Extracto
El cáncer de pulmón es una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo, con más de un millón de muertes al año. El mal pronóstico se debe a su alta agresividad y su pronta metástasis. Aunque los mecanismos exactos son aún desconocidos, el proceso de transición epitelial a mesenquimal (EMT) parece estar implicado en estos procesos neoplásicos. Ya hemos demostrado que los niveles séricos de CCL18, una quimioquina específica primate, son muy elevados en pacientes con cáncer de pulmón y se correlacionan con su tiempo de supervivencia de los pacientes con adenocarcinoma de pulmón. Por lo tanto, la hipótesis de que CCL18 puede estar directamente involucrado en los procesos patológicos del cáncer de pulmón, por ejemplo, EMT. Investigamos el efecto de CCL18 en A549, una línea celular de adenocarcinoma de pulmón, en otras funciones celulares como la proliferación, quimiotaxis, la invasión, la quimiorresistencia y proliferación EMT y. La exposición de células de cáncer de pulmón A549 a CCL18 en varias concentraciones disminuye el marcador epitelial E-cadherina, mientras FSP-1, un marcador de los aumentos mesenquimales fenotipo. En consecuencia, CCL18 induce el regulador transcripcional EMT SNAIL1 de una manera dependiente de la dosis. Por el contrario, una concentración creciente CCL18 se asoció con una disminución de la tasa de proliferación celular. Además, CCL18 induce la quimiotaxis de estas células y el aumento de su quimiorresistencia. Por lo tanto, CCL18 puede ser una diana terapéutica interesante para el NSCLC
Visto:. Ploenes T, B Scholtes, Krohn A, Burger M, Passlick B, Müller-Quernheim J, et al. (2013) de quimiocinas CC ligando induce 18 epitelial a mesenquimal transición en células de cáncer de pulmón A549 y eleva el potencial invasor. PLoS ONE 8 (1): e53068. doi: 10.1371 /journal.pone.0053068
Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Centro Médico Hospital Infantil de Cincinnati, Estados Unidos de América
Recibido: 25 Junio, 2012; Aceptado: 28 Noviembre 2012; Publicado: 18 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Ploenes et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Hay no hay fuentes de corriente externas de financiación para este estudio. T. P. es un beneficiario de una beca de la Universidad de Friburgo Albert-Ludwig (Stiftung Mattern). Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses. J.M.Q. y G.Z. han solicitado una patente sobre CCL18 y CCL18R como biomarcadores y dianas terapéuticas (pendiente de patente). G.Z. es un miembro de PLOS ONE Consejo Editorial. No hay más patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
Metástasis tumoral es un evento complejo que implica varias etapas que incluyen la separación de las células cancerosas de la compacta tumor primario, la migración en vasos, y la invasión de tejidos y la formación de un nódulo tumoral secundario. Aunque todavía en debate, transición epitelio mesénquima (EMT) parece ser uno de los eventos clave en el progreso local y la metástasis de tumores malignos epiteliales [1], [2]. EMT es un evento de múltiples etapas complejo, que cambia no sólo la morfología celular, sino también permite a las células para obtener nuevas e importantes funciones como la expresión de nuevas moléculas o la migración y la invasión. Además de los cambios morfológicos, el proceso de EMT se caracteriza por las diferencias en la transcripción y expresión de genes epiteliales y mesenquimales. Uno de los marcadores moleculares más importantes de las células epiteliales es la molécula de adhesión epitelial E-cadherina, que median las interacciones célula-célula [3]. El proceso de la EMT se asocia con una pérdida de E-cadherina, que se correlaciona positivamente con el estadio del tumor y la supervivencia de los pobres en muchos tumores epiteliales [4] - [6]. Junto a la pérdida de marcadores epiteliales la expresión de marcadores mesenquimales como FSP-1 también es un paso importante en el proceso de EMT [7]. FSP-1, también llamado S100A4, se correlaciona con el potencial metastásico en los tumores y algunos autores demostraron que un alto nivel de FSP-1 se asocia con un mal pronóstico en varios tipos de cáncer [8] - [10]. EMT está regulado por varios factores de transcripción [11]. Uno de los más importantes es SNAIL1, que también actúa como represor E-cadherina. Se ha demostrado que la expresión de alto SNAIL1 está asociada con mal pronóstico en cáncer de pulmón [12]. EMT puede ser inducida por varios factores de crecimiento y citoquinas, lo más importante por TGFbeta sino también por EGF, FGF, HGF y otros [13]. La mayoría de estos factores están presentes en el ambiente del tumor y producido por la propia células tumorales o rodeando componentes celulares. El microambiente de tumores sólidos es una mezcla compleja de factores celulares y no celulares, en los que los macrófagos asociados al tumor (TAM) representa hasta el 50% de la masa del tumor [14]. TAM se activan alternativamente macrófagos secretan un patrón específico de varias citocinas promotores de tumores y factores de crecimiento. Una de estas citoquinas es el humano específico de quimiocinas CC ligando 18 (CCL18), que está muy presente en el tejido pulmonar e implicado en varios procesos patológicos de las enfermedades malignas o la fibrosis [15] - [20]. Ya hemos demostrado que CCL18 es muy elevado en los sueros de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico y se correlaciona con el estadio del tumor y la supervivencia global en el subgrupo de adenocarcinoma [21], [22]. La media de nivel sérico CCL18 de los pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas fue de 150 (857) ng /ml vs. 32 (61) ng /ml en el grupo de control sano [22]. Nosotros, por lo tanto, la hipótesis de que CCL18 es un inductor de EMT en células de adenocarcinoma humano de pulmón y aumenta el potencial metastásico.
Materiales y Métodos
Reactivos
recombinante humana TGFbeta1 fue adquirido de R & amp; D (R & amp; D Systems, Wiesbaden, RFA), CCL18 humana recombinante a partir de ImmunoTools, Friesoyte, Alemania, los anticuerpos policlonales de conejo contra FSP-1 humana y SNAIL1 humano y un anticuerpo monoclonal de ratón contra la tubulina humano fueron adquiridos de Abcam (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y un anticuerpo policlonal de conejo contra cadherina e humana fue de upstate (norte del estado, Billerica, EE.UU.).
experimentos de cultivo celular
adenocarcinoma línea celular A549 humana (ATCC , CCL-185) se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogene, Carlsbad, EE.UU.) con 10% de suero bovino fetal (PAA, Pasching, Austria), 100 mg /ml de estreptomicina y 100 unidades /ml de penicilina (Invitrogen) a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera. Los cultivos de células se recogieron a 80% de confluencia 24 horas antes de la estimulación, se contaron y sembraron en placas de seis pocillos a una densidad de 30.000 células por ml. Las células se incubaron con CCL18 en diversas concentraciones (100 pg /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, 100 ng /ml) durante 24 horas o 72 horas en DMEM libre de suero. TGFbeta (2 ng /ml,) se utilizó como control positivo.
Transcripción inversa PCR (RT-PCR)
El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen). La transcripción inversa se realizó usando Omniscript RT Kit (Qiagene, Düsseldorf, Alemania). primers específicos para SNAIL1 humana, FSP-1, E-cadherina y GAPDH fueron diseñados utilizando el software AmplifX (http://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/AmplifX-Home-page) utilizando las bases de datos GenBank NLM (Centro Nacional de Biotecnología información; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/). Adhesión números de código de las secuencias de nucleótidos utilizadas para generar los cebadores respectivos y las secuencias de los cebadores se enumeran en la tabla 1.
Todos los cebadores se intrón-que abarca y sintetizados por Biomers (Biomers.net, Ulm, FRG ). PCR en tiempo real se realizó utilizando iQ SYBR Green Supermix, iCycler termociclador, y software iCycler iQ 3.0 (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, FRG) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se utilizó el análisis la curva de fusión para controlar la especificidad de los productos de amplificación. No se observó amplificación de productos no específicos en cualquiera de las reacciones. Un valor de ciclo umbral (Ct) se calculó y se utiliza para calcular el nivel relativo de ARNm específico en las muestras por la siguiente fórmula:
Western Blot
Las células se lavaron tres veces con hielo frío PBS y raspado de la parte inferior. Las células se lisaron con tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, EGTA 2 mM, 0,1% Triton-X) que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa. La concentración total de proteína se midió utilizando kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Scientific, Waltham, MA) con albúmina de suero bovino como estándar. Lisados de células enteras se hirvieron a 93 ° C durante 5 minutos en volúmenes iguales de tampón de carga (M Tris-HCl 0,5 pH 6,8, 2% SDS, 0, de bromofenol azul 05%, 20% de 2-mercaptoetanol, 10% de glicerol ).
Todas las muestras se sometieron a 12% de sodio dodecil sulfato-PAGE, separados por electroforesis y transferidos a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Después de bloquear durante 2 h en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 5% de leche seca no grasa, las membranas se incubaron con anticuerpo primario diluido 1:200 (FSP-1), 1:500 (E-cadherina) o 1: 3000 (SNAIL1) con TBS que contenía 5% de leche seca no grasa a 4 ° C durante la noche. La visualización se realizó mediante anticuerpos secundarios apropiados marcados con IRDye 800CW o IRDye 700CW (Li-COR Bioscience, Bad Homburg, Alemania) diluido 1:10 000-1:20000 durante 2 hy se escanea utilizando el sistema Odyssey (Li-COR Bioscience, Bad Homburg , FRG) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Ensayo de quimiotaxis
quimiotaxis los ensayos se realizaron usando una cámara de quimiotaxis de 10 pocillos (NeuroProbe, Gaithersburg, EE.UU.). Los pocillos de fondo se llenaron con 400 l de DMEM que contiene CCL18 en concentraciones de 100 pg /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml y 100 ng /ml (control: TGFbeta 2 ng /ml). Un filtro de policarbonato libre de polivinilpirrolidona 12 micras de poro de diámetro (NeuroProbe, Gaithersburg, EE.UU.) se colocó en la placa inferior. Se montaron a continuación, una junta de silicona y la placa superior con 12 agujeros, formando los pocillos superiores. 2 × 10
se añadieron 4 células en un volumen de 285 l. En experimentos paralelos, DMEM sin quimioquinas se cargó en los pocillos de fondo como un control negativo. También se realizó un segundo control negativo con quimiocina de la misma concentración en el superior y el inferior así. Después de 24 horas de incubación a 37 ° C y 5% CO2, se retiró la lámina de filtro, y las células no migradas fueron borradas desde el lado superior del filtro. El filtro se tiñeron utilizando cristal violeta (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE.UU.) y se fija en laca transparente. Después de este 9 de alta potencia campos por filtro se contaron con un aumento de 200 veces utilizando un microscopio Zeiss.
Invasion Ensayo
La capacidad de las células para migrar a través de una matriz de membrana basal Matrigel se midió utilizando la invasión celular Assay Kit (Chemicon International, Temecula CA) con 8 micras de tamaño de poro de membrana de policarbonato. Después de la rehidratación de los geles durante 2 horas, 1 × 10
5 células en DMEM libre de suero se aplicaron a la cámara superior, mientras que la cámara inferior contenía DMEM libre de suero o DMEM libre de suero suplementado con CCL18 en varias concentraciones o TGFbeta como control. Después de la incubación a 37 ° C durante 24 horas, todas las células del lado de la cámara superior se retiraron con un hisopo de algodón y se retiró la membrana y las células invasivas se tiñeron utilizando violeta cristal. El análisis se realizó mediante el recuento 9 campos de alta potencia por filtro con un aumento de 200 veces utilizando un microscopio Olympus (Olympus, Tokio, JPN).
quimiorresistencia Ensayo
Para medir la influencia de CCL18 en quimiorresistencia de las células tumorales, las células A549 se cultivaron en una placa de 6 pocillos y se cultivaron hasta 80% de confluencia. Las células se cultivaron durante 24 y 72 h con o sin CCL18 en concentraciones como se indica. Posteriormente, se añadió una serie de dilución de cisplatino que van desde 0,4 a 25 g /ml durante 72 horas adicionales. Al final del período de ensayo, se midieron las células vivas utilizando MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio bromuro] ensayo. El medio se cambió y se añadió solución de MTT (5 mg /ml en solución salina tamponada con fosfato /pocillo) durante 4 h y el formazán generado se solubilizó en isopropanol y se mide espectrofotométricamente a 563 nm. La densidad óptica recuperado de las células no tratadas se fijó 100% y se utiliza para calcular los porcentajes de células viables en los cultivos tratados.
ensayo de BRDU -Proliferation
Se midió la síntesis de ADN utilizando un bromodesoxiuridina (BrdU) Kit proliferación celular (Calbiochem, Darmstadt, FRG). solución de etiquetado BrdU se añadió a las células en combinación con los diferentes tratamientos y se incubó durante 24 h. Después de eliminar el medio de cultivo, las células se fijaron, se permeabilizaron y se desnaturalizó el ADN a través de microondas. Se añadió anticuerpo anti-BrdU durante una hora antes de la adición de ratón conjugado IgG-peroxidasa durante 20 minutos. La señal fue desarrollado con solución de tetrametilbencidina en la oscuridad. Se midió la absorbancia utilizando un lector de placas espectrofotométrico a 450 nm con una longitud de onda de referencia a 595 nm.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo mediante el uso de Statview (SAS Institute, Cary, NC). Los valores se muestran como media ± desviación estándar de al menos de un mínimo de tres experimentos llevados a cabo de forma independiente. Dosis-dependencias se calcularon mediante la prueba de Friedman seguido de comparaciones pareadas utilizando el Test de Wilcoxon.
Resultados
Cambio de Morfología Celular
Inicialmente, A549 reveló una morfología epitelial típica con paralelepípedo contactos célula-célula apretados (fig. 1A). El tratamiento de las células con CCL18 durante 24 horas inducidas marcados cambios en la morfología celular (Fig. 1C y D). Las células cambian su morfología de paralelepípedo o un triángulo con forma de huso en forma; extrusiones celulares prolongados desarrollados y el contacto célula-célula eran menos intensos. Estos cambios pueden ser observados durante un intervalo de dosis de 1 a 100 ng /ml (Fig. 1C). Como era de esperar, la estimulación con 2 ng /ml de TGFbeta durante 24 horas indujo también un husillo-forma, fenotipo similar a fibroblastos (Fig. 1B). Por lo tanto, CCL18 y TGFbeta inducen cambios morfológicos compatibles con EMT
Los cambios morfológicos en las células tratadas con CCL18 y TGFbeta:. A549 células no tratadas muestran la morfología epitelial típica con estrechos celulares celulares contactos, que están marcadas por las flechas blancas ( UN). Después del tratamiento con 2 ng /ml células -β cambiaron el fenotipo de una morfología más mesenquimales con las protuberancias celulares prolongados y aflojan celulares celulares contactos marcados por puntas de flecha. (B) CCL18 también cambia la morfología de las células de una manera dependiente de la dosis (C [1 ng /ml] y D [10 ng /ml]) para similares a fibroblastos fenotipo mesenquimal y se aflojó celulares-Cell-contactos marcados por puntas de flecha.
la expresión de genes relacionados con la EMT
el uso de RT-PCR, no hemos podido detectar ningún efecto clara de CCL18 en la expresión de E-cadherina en cualquiera de las concentraciones utilizadas después de un tiempo de estimulación de 72 horas (Fig. 2A). En contraste, la estimulación de A549 con CCL18 durante 72 horas aumenta SNAIL1 (Fig. 2B) y FSP-1 de expresión (Fig. 2C). El aumento de la FSP-1 expresión fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,03). Curiosamente, el efecto fue máximo a 1 ng /ml CCL18 y disminuyó ligeramente con concentraciones crecientes (Fig. 2C.). En comparación con el control de la estimulación CCL18 casi se duplicó la expresión media SNAIL1. Sin embargo, este aumento no alcanzó significación y ninguna dosis-relación clara podría ser detectado (Fig. 2B). Curiosamente, a pesar TGFbeta indujo un aumento en la expresión SNAIL1 y FSP1, los efectos fueron más bajas que la observada con la concentración CCL18 comparable (1 ng /ml). Una vez más, no tiene efecto sobre la expresión de E-cadherina se pudo encontrar.
niveles de mRNA de (A) E-cadherina, (B) SNAIL1, (C) FSP-1 después de la estimulación con -β o varias concentraciones de CCL18 72 h con respecto al control no estimulado. Cada barra representa la media ± DE de cuatro experimentos independientes. GAPDH se utilizó como gen de mantenimiento para normalizar las diferencias en la cantidad de ARN total.
Los cambios en la expresión de Proteines relacionados con la EMT
Para confirmar nuestros resultados de la PCR, se analizaron las proteínas expresión por Western Blot. En paralelo con los resultados de la PCR, la expresión de E-cadherina da a conocer una disminución ligera pero no significativa cuando las células se estimularon con CCL18 durante 72 horas (Fig. 3A). En contraste, se halló una mayor SNAIL1 significativamente (p & lt; 0,005; Fig. 3B) y FSP-1 expresiones (P & lt; 0,05; Fig. 3C) por cuarenta y cincuenta por ciento, respectivamente. TGFbeta (2 ng /ml) inducida ya sea no (snail1) o sólo marginal y cambios insignificantes (E-cadherina, FSP1, Fig. 3).
Todos los resultados se normalizaron a los controles no tratados. Bares resumen los resultados de tres análisis independientes de transferencia de western, en el panel de la derecha se representa una mancha representativa.
Relacionado con CCL18 quimiotaxis y la invasión
Boyden experimentos en cámaras revelaron que induce la quimiotaxis de CCL18 células A549 de una manera dependiente de la dosis. Se ha observado una dosis dependiente y significativa (p & lt; 0,0001) aumento de la quimiotaxis inducida por CCL18, que alcanzó su máximo (50% sobre el control) a una dosis de 100 CCL18 ml /ng (Fig. 4). TGFbeta (2 ng /ml) aumenta la quimiotaxis en un 40%, lo que también fue estadísticamente significativa (p & lt; 0,0001). La ganancia de la capacidad de invasión en un tejido o matriz es una característica adicional e importante de EMT que requiere la actividad proteolítica adicional para la quimiotaxis. Por lo tanto, analizamos el efecto de CCL18 en la capacidad de invasión. Se encontró que CCL18 (1 ng /ml) aumenta la invasión de más del doble en comparación con el control (p & lt; 0,0001; Fig. 5). . TGFbeta (2 ng /ml) aumenta invasivo en el mismo intervalo pero menos pronunciado (p & lt; 0,0001)
Significados se calcularon utilizando comparación por parejas (Wilcoxon Signed Rango Test), control: células no tratadas (n = 4) .
Las significancias se calcularon mediante comparación por parejas (Wilcoxon Signed rank test), el control: las células no tratadas (n = 3) guía empresas
proliferación
A. determinar el efecto de CCL18 en la proliferación celular, las células A549 se trataron durante 24 horas con o bien 2 ng /ml de TGFbeta o 0,1 ng /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, o 100 ng /ml de CCL18, respectivamente, y, posteriormente, se realizó un ensayo de BrdU. La incubación con CCL18 disminuyó la tasa de proliferación en una forma dependiente de la dosis que llega una reducción significativa del 50% en comparación con los controles a 1000 ng /ml (P & lt; 0,001; Fig. 6). TGFbeta (2 ng /ml) redujo la tasa de proliferación en un 55% en comparación con los controles (p & lt; 0,001).
quimiorresistencia
Además, investigó si CCL18 modula la sensibilidad de las células A549 al tratamiento con cisplatino. Por lo tanto, se incubaron las células con CCL18 y tratados, posteriormente las células con diluciones en serie de cisplatino. Después de la estimulación CCL18 durante 72 horas, no hay efectos tóxicos de CCL18 o TGFbeta se pudieron detectar (datos no mostrados). LD
50 de las células A549 no tratados fue de 6 mg /ml de cisplatino. Después de la estimulación CCL18 (0,1 ng /ml) de las células durante 72 horas, la LD
50 aumentó a 9 mg /ml de cisplatino. Del mismo modo, la LD50 de células estimuladas se elevó a 10 mg /ml cuando las células fueron pretratadas con 1 ng /CCL18 ml (Fig. 7). Mayores concentraciones de CCL18 fueron probados, pero no se observó efecto adicional (datos no mostrados).
Las células se cultivaron en presencia o ausencia de -TGFbeta o CCL18 en las concentraciones indicadas durante 72 h. Después del periodo de cultivo, el medio se cambió y las células se incubaron con cisplatino durante 72 horas adicionales en concentraciones que van desde 0,4 hasta 25 mg /ml. La supervivencia celular se midió mediante el ensayo de MTT. La línea horizontal indica el LD
50, las líneas verticales indican el LD
50 para la condición de pre-incubación respectiva (n = 4).
Discusión
pulmón el cáncer es una de las enfermedades con mayor incidencia en el mundo occidental ya pesar de todos los avances en el diagnóstico y la terapia de una de las principales causas de muerte relacionada con el cáncer [23]. Casi el 85% de estos pacientes sufren de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que se subdivide en carcinoma escamoso, adenocarcinoma, carcinomas de células grandes y otros subtipos raros [24]. Adenocarcinoma representa la mayor proporción de NSCLC y desde la década de 1970 su proporción va en aumento [25]. En el momento del diagnóstico la mayoría de pacientes con NSCLC ya sufren de la enfermedad avanzada o metastásica, que se asocia con un mal pronóstico [26]. El mecanismo de la metástasis en el cáncer de pulmón no se entiende completamente, pero transición epitelial a mesenquimal (EMT) parece ser un evento clave en el proceso de metástasis. Algunos autores ya demostraron que diversos mediadores liberados en el microambiente de los tumores sólidos son capaces de inducir EMT y por lo tanto promover la progresión de la enfermedad [14]. CCL18 es una quimiocina producido y liberado por los macrófagos asociados al tumor (TAM) en el microambiente de las células de cáncer y fibrosis pulmonar [16], [17]. Podríamos demostrar que CCL18 es muy elevado en los pacientes con NSCLC y se correlaciona con la T-etapa y el tiempo medio de supervivencia en el subgrupo de adenocarcinoma [21]. Esto conduce a la pregunta de si CCL18 está directamente involucrado en los procesos patogénicos de las enfermedades cancerosas. Dado que se encontró para inducir CCL18 colágeno en fibroblastos de pulmón y de actuar de una manera similar a TGFbeta [17], [27], [28], la hipótesis de que CCL18 puede promover el proceso de metástasis a través de la EMT. Las células A549 son una línea celular bien caracterizada humano aislado a partir de un adenocarcinoma de pulmón, que ya se ha utilizado en varios estudios la investigación de la inducción de EMT por el TGF-β [29], [30]. De acuerdo con los demás, demostramos que las células A549 tratadas con dosis bajas incluso de TGF-β se sometieron a cambios morfológicos de las células epiteliales cuboides a huso células similares a fibroblastos en forma y adquirieron un fenotipo mesenquimal después de 24 horas de tratamiento. Del mismo modo, también hemos sido capaces de demostrar que CCL18 induce los mismos cambios morfológicos como el TGF-β. Esto se ve apoyado por el análisis del patrón de expresión de los genes epiteliales y mesenquimales en ARNm y proteínas. La sobre regulación de los genes mesenquimales como FSP-1 o SNAIL1 es un sello distintivo en el proceso de la EMT. Los cambios observados del patrón de expresión característico eran bastante similares en TGF-β y en estimulaciones CCL18. En este contexto, es notable que Miyazaki et al. publicado en 2006, que los pacientes con adenocarcinoma pulmonar que demuestra una baja expresión de E-cadherina en combinación con una alta FSP-1 de expresión tienen que enfrentarse a un peor pronóstico significativo debido a la metástasis hematógena [9]. También observamos que SNAIL1, un factor de transcripción involucrado en los eventos tempranos de EMT, fue hasta reguladas por tratamiento CCL18 en la misma forma que por TGFbeta. En el proceso de la metástasis, las células cancerosas adquieren nuevas capacidades como la invasión, la migración mejorada y baja regulación de la proliferación. Nosotros, por lo tanto, estudiamos también la influencia de CCL18 en estas funciones de las células y se observó un potencial migratorio e invasivo mejorada después de 24 horas de tratamiento CCL18. Por otra parte, la tasa de proliferación de A549 se redujo después de 24 horas de tratamiento CCL18, que pueden ser debido a la iniciación de los procesos de diferenciación. En total, estos grandes cambios en las funciones celulares mencionadas anteriormente demuestran una fuerte influencia de CCL18 en el proceso de metástasis. Por lo tanto, sobre la base de nuestros datos presentados aquí, en nuestros datos publicados anteriormente que el aumento de CCL18 en suero se correlaciona con la disminución de tiempo de supervivencia en el adenocarcinoma de pulmón [22] y en la observación de Chen et al. lo que demuestra que CCL18 promueve la metástasis en el cáncer de mama [5] la hipótesis de que CCL18 puede ser uno de los factores clave EMT de conducción en el ambiente del tumor.
Teniendo en cuenta que la mayoría de los pacientes requieren quimioterapia, ya sea como adyuvante o neoadyuvante parte de un enfoque multimodal o como terapia única, la quimio-resistencia es todavía una de las principales barreras en el tratamiento del NSCLC suficiente y la razón del progreso del tumor, la recaída y muerte del tumor. La quimioterapia de NSCLC todavía se basa en fármacos de platino derivado aunque se sabe que existen varios mecanismos de cómo las células de cáncer de pulmón escapar citotoxicidad cisplatino y CCL18 pueden ser un mediador fundamental en estos procesos. Estos mecanismos parecen estar vinculados a la EMT porque los factores de transcripción que regulan la EMT también regulan las proteínas de transporte relacionados con un aumento de la resistencia a los agentes de platino [31], [32]. Por lo tanto, hemos investigado el papel de CCL18 en la quimio-resistencia. Hemos observado en efecto un aumento de la quimiorresistencia provocada por CCL18. Curiosamente, este aumento en la quimiorresistencia alcanzó su punto máximo en el mismo rango que los marcadores de EMT (por ejemplo FSP1). Esto proporciona evidencia de un papel de CCL18 en la inducción de la quimiorresistencia. Debido a que es una quimiocina CCL18, que también podrían estar involucrados en el homing de las células cancerosas, que también investigó las propiedades chemotacic de CCL18 en células A549. Hemos observado que la CCL18 ejerce un aumento dependiente de la dosis en la quimiotaxis de las células de cáncer de pulmón que indican, que CCL18 atrae a las células de cáncer de pulmón a los sitios de liberación CCL18. A medida que el pulmón es el órgano con el más alto nivel de producción de CCL18, este efecto podría influir en el homing de las células tumorales sensibles CCL18 en el pulmón.
Es interesante que, en la mayoría de los experimentos no pudimos observar una clara dependiente de la dosis efecto de CCL18. Por el contrario, el aumento de las concentraciones de CCL18 a menudo resulta en efecto de CCL18 decreciente. Esto es compatible con la expresión de diferentes receptores agonistas y antagonistas de CCL18. Recientemente, Catusse et al. publicó que CCL18, a través de la activación de GPR30, actúa agonística y disminuye los efectos CXCR4 mediada de CXCL12 [15]. Chen et al. demostró que PITPNM3, una proteína que contiene el dominio de transferencia de fosfatidilinositol asociada a la membrana, podría actuar como un receptor de CCL18 [5]. Se identificaron los ya conocidos CCR6 receptor de quimiocinas CCL18 como un receptor con una potencia de iniciar las actividades descritas en los fibroblastos [33]. Esto indica que CCL18 podría utilizar varios receptores y el equilibrio de la expresión del receptor podría regular el agonista y efectos antagonistas de CCL18.
En conclusión, nuestros datos demuestran que CCL18 induce EMT en las células A549, aumenta su potencial metastásico y apoya la resistencia a la quimioterapia. Por lo tanto, CCL18 no es sólo un mediador liberado por los macrófagos asociados a tumores y, potencialmente, que refleja el tamaño del tumor, sino que también influye en los procesos neoplásicos de adenocarcinoma. Los datos presentados aquí demuestran que CCL18 es capaz de desencadenar los eventos involucrados en la metástasis tumoral, como el cambio de las células tumorales epiteliales primarias en células mesenquimales migratorio, la quimiotaxis, y la invasión. Además, CCL18 también protege a las células tumorales a la quimioterapia mediante el aumento de la quimio-resistencia. Por lo tanto, concluimos que CCL18 será un objetivo futuro en el tratamiento de cáncer de pulmón.