Extracto
Antecedentes
La epigenética se define como cambios heredables en la expresión de genes que no se basan en los cambios en la secuencia de ADN. Modificación postraduccional de las proteínas histonas es un importante mecanismo de regulación epigenética. El PRK1 quinasa (proteína quinasa C relacionadas quinasa 1, también conocido como PKN1) fosforila la histona H3 en la treonina 11 y está implicado en la regulación de la señalización del receptor de andrógenos. Por lo tanto, se ha identificado como un objetivo nuevo fármaco pero se sabe poco acerca de los inhibidores de PRK1 y las consecuencias de su inhibición.
Metodología /Principal Encontrar
El uso de un enfoque de selección de la biblioteca enfocada, identificamos la lestaurtinib candidato clínico (también conocido como CEP-701) como un nuevo inhibidor de la PRK1. Basado en un modelo 3D generado de la quinasa PRK1 usando el homólogo de PKC-theta (proteína quinasa C theta) de proteínas como una plantilla, la interacción clave de lestaurtinib con PRK1 se analizó por medio de estudios de acoplamiento molecular. Además, se evaluaron los efectos sobre la fosforilación de treonina de la histona H3 y la expresión génica dependiente de andrógenos en células de cáncer de próstata.
Conclusiones /Importancia
lestaurtinib inhibe PRK1 muy potentemente in vitro e in vivo. Aplicado a un cultivo celular que inhibe la histona H3 fosforilación de treonina y la expresión génica dependiente de andrógenos, una característica que no se ha conocido todavía. Así, nuestros hallazgos tienen implicaciones tanto para la comprensión de la actividad clínica de lestaurtinib, así como para los inhibidores de PRK1 futuras
Visto:. J Köhler, Erlenkamp G, Eberlin A, T Rumpf, Slynko I, Metzger E, et al . (2012) lestaurtinib inhibe la fosforilación de la histona de expresión génica y dependientes de andrógenos en las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 7 (4): e34973. doi: 10.1371 /journal.pone.0034973
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Febrero 2012; Aceptado: March 10, 2012; Publicado: 20 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Köhler et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen financiación o apoyo al informe
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La epigenética se define como cambios heredables en la regulación de genes que no están determinados por alteraciones en el genoma [1]. Los procesos epigenéticos tienen claras implicaciones para la patología de la enfermedad en seres humanos [2], y por lo tanto los nuevos inhibidores de estos son de gran interés para el descubrimiento de fármacos [3]. Entre diversas modificaciones de las histonas [4], la fosforilación de las histonas no está tan bien estudiada, especialmente en relación con el descubrimiento de fármacos. La mayoría de los informes son en Aurora quinasas que están implicados más bien en el control de la mitosis [5]. Otra quinasa implicada en la mitosis que está actuando en las histonas es haspin [6], [7]. Las quinasas PKC-Betai [8] y PRK1
a (también denominado PKN1) [9] juegan un papel importante en la activación de la transcripción de genes [10] en el curso de la señalización del receptor de andrógenos y PRK1 se considera que es un objetivo prometedor para la tratamiento de cáncer de próstata. En la búsqueda de inhibidores nuevos PRK1 hemos realizado una selección de la biblioteca enfocada para identificar nuevos accesos y evaluar inhibidores de la quinasa de referencia en la comparación. Identificamos la lestaurtinib candidato clínico (también conocido como PAC-701) como un nuevo potente inhibidor de la quinasa PRK1 epigenética.
Resultados
Centrado selección de la biblioteca
Como partida punto para la búsqueda de inhibidores PRK1 nuevos, que utiliza la biblioteca Biomol quinasa y fosfatasa inhibidor (n = 84, véase la Figura S4, S5 y S6) para una evaluación inicial a 100 nM concentración umbral. Esta revisión identificó sólo el bisindolyl-maleimida (BIM) Ro318220 y la estaurosporina estructuralmente relacionados como hits (más del 40% con respecto a la unión estaurosporina a 100 nM) (ver Figura 1 y Tabla 1). Ro318220 ya era conocida para inhibir PRK1 [9]. Hemos examinado además un compuesto 200 de la biblioteca de la casa de los disponibles comercialmente y genérica inhibidores de quinasa, respectivamente. candidatos a inhibidores. Esos inhibidores de la quinasa incluidos estándar como erlotinib, lapatinib, vatalanib, SB203580 y SB216763 (véase la Figura 1), que han sido utilizados para el perfil diferentes quinasas antes. Los inhibidores de K252a y lestaurtinib y, además, SB216763 (datos de interacción no mostrados) se seleccionaron para el estudio de acoplamiento en función de su similitud estructural con la estaurosporina y Ro318220. Los análogos de estaurosporina todas muestran un modelo de unión similar. K252a inhibe trkA, VEGFR2 y MLK1 en la región de dos dígitos nM y se sabe que tiene una selectividad sobre PKC sobre 10-20fold [11]. Lestaurtinib se informó para inhibir trkA, B y C [12], JAK [13] y FLT3. Debido a la inhibición de FLT3, se estudió clínicamente en la mielofibrosis y AML [14], [15]. Lestaurtinib y K252a ambos fueron obligados por PRK1 con alta afinidad (ver Tabla 1). Lestaurtinib fue elegido para su posterior evaluación biológica en nuestro estudio debido a su estado de desarrollo avanzado y mostró una inhibición del gen andrógeno sensibles transcripción de genes.
Modelización Molecular
Un modelo de ser humano La proteína C relacionada con quinasa 1 (PRK1) se generó mediante el modelado de homología de racionalizar nuestros hallazgos de otros estudios de optimización. El modelo se basa en la similitud de PRK1 a la proteína quinasa theta C (PKC-theta) y se utilizó para estudios de acoplamiento. Dado que las estructuras cristalinas disponibles de los subtipos de PKC en complejo con inhibidores de mostrar todos la conformación quinasa activa, el modelo PRK1 representa también la conformación activa con la clásica DFG-en motivo (Figura 2) [16]. Los 84 compuestos de la biblioteca de inhibidor de la quinasa Biomol, que se ensayaron en el ensayo in-vitro, se acopló en el bolsillo de unión a ATP de PRK1. Se han utilizado tres métodos de conexión diferentes (GOLD [17], se deslizan [18] y Paradocks [19]) y cinco funciones diferentes de puntuación (ChemScore, GoldScore, GlideScore, Paradocks p-Score y la puntuación de AMBER GBSA [20], [21]) . En total, 63 compuestos podrían acoplarse con éxito en el bolsillo de unión del ATP. En general, los diferentes métodos de acoplamiento dieron resultados similares, incluso si se ha encontrado el ranking de los compuestos a ser diferente (Tabla S1). Los dos inhibidores activos de la colección de compuestos Biomol, estaurosporina y Ro318220, eran mejor clasificado por algunas de las funciones de puntuación. En general, en estudios de anclaje y cribado virtual una mejor discriminación entre los agentes activos y señuelos se observa mediante el uso de una puntuación de consenso basada en una variedad de diferentes métodos de puntuación [22], [23]. En el presente estudio, también se calculó una puntuación de consenso utilizando las cinco funciones de puntuación normalizado Chemscore, Goldscore, Glidescore, Paradocks p-score y la puntuación GBSA. El uso de la puntuación de consenso, una clara discriminación entre la estaurosporina inhibidores altamente activa (Puntuación 9,23) y Ro318220 (Puntuación 9,51) y los compuestos inactivos (incluyendo los inhibidores de la quinasa inactivos que se muestran en la Figura 1) se podría obtener. La única molécula que dio una alta puntuación similar fue el relacionado bisindolylmaleimide derivado 31 (puntuación de 8,84, Tabla S1, Figura S5) que no mostró ninguna actividad in vitro por debajo de 100 nM (datos no mostrados).
se muestra la superficie molecular del bolsillo de unión. Además de los enlaces de hidrógeno con la región bisagra, el grupo amino protonado de estaurosporina dona enlaces de hidrógeno (que se muestra como líneas punteadas de color naranja) para Asp744 y una molécula de agua conservada (en rojo).
La disposición de acoplamiento de estaurosporina en el sitio activo de PRK1 muestra que el ligando está totalmente enterrado en el bolsillo de unión a ATP (Figura 2). Lo más importante, la lactama y grupos maleimida de estaurosporina y Ro318220, respectivamente, forman dos enlaces de hidrógeno a Glu696 y Ser698, que son parte de la región bisagra de PRK1 (Figura 3A y 3D). interacciones de Van-der-Waals se observan con la Met695 residuo gatekeeper, así como con Val629, Phe626, Leu747 y Phe904, respectivamente. Además, se pueden observar los enlaces de hidrógeno entre el grupo amino protonado de estaurosporina, así como el grupo de tiourea de Ro318220 y Asp744. El grupo amino de estaurosporina también está implicado en un enlace de hidrógeno con una molécula de agua conservada y de la columna vertebral de CO Asp744.
interacciones comunes de los inhibidores son enlaces de hidrógeno que implican Glu696 y Ser698 de la región bisagra, y Van- interacciones der-Waals con el controlador de acceso residuo Met695, así como con Val629, Phe626, Leu747 y Phe904. Además, algunos de los inhibidores interactúan con Asp744, Asn745 y una molécula de agua conservada (esfera roja) cerca del Mg
2 + sitio de la quinasa de unión. La columna vertebral se muestra como una cinta púrpura. Solamente se muestran los aminoácidos correspondientes. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas de color naranja.
El análisis de las posturas de conexión de K252a y lestaurtinib mostró que ambos compuestos interactúan de la misma manera con el ATP vinculante bolsillos como estaurosporina (Figura 3B y 3C ). Además de la interacción con la región bisagra, los sustituyentes polares en el sistema de anillo de tetrahidrofurano interactuar con una molécula de agua conservada con destino a Asp744 y Asn745.
Celular Exámenes
A continuación, analizó el efecto de lestaurtinib en células de cáncer de próstata LNCaP sensibles a los andrógenos (véase la Figura 4) [24]. Un efecto sobre la señalización mediada por receptor de andrógenos se midió utilizando la cuantificación de la expresión de mRNA de varios genes diana del receptor de andrógenos conocido. lestaurtinib bloquea la expresión de la proteasa transmembrana, serina 2 (
TMPRSS2)
[25], similar a la insulina factor de crecimiento 1 (
IGF1-R27)
[25], los receptores de quimioquinas CXC 4 (
CXCR429)
[26], proteína Homeobox Nkx-3.1 (
Nkx3.1)
[27], germen de quinasa asociada a la célula masculina
(MAK30)
[28] , fibrosarcoma músculo-oncogén homólogo (
MAF)
[
29
], subfamilia de receptores nucleares 4, grupo a, miembro 1 (
N4A1)
[29], gene regulada en cáncer de mama I
(GREB1)
[30] y la proteína de unión FK506 5 (
FKBP5)
[31] a las 5 M pero no reduce la expresión de la gliceraldehído-3-fosfato independiente de los andrógenos deshidrogenasa (
GAPDH)
de genes [31]. En la misma gama de concentración, lestaurtinib causó una hypophosphorylation en la histona H3 treonina 11 (Figura S7).
La expresión de los genes diana del receptor de andrógenos
TMPRSS2
,
IGF1-R
,
Nkx3.1
,
CXCR4
,
MAK
,
MAF
,
N4A1
,
GREB1
y
FKBP5
medido por QRT-PCR en andrógenos (R1881) estimularon las células de cáncer de próstata LNCaP se bajan por el tratamiento con lestaurtinib (concentración final 5 mM). La expresión de mRNA de la
GAPDH
gen se utilizó como control. Las barras representan la media ± SD (n = 5). Valor de p: ns = no significativo; * = & Lt; 0,05; ** & Lt; 0,01; ***. & Lt; 0,001
Discusión
Modificaciones de las histonas se han convertido en un foco de los esfuerzos de descubrimiento de fármacos. Los inhibidores de las enzimas que establecen estas modificaciones también son herramientas valiosas para investigar las vías de señalización. Identificamos la lestaurtinib candidato clínico como un inhibidor de la quinasa PRK1 que afecta a la regulación epigenética y la señalización del receptor de andrógenos. Este nuevo modo de acción de lestaurtinib no se ha conocido hasta ahora y puede ser importante para entender su actividad en entornos clínicos. Las similitudes estructurales de lestaurtinib en comparación con estaurosporina hacen posible que otras quinasas que PRK1 pueden contribuir a los efectos reguladores de genes observada en células LNCaP. Sin embargo, es de gran importancia que lestaurtinib tiene un efecto sobre las modificaciones de histonas epigenéticos y reduce la expresión de genes dependiente de andrógenos significativamente en células de cáncer de próstata. Este hecho debe ser tenido en cuenta para futuras evaluaciones en el ámbito clínico.
Además de los efectos in vivo de lestaurtinib, la identificación de lestaurtinib y K252a como inhibidores PRK1 novedosos y la falta de inhibición de los inhibidores de quinasa establecidos con tales como andamios, anilinoquinazolinas anilinophthalazines o diarilimidazoles proporciona información valiosa para el diseño de nuevos y más selectivos inhibidores PRK1 como agentes terapéuticos potenciales para los cánceres dependientes de andrógenos.
Materiales y Métodos
Ensayo de quinasa
inhibidores de la quinasa se adquirieron de Sigma-Aldrich (lestaurtinib) y Biomol (Ro318220) y se utilizaron tal como se obtiene. La pureza era & gt; 93% (w /w) en todos los casos como se indica por el proveedor. de cribado de inhibidores se llevó a cabo con el LanthaScreen ™ Eu quinasa Encuadernación Kit de ensayo (Invitrogen) con las concentraciones de ensayo final de 5 nM para PRK1 (Proqinase, Freiburg), 2 nM LanthaScreen Eu-anti-GST de anticuerpos (Invitrogen) y 10 nM de quinasa trazador 236 (Invitrogen). El ensayo se realizó en placas de microtitulación de 384 pocillos (Perkin Elmer, Rodgau). El volumen final del ensayo fue de 15 mL. La detección se realizó con EnVision 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer, Rodgau, Excitación: 340 nm, 1
er de emisión: 665 nm, 2
ª Emisión: 615 nm, con retardo de tiempo 100 mu s, tiempo de integración de 200 mu s). La biblioteca de inhibidor de la quinasa se adquirió de Biomol (tamaño académico, n = 84 - ex CAT#2831A, figura S4, S5, S6). IC
50 determinaciones se realizaron tres veces independientes, cada uno por triplicado.
Métodos Computacionales
Al0l cálculos se realizaron en un Pentium IV 2.2 GHz clúster basado en Linux. Dado que la estructura cristalina de la PRK1 quinasa humana (Uniprot entrada Q16512) no se conoce, se generó un modelo de homología. Una búsqueda BLASTP [32] se llevó a cabo para la secuencia de aminoácidos PRK1 humano. La mayor similitud se encontró para el PKCtheta quinasa relacionada. La identidad de secuencia global entre la secuencia de PRK1 humano y la secuencia derivada de PKC-theta es 49% con sólo pequeños huecos o inserciones en la región alineada. El alineamiento de secuencias se realizó con ClustalW [33] (Figura S1). El modelo se ha generado con el modelador programa usando las coordenadas de la estructura de rayos X de PKC-theta 2jed (Resolución 2.32 a) en la conformación activa. La superposición del modelo de PRK1 y la estructura-PKC theta de rayos X dio un valor de RMSD de 0,73 Å para los átomos de la cadena principal que ilustran la alta similitud estructural de ambas quinasas. La calidad estereoquímica del modelo PRK1 resultante se analizó mediante el programa PROCHECK [34]. Se asignaron átomos de hidrógeno y cargas parciales ámbar. El modelo fue usando el campo de fuerza de AMBER [35] minimizada energía. El refinamiento dio lugar a un modelo con una excelente calidad estereoquímica con el 90,1% de los valores de los ángulos phi y psi en las regiones más favorecidas, y el 8,5% en las regiones, además permitidos (Figura S2). No deja residuos en el modelo se encuentra en la región no permitida.
ligando de acoplamiento
Se han utilizado tres programas diferentes de conexión (GOLD 4.1 [17], se deslizan [18] y [19 Paradocks]) a acoplar todas las moléculas en el sitio de unión de ATP PRK1. Para todos acoplamiento se ejecuta se utilizaron los ajustes por defecto del programa. El sitio de unión para PRK1 se definió en Glu696 con un radio de 15 Å que cubre el bolsillo de unión ATP. Una molécula de agua conservada se observa en las estructuras de rayos X de PKCbeta y PKCtheta se considera parte de la proteína. Goldscore, Chemscore, Glidescore, Paradocks p-Score y ámbar GBSA [20], [35] puntuación fueron elegidos como funciones de aptitud. Para cada molécula, se llevaron a cabo 30 carreras de acoplamiento. Las soluciones resultantes se agruparon sobre la base de los valores de RMSD átomo pesado (1 A). En primer lugar, hemos probado si los programas de conexión son capaces de reproducir el modo de unión de los ligandos unidos NVP-XAA228, Biomol 33 (Ro318220), y estaurosporina como se observa en las estructuras de rayos X de PKC-theta y PKC-beta, respectivamente ( AP códigos 2jed.pdb, 1xjd.pdb [36] y 1i0e.pdb [37]). Se obtuvo una precisión más alta usando el programa GOLD y Goldscore como función de aptitud. Los valores RMSD entre la solución de acoplamiento Goldscore mejor clasificado y la estructura cristalina de los inhibidores son 0,78 Å, 0,71 Å y 0,49 Å (átomos pesados), respectivamente, lo que demuestra la capacidad de uso de los programas de conexión aplicados para la reproducción de las estructuras determinadas experimentalmente de la quinasa inhibidor de los complejos.
simulaciones de dinámica molecular
La estabilidad de los complejos PRK1-inhibidor derivado fue examinado por medio de simulaciones de dinámica molecular (MD). La estaurosporina inhibidor más activo fue utilizado para esta simulación. simulaciones MD se llevaron a cabo usando ÁMBAR 10 y el campo de AMBER 1999 fuerza [38], [39]. Los parámetros de campos de fuerzas de ligando fueron tomadas del campo de fuerza ámbar general (Gaff), mientras que AM1 ESP cargas parciales atómicas fueron asignados al inhibidor. Los complejos se empaparon en una caja de moléculas de agua TIP3P con un margen de 10 Å. Antes de las simulaciones MD gratis, a dos pasos de la relajación se llevaron a cabo; en el primer paso, hemos mantenido la proteína fijo con una restricción de 500 kcal mol
-1
-1. En el segundo paso, las estructuras de inhibidor se relajaron durante 0,5 ps, durante el cual los átomos de la proteína se impidió a los rayos X se coordina con una constante de fuerza 500 kcal mol
-1
-1. En el paso final, todas las restricciones fueron retirados y los complejos se relajaron durante 1 ps. La temperatura del sistema relajado, entonces se equilibró a 300 K hasta 20 ps de MD utilizando 2 fs pasos de tiempo. Un límite periódico volumen constante se fijó para equilibrar la temperatura del sistema por la dinámica Langevin [40] utilizando una frecuencia de colisión de 10 ps
-1 y un límite de velocidad de 5 unidades de temperatura. Durante la rutina de equilibrado de la temperatura, el complejo en el cuadro de disolvente fue restringido a las coordenadas iniciales con una fuerza constante débil de 10 mol kcal
-1 bis
-1. Las coordenadas finales de la rutina de equilibrado de la temperatura (después de 20 ps) se utilizaron luego para completar una rutina de dinámica molecular 1 ns utilizando 2 fs pasos de tiempo, durante el cual se mantuvo la temperatura a 300 K por la dinámica Langevin utilizando una frecuencia de colisión de 1 ps
-1 y un límite de velocidad de 20 unidades de temperatura. La presión del sistema solvatada se equilibró a 1 bar a una cierta densidad en un límite periódicas de presión constante por un método de escala de presión isotrópica que emplea un tiempo de relajación de presión de 2 ps. El tiempo de paso de las simulaciones MD libres fue de 2 fs con un punto de corte de 9 Å para la interacción no unido, y agitar [41] se utilizó para mantener todos los enlaces relacionados con átomos de hidrógeno rígida. interacciones electrostáticas se calcularon utilizando el método de partículas de malla Ewald [42]. La simulación MD del complejo PRK1-estaurosporina se realizó en total de 10 ns. La trama RMSD se muestra en la Figura S3.
Base de datos
Las estructuras 3D de los compuestos Biomol (figura S4, S5, S6) se generaron usando el programa Omega (OpenEye Software). Todos los posibles isómeros y tautómeros se generaron, que resultó en 265 estructuras 3D. Todos los isómeros generados se utilizaron para el estudio de acoplamiento.
Amber GBSA que alcanzaron el
Las posturas fueron atracados usando el campo de fuerza ámbar y el modelo continuo GBSA [21] minimizada energía. Por cada molécula se selecciona la mejor pose de puntuación para la comparación con los datos biológicos. La minimización se realizó utilizando una combinación de descenso más agudo y el algoritmo de gradiente conjugado con una raíz cuadrada media de gradiente en 0.001 kcal /mol. cargos AM1-BCC fueron asignados a los inhibidores, y el campo de fuerza Amber99 se aplicó para la proteína. El punto de corte no trabada se fijó en 16 Å. Todos los átomos pesados de la proteína fueron atados con una constante de fuerza de 100 kcal /mol, mientras que los átomos de inhibidor se relajaron durante el proceso de minimización de la energía. La energía libre de unión Δ
G
se calcula como: donde Δ
E
MM es la diferencia de energía entre el complejo y la suma de las energías para el ligando libre y proteína libre , Δ
G
solv es la diferencia en la energía GBSA solvatación del complejo y la suma de las energías de solvatación para el ligando libre y proteína libre, y Δ
G
SA es la diferencia en la energía de superficie del complejo y la suma de las energías de superficie para el ligando libre y proteína libre.
Análisis de RT-qPCR
Efectos sobre los genes diana del receptor de andrógenos eran determina usando PCR en tiempo real cuantitativa. células LNCaP se lavaron una vez con PBS y después en ayunas durante 24 horas en RPMI1640 fenol-libre de rojo suplementado con suero de ternera fetal de doble despojado 0,5% (dsFCS). Las células fueron tratadas o no con lestaurtinib (concentración final 5 mM) como se indica. Si las células no se trataron con lestaurtinib, DMSO se añadió como un vehículo. 10 minutos después de la adición de lestaurtinib o el vehículo, las células fueron tratadas durante la noche con o sin R1881 (10
-9 M) como se indica. ARN tratado con ADNasa I, aislado utilizando Trizol (Invitrogen), se utilizó para la transcripción inversa. PCR cuantitativa se realizó en un LightCycler 480 (Roche). La formación de producto se detectó mediante la incorporación de verde SYBR I utilizando ROX como referencia pasiva (ABgene). Para QRT-PCR, se utilizaron los siguientes cebadores:
TMPRSS2
[25] 5'-TCACACCAGCCATGATCTGT-3 'y 5'-CTGTCACCCTGGCAAGAATC-3';
IGF1-R
[25] 5'-CTGTATGCCTCTGTGAACC-3 'y 5'-TAGACCATCCCAAACGAC-3';
Nkx3.1
[27] 5'-AGAACGACCAGCTGAGCAC-3 'y 5'-AAGACCCCAAGTGCCTTTCT-3';
CXCR4
[26] 5'-CTGTGAGCAGAGGGTCCAG-3 'y 5'-ATGAATGTCCACCTCGCTTT-3';
MAK
[28] 5'-TGGACTTGCAAGAGAATTAAGGT-3 'y 5'-CTTCAGGGGCACGATACC-3';
MAF
[29] 5'-AGCGGCTTCCGAGAAAAC-3 'y 5'-GCGAGTGGGCTCAGTTATG-3';
N4A1
[29] 5'-ACAGCTTGCTTGTCGATGTC-3 'y 5'-GGTTCTGCAGCTCCTCCAC-3';
GREB1
[30] 5'-AAGCTGAGCAGCACAGACAA-3 'y 5'-GGCTTCTCTTCTCCGAGGTAG-3';
FKBP5
[31] 5'-TTTTTGAGATTGAGCTCCTTGA-3 'y 5'-TTGTGTTCACCTTTGCCAAC-3';
GAPDH
[31] 5'-GAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3 'y 5'-GTTCACACCCATGACGAACA-3'. Las barras representan la media ± SD (n = 5). Valor de p: ns = no significativo; * = & Lt; 0,05; ** & Lt; 0,01; *** & Lt;. 0.001
Western Blot Analysis
células de adenocarcinoma de próstata humano LNCaP se cultivaron en medio RPMI1640 (PAA) que contenía suero bovino fetal (PAA) 10% (v /v), penicilina (PAA) 1% (v /v), estreptomicina (PAA) 1% (v /v), L-glutamina (PAA) 1% (v /v) a 37 ° C y 5% de CO
2. 2,5 * 10
6 células se sembraron en placas de cultivo de tejidos (10 cm) y se incubaron en medio RPMI 1640 (PAA) que contiene carbón despojado de suero de ternero fetal (PAA) 10% (v /v), penicilina (PAA) 1% ( v /v), estreptomicina (PAA) 1% (v /v), L-glutamina (PAA) 1% (v /v). 24 h después de la siembra lestaurtinib o Ro318220 (concentración final en cada caso 4,5 mM) disuelto en medio de crecimiento ((v /v) de carbón vegetal despojado de suero bovino 10% (v /v), penicilina 1%, estreptomicina 1% (v /v) , L-glutamina 1% (v /v), DMSO 1% (v /v), dihydrotestesterone 0,1 nM) se añadieron y se incubaron durante 18 h. células LNCaP incubadas con DMSO (1% (v /v)) se utilizaron como control. Después del tratamiento inhibidor, las células se lavaron una vez con PBS enfriado en hielo, se lisaron con núcleos tampón de aislamiento (sacarosa 250 mM, Tris-HCl 20 mM, NaCl (v /v) 150 mM, IGEPAL-CA 630 0,1%, CaCl
2 0,2 mM, MgCl
2 1,5 mM, DTT 1 mM, pepstatina 1 mM, inhibidor de proteasa Cocktail Mix (Sigma), PhosStop® (Roche), pH 8,0). Las histonas se extrajeron ácido (H
2SO
4 0,4 N, DTT 1 mM, pepstatina 1 mM, inhibidor de proteasa Cocktail Mix (Sigma), PhosStop® (Roche)) durante la noche.
Las concentraciones de proteína de extractos de las histonas se determinaron utilizando BCA ensayo de proteínas (Pierce). 5 g de proteínas se separaron por electroforesis en SDS-gel (15% gel de poliacrilamida) y se transfirieron a una membrana de PVDF Roti®-(Roth). La membrana se bloqueó con leche seca no grasa (Roth, 5% (w /v), TBS, Tween 20 0,1% (v /v)) y se sondaron con anti-H3T11ph (Active Motif) 1:1000 y anti- H3 (Upstate) 1:5000 como control de carga. Canon CanoScan Lide 50 se utilizó para adquirir la imagen de la mancha y Adobe Photoshop 5.0 se utilizó para procesar la imagen.
Apoyo a la Información
Figura S1.
alineación de secuencias entre PKC-theta (Sbjct) y PRK1 (consulta).
doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s001 gratis (TIFF)
figura S2. El análisis
PROCHECK.
doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s002 gratis (TIFF)
Figura S3. Parcela en RMSD de la simulación MD de la PRK1-estaurosporina compleja usando AMBER10. La línea gris representa la trama RMSD para la proteína PRK1 Cα-átomos, mientras que la línea de negro muestra la fluctuación de la estructura inhibidor
doi:. 10.1371 /journal.pone.0034973.s003 gratis (TIFF)
Figura S4.
Los compuestos de la biblioteca Biomol, compuestos 1-30.
doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s004 gratis (TIFF)
Figura S5.
Los compuestos de la biblioteca Biomol, compuestos 31-60.
doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s005 gratis (TIFF)
Figura S6.
Los compuestos de la biblioteca Biomol, compuestos 61-84.
doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s006 gratis (TIFF)
Figura S7.
Efectos de lestaurtinib y Ro318220 en la fosforilación de H3T11 en las células LNCaP después de 18 h.
doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s007 gratis (TIFF)
Tabla S1.
valores de puntuación obtenidos para 63 compuestos Biomol atracados y siete más del inhibidor de quinasa probado.
doi: 10.1371 /journal.pone.0034973.s008 gratis (DOC)