normal. En este contexto, la expresión de
OLR-1 se encontró
ser aumentado de manera significativa en los tumores de próstata primarios y tumores de próstata metastásico en comparación con el tejido normal de la próstata (Fig. 6).
La expresión de
olr1
en diferentes etapas de la progresión tumoral del cáncer de próstata se determinó utilizando el GDS2545 base de datos pública en la expresión genética de NCBI Omnibus (GEO). Los datos representan las medias ± S. E. de tejido humano normal donante n = 17, los tumores de próstata primarios n = 64 y metastásicos tumores de próstata n = 50, los cuales fueron analizados estadísticamente utilizando un
t
prueba (
* p = 0.05
).
Discusión
en este trabajo se demuestra, por primera vez, el papel del receptor LOX-1 y su activación mediante oxLDL, sobre la proliferación y la angiogénesis de C4- humana 2 células de cáncer de próstata. En concreto, hemos demostrado que un aumento en las concentraciones de LDLox promovió la proliferación celular y de manera significativa y proporcionalmente aumenta la expresión del VEGF marcadores pro-angiogénicos, y las metaloproteinasas de MMP-2 y MMP-9. Además, la estimulación celular de LOX-1 con oxLDL también aumentó la expresión del receptor LOX-1, generando una retroalimentación de bucle positivo de LOX-1 de expresión.
La asociación de LOX-1 y oxLDL con enfermedades , tales como disfunción endotelial, aterosclerosis, infarto agudo de miocardio, accidente cerebrovascular, diabetes, hipertensión, síndrome metabólico y obesidad, ha sido ampliamente estudiado [3], [5], [24]. La obesidad, por sí misma, también se ha asociado como un importante factor de riesgo para la aterosclerosis, la diabetes mellitus tipo 2 y el cáncer, así como otras enfermedades [25]. Los estudios clínicos sugieren una asociación entre las concentraciones séricas de LDLox alta y un mayor riesgo de desarrollar cáncer de colon [26]. Además, las concentraciones de LDLox también se han demostrado para aumentar en los pacientes obesos [27].
De acuerdo con estos hallazgos, los informes anteriores habían demostrado que la obesidad está asociada con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de próstata altamente maligno y metástasis [21 ], [28]. Además, en el Transgenic Adenocarcinoma del ratón de próstata (TRAMP) modelo de ratón, la alimentación de los ratones con una dieta hipercalórica, aumenta el grado histológico de los tumores de próstata, el número de metástasis, la masa del tumor, y el grado de vascularización, en comparación a TRAMP ratones alimentados con una dieta normal [29].
Hay una especial relevancia en la relación entre el colesterol y el cáncer de próstata, ya que los andrógenos y otras hormonas esteroides se sintetizan a partir del colesterol, y son fundamentales en el desarrollo y mantenimiento de cáncer de próstata [30]. En condiciones fisiológicas andrógenos están implicados en la adquisición de los caracteres sexuales secundarios, el crecimiento y el desarrollo normal de la próstata. Sin embargo, también se han asociado con la progresión del tumor en el cáncer de próstata [31]. Por lo tanto, muchos de los cánceres de próstata refractario a la privación de andrógenos, la absorción de colesterol aumento, que es el sustrato primario para la síntesis de andrógenos [31], [32]. A este respecto, la principal fuente de colesterol para las células tumorales es LDL, que se endocitado principalmente por los receptores de LDL (LDLR) [33], [34]. Sin embargo, consideramos que el oxidante y el microambiente tumoral pro-inflamatoria rica en ROS [35] podrían estar promoviendo la modificación de LDL por lipoperoxidación [36], evitando el reconocimiento por parte de LDLR y favoreciendo su absorción por los receptores scavenger de LDLox. De acuerdo con esto, se analizó la expresión de los receptores para las lipoproteínas de carroñeros modificados y la expresión del receptor de LDL en el conjunto de datos GDS2545, obtenidos de la base de datos pública (perfil GEO) [37]. En ello, se observó un aumento significativo en la expresión de los receptores scavenger
olr1, bufanda
y
scarb1
en tumores primarios y metástasis de cáncer de próstata, y un aumento significativo en la expresión de la
CD36
y
olr1
receptor en la metástasis del cáncer de próstata en comparación con el tejido normal de la próstata. Curiosamente, la expresión de LDLR mostró una disminución significativa en su expresión en metástasis del tumor y no se observó diferencia significativa entre los tumores de próstata primarios y tejido de la próstata normal (datos no mostrados).
Teniendo en cuenta esto, las altas concentraciones de LDL circulante en pacientes obesos con cáncer de próstata podría contribuir a la progresión del tumor a través de la activación de LOX-1 por la oxidación de LDL modificada (oxLDL) generado en el microambiente oxidante, presente en el estroma del tumor de próstata. A este respecto, hemos generado un nivel medio LDL oxidada, que debe ser representativa de la oxLDL presente en el microambiente tumoral. Nuestros resultados demuestran que la oxLDL utilizada en este estudio no tiene efecto citotóxico en cualquiera de las células de cáncer de próstata modelos C4-2 ensayadas. A este respecto, se ha informado de que oxLDL tiene un efecto diferencial citotóxico dependiendo del tipo de célula. células de cáncer de líneas K562 /AO2 (leucemia) y EC9706 (carcinoma de esófago) tratados con oxLDL presentan una mayor tasa de viabilidad de las células en comparación células de la pizca no tumorales tales como HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana) [38].
Curiosamente, se observó un aumento significativo en la proliferación celular de la C4-2, C4-2 /GFP, C4-2 /LvEmpty y C4-2 /LOX-1 (+) modelos celulares, sobre todo el intervalo de concentraciones ensayadas LDLox en comparación con las líneas de células no tratadas. Además, el modelo de células C4-2 /LOX-1 (+) mostró una proliferación mayor en comparación con los modelos de control de las células C4-2, C4-2 /GFP, y C4-2 /LvEmpty, para todas las concentraciones ensayadas. Sin embargo, se impidió el efecto proliferativo de oxLDL en el LOX 1-C4-2 /(-) modelo de células, lo que indica que este efecto está estrechamente relacionado con la activación del receptor LOX-1 por oxLDL. En este sentido, el efecto proliferativo promovido por oxLDL /LOX-1 ha sido descrita en las células musculares, células endoteliales y recientemente en el cáncer de mama células a través de rutas de activación que implican p38 (MAPK), p44 /42 MAPK y NF-kB [6 ], [39]. Sin embargo, aún no se han descrito los efectos proliferativos sobre las células de cáncer de próstata.
in vitro
estudios han demostrado que la estimulación LDLox de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) activa la expresión de la LOX -1 receptor, generando una sobreexpresión de moléculas de adhesión, proteínas inflamatorias, y las MMP-2 y MMP-9 metaloproteinasas, [8], [40], [41]. Además, las células endoteliales de aorta bovina tratada con ox-LDL promueven la formación de capilares regulada por LOX-1, y la activación de la NADPH oxidasa /MAPKinase /NF-kappa B, con un aumento en la expresión de VEGF [9], [42]. Nuestros resultados demuestran que la expresión de VEGF, y la activación de MMP-2 y MMP-9, está estrechamente mediados por LDLox /LOX-1 en la línea celular de cáncer de próstata C4-2.
También confirmar, utilizando el ensayo del anillo aórtico y el modelo de xenoinjerto de CAM de embrión de pollo, que el aumento de VEGF, MMP-2 y la expresión de MMP-9 mediada por LOX-1 /oxLDL tiene un efecto angiogénico tumoral tanto
in vivo
y
ex vivo en modelos de células de cáncer de próstata C4-2. Esto es consistente con
ex vivo
estudios anteriores, donde los factores pro-angiogénicos como la angiotensina II no indujo la formación de brotes capilares en los anillos aórticos aislados de
KO ratones
OLR-1 [10]. Del mismo modo, la ablación de la
gen
OLR-1 disminuyó notablemente la neovascularización coroidea en modelos murinos de lesión inducida por láser [43]. La señalización inducida por oxLDL /LOX-1 podría tener un papel crítico en el proceso de la angiogénesis tumoral porque la densidad de microvasos es un importante indicador de pronóstico en el cáncer de próstata, y se asocia con el estadio clínico, progresión, metástasis, y la supervivencia del cáncer de próstata [44], [45].
en conclusión, hemos demostrado una relación directa entre los factores de la obesidad, tales como LOX-1 /LDLox y la mejora de la expresión de marcadores de proliferación y pro-angiogénicos, que tienen un efecto biológico en la angiogénesis tumoral
ex vivo
y
in vivo en
C4-2 modelos de células de cáncer de próstata. Por lo tanto, sugerimos que el LOX-1 podría ser un regulador esencial en células de cáncer de próstata, con la capacidad de mejorar la angiogénesis tumoral y la metástasis hacia la malignidad en pacientes obesos.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
C4-2 humana de cáncer de próstata [46], [47] y HEK-293 FT células fueron cultivadas en RPMI 1640 y medio DMEM respectivamente, suplementado con 2 mM de L-glutamina (Hyclone), 10% fetal de suero bovino (FBS) y 1% penicilina estreptomicina (GIBCO).
Animales
ratones macho BALB /c se obtuvieron de Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Alemania) y alojados bajo ambiente controlado y estéril condiciones. Se utilizaron cuatro ratones (8-12 semanas de edad) para los experimentos.
Los huevos de
Gallus gallus domesticus
se obtuvieron de ISP (Instituto de Salud Pública, Chile), se lavaron con un 7 solución de sulfato de cobre mu M para evitar la contaminación por hongos, y se incubaron a 37,5 ° C y 80% de humedad relativa durante 10 días. Los huevos fueron volteadas periódicamente con un doble volteador automático (GQF Hova-Bator Manufacturing Co. EE.UU.) para evitar la adhesión y la ruptura de la CAM de la cáscara de los huevos. Los embriones inoculados con los modelos de células C4-2 se incubaron a 37,5 ° C, 80% de humedad y 5% de CO
2 durante 5 días.
Todos los estudios con la experimentación con animales estaban en conformidad con las directrices y las recomendaciones de la Guía del NIH para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio (edición actual) y siguieron las políticas indicadas en el Manual de Bioseguridad chilena de Conicyt (Agencia Nacional de Ciencia y Tecnología). Los protocolos experimentales fueron elaborados por los autores y aprobados por el Comité de Ética Institucional. En todos los casos, la supervisión de las autoridades veterinarias de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, Chile, estaba en el aire. Cuando se utilizaron ratones de experimentación, que fueron alojados en habitaciones individuales y una alimentación apropiada, suministro de agua y control de la salud fue proporcionado de forma permanente. Animales sacrificados fueron manejados humanamente. Fueron sometidos a anestesia inicial y la inyección de cloruro de potasio por vía intravenosa para evitar el sufrimiento.
Preparación
ox-LDL
fueron obtenidos de cuatro voluntarios, que firmaron un consentimiento por escrito muestras de sangre (20 ml). Este protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Concepción, Chile. LDL humana se aisló (1.019 a la 1,063 g /ml) a partir del plasma de la sangre de los sujetos humanos sanos por ultracentrifugación secuencial a 4 ° C. LDL se dializó frente a tampón se filtró (0,45-micras) LDL (150 mmol /L de NaCl; 0,24 mmol /l de EDTA; pH 7,4), se cambió tres veces, durante 36 horas a 4 ° C. Después de una extensa diálisis contra PBS, con 3 cambios, durante 36 horas a 4 ° C, la LDL oxidada se preparó por incubación de LDL purificado con 7 M CuSO
4 durante 3 horas a 37 ° C. La modificación de LDL se controló por espectrofotometría mediante la generación de dienos conjugados en λ 243 nm, y después una electroforesis en gel de agarosa al 1% en tampón de borato de sodio se realizó para determinar el cambio en la migración electroforética de oxLDL en comparación con LDL. El gel se tiñó con 0,25% de Coomassie Blue R-250, durante 2 horas, y se destiñó durante 4 horas usando 5% de MeOH, 7,5% HOAC, 87,5% H
2O. Las bandas de LDL y LDL-ox fueron analizados con el instrumento de Odyssey CLX (LI-COR, EEUU).
citotoxicidad evaluación
Los modelos celulares de cáncer de próstata se incubaron con 25, 50 y 100 mg /ml LDLox durante 12 horas. Después de eso, se retiró el medio, los cultivos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato, y la viabilidad celular se midió incubando los cultivos con 10 mg /ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difenil tetrazolio bromuro (MTT) a 37 ° C durante 30 min, y midiendo la absorbancia a 570 nm en células solubilizadas usando un UV-visible SPECTROstar
Nano
espectrómetro (LABTECH BMG, Alemania).
lentiviral vectores que expresan ORL-1 o shRNA contra olr1
la secuencia de LOX-1 humano se sub-clonaron en el vector lentiviral pLCW, generando la construcción pLCW-LOX-1.