Extracto
La oncoproteína E7 del virus del papiloma humano (VPH) es un objetivo ideal para el desarrollo de estrategias de inmunoterapia contra tumores asociados al VPH. Sin embargo, debido inmunógenos basados en proteínas solo son inductores pobres del linfocito T citotóxico (CTL), que han sido difíciles de explotar con fines terapéuticos. En este estudio, mostramos que una lipoproteína recombinante que consiste en E7 inactiva (E7M) biológicamente ligado a un resto lipídico bacteriana (rlipo-E7M) induce la maduración de las células dendríticas de ratón derivada de la médula ósea a través de Toll-like receptor 2 (TLR2), sesga las respuestas inmunes hacia las respuestas Th1 e induce respuestas de CTL específica de E7. Se estudió además la capacidad de rlipo-E7M para proporcionar protección contra un desafío de células tumorales TC-1 en un modelo animal. Los ratones inmunizados de forma profiláctica con dos dosis de 10 mg de rlipo-E7M resultaron ser libre de la CT-1 de crecimiento del tumor. Los experimentos en un modelo de inmunización terapéutica mostraron que el volumen de los tumores en ratones que recibieron una dosis única de rlipo-E7M era menos de 0,01 cm
3 en día 40, mientras que el volumen de los tumores en ratones tratados con rE7m era 2,28 ± 1,21 cm
3. El volumen del tumor de todo el grupo de control fue de 3 cm
3. Además, hemos demostrado que las células T CD8 + desempeñan un papel importante en la inmunidad anti-tumor cuando la administración de rlipo-E7M. Estos resultados demuestran que rlipo-E7M podría ser un candidato prometedor para el tratamiento de tumores asociados al VPH
Visto:. Huang C-Y, Chen JJW, Shen K-Y, Chang L-S, Yeh Y-C, Chen I-H, et al. (2012) recombinante lipidada HPV E7 induce una inmunidad Th-1-polarizados por la respuesta inmune y protector contra el cáncer de cuello uterino en un modelo de ratón. PLoS ONE 7 (7): e40970. doi: 10.1371 /journal.pone.0040970
Editor: Silke Appel, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: 23 Noviembre 2011; Aceptado: 18 Junio 2012; Publicado: 18 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un Premio de Investigación Investigador del Instituto Nacional de Investigación en Salud (VC-098-PP-04 a S-JL) y (VC-098-PP-06 a C-HL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Virus del papiloma humano (VPH) pueden explicar el desarrollo de varios tipos de cáncer; en particular, la infección por VPH puede causar cáncer de cuello uterino. El cáncer cervical es la segunda causa principal de muerte por cáncer en mujeres en todo el mundo [1]. Por lo tanto, se necesitan con urgencia nuevas terapias para controlar la mortalidad por cáncer de cuello uterino. Hasta la fecha, HPV E6 y E7 oncoproteínas han sido identificados como los objetivos principales para el desarrollo de vacunas terapéuticas contra los tumores asociados al VPH. Por otra parte, como las proteínas intracelulares (nucleares), los productos de los genes E6 y E7 pueden estar ocultos de la respuesta inmune humoral. La atención se ha centrado por lo tanto en la generación de una vacuna capaz de inducir o estimular una respuesta inmune celular a HPV E6 y E7 oncoproteínas [2]. Se han adoptado varios enfoques para desarrollar vacunas contra el VPH, incluyendo vectores terapéuticos en vivo, péptido /en proteínas, ácidos nucleicos y los enfoques basados en células enteras. Estos estudios han demostrado la importancia de las respuestas de células T en la protección contra los tumores en modelos humanos y animales [3]. De estos enfoques, péptido sintético y enfoques basados en proteínas son los candidatos más atractivos; sin embargo, en general, péptido y proteína por sí sola son no inmunogénicos. Sin adyuvante adicional, es difícil inducir respuestas inmunes fuertes y eficaces que se caracterizan por la producción de citoquinas Th1 y linfocitos T citotóxicos-oncoproteína específica virales (CTL) [3].
agonistas TLR son naturalmente inmuno-estimuladoras inductores de la inmunidad innata. TLR2 se expresa en muchos tipos de células diferentes, incluyendo células dendríticas, macrófagos y linfocitos. candidatos, por lo tanto, los agonistas de TLR2 como las lipoproteínas bacterianas son prometedores para ser usados como una nueva generación para la inmunoterapia adyuvante.
Hemos establecido recientemente una plataforma de producción de alto rendimiento de las lipoproteínas recombinantes [4]. La fracción lipídica de la lipo-inmunógeno es idéntica a la de las lipoproteínas bacterianas, que son reconocidos como señales de peligro por el sistema inmune. Por lo tanto, las respuestas inmunes tanto innata y adaptativa pueden ser inducidas por las lipoproteínas [5], [6]. La estructura lipídica de la lipoproteína recombinante es diferente de la de lipopéptido tri-acilado sintético [7]. Esta distinción hace lipoproteína recombinante provocó diferentes respuestas inmunes de lipopéptido sintético mediante la inducción de diferentes niveles de citocinas y quimiocinas biológicos [8]. Hemos demostrado previamente que las respuestas de anticuerpos neutralizantes del virus provocados por la forma de lípidos de un inmunógeno fueron más fuertes que aquellas obtenidas con la forma no lipídica de un inmunógeno [4], [9]. En este informe, se demuestra que las dificultades de la utilización de proteínas por sí sola para inducir respuestas de CTL se pueden superar mediante el uso de la estrategia de lipo-inmunógeno. Una forma de lípidos de la mutante E7 (rlipo-E7M) y una forma no lipídica de rE7m de tipo de HPV se produjeron 16 (HPV16), y la capacidad de estos inmunógenos para activar las CD derivadas de la médula ósea de ratón (BM-DC) era juzgado. También se investigaron las respuestas inmunes de células B y T. Por último, se examinó si las respuestas inmunes inducidas por rlipo-E7M fueron capaces de proteger a los ratones contra la exposición al tumor. Estos estudios no sólo proporcionan información sobre rlipo-E7M como un enfoque prometedor para el desarrollo de una vacuna terapéutica contra los tumores asociados al VPH pero también presentan una estrategia para el desarrollo de inmunoterapias exitosas usando candidatos a base de proteínas.
Resultados
la producción de inmunógenos recombinantes
el E7M recombinante (rE7m), que fue diseñado para contener una etiqueta de hexahistidina (HisTag) en su extremo C-terminal, fue producido para comparar los efectos de rE7m a la lipidada de destino. rE7m se purificó usando cromatografía de afinidad de metal inmovilizado columna (IMAC) (Figura 1B, carriles 1-4). rE7m se detectó con anticuerpos anti-Histag (Figura 1B, carriles 5-8). Hemos identificado previamente una secuencia de fusión (D1) que puede estar condensado con un inmunógeno no lipidada para alcanzar altos niveles de expresión de la lipo-inmunógeno recombinante [4]. Utilizando esta estrategia, el gen E7M se fusionó a D1 en su extremo N-terminal y diseñado un HisTag en su extremo C-terminal. Este recombinante lipidada E7M (rlipo-E7M) se purificó utilizando una columna de IMAC (Figura 1B, carriles 9-11). rlipo-E7M se detectó con anticuerpos anti-Histag (Figura 1B, carriles 12-14). Después de que el lipopolisacárido (LPS) se retiró (menos de 0,003 UE /g), se purificó rlipo-E7M y rE7m se analizaron comparativamente para su inmunogenicidad y eficacia en modelos animales.
(a) La alineación del aminoácido secuencia de tipo salvaje HPV16 E7 (número de acceso: NP_041326) y el E7 inactiva (E7M). Cada sitio mutante de E7M se pone de relieve. La secuencia de ADN del gen E7M se obtuvo utilizando el uso de codones de
E. coli
y totalmente sintetizado utilizando el método de PCR de ensamblaje. El producto de PCR fue clonado en el vector pET22b para la expresión rE7m y en el vector pET22b modificado con un péptido señal para la expresión de lípidos rlipo-E7M. Las proteínas recombinantes contenían una secuencia adicional HHHHHH (HisTag) en el extremo C-terminal y se expresaron bajo el control del promotor T7. (B) El-E7M rlipo proceso de purificación de proteínas y rE7m se controló usando 15% la reducción de SDS-PAGE seguido por tinción con Coomassie manchado azul y inmunotransferencia utilizando anticuerpos anti-Histag. El rlipo-E7M recombinante se expresó en
E. coli
cepas C43 (DE3). Carril 1, la expresión rE7m después de la inducción IPTG; carril 2, la expresión de proteínas en ausencia de inducción con IPTG; carril 3, la fracción extraída de rE7m; carril 4, rE7m recombinante purificada. Los carriles 5-8 muestran inmunotransferencia para supervisar el proceso de purificación rE7m, y las muestras en estos carriles son los mismos que los en los carriles 1-4, respectivamente. Carril 9, la expresión rlipo-E7M después de la inducción con IPTG; carril 10, expresión de la proteína en ausencia de inducción con IPTG; carril 11, se purificó rlipo-E7M. Carriles 12-14 muestran inmunotransferencia para supervisar el proceso de purificación rlipo-E7M, y las muestras en estos carriles son los mismos que aquellos en los carriles 9-11, respectivamente. La forma no lipidada de rE7m se expresó en
E. coli
BL21 (DE3) cepa estrella. Las flechas indican las posiciones electroforéticas de rE7m o rlipo-E7M en los geles o manchas. (C) Intacto rlipo-E7M se analizó por LC /MS. análisis LC /MS reveló la presencia de cinco grandes modificaciones post-traduccionales de rlipo-E7M. Las masas moleculares (en Daltons) se determinaron utilizando un algoritmo de máxima entropía. Los cinco picos principales muestran masas de 15384.5, 15400, 15412.5, 15426 y 15439. (d) se obtuvieron y se identificaron después de la digestión de rlipo-E7M con tripsina fragmentos rlipo-E7M N-terminales. La muestra digerida se analizó en un espectrómetro de masas MALDI Waters® micro MX ™. El MALDI-TOF MS espectros reveló la existencia de cinco picos con valores de m /z de 1452, 1466, y 1480, 1492 y 1506.
Identificación y Caracterización de inmunógenos purificada
rlipo-E7M y rE7m se digirieron con tripsina para evaluar su péptido masiva de huellas dactilares (PMF). Los resultados confirmaron que los picos principales en los espectros de masas se obtuvieron a partir rlipo-E7M y rE7m (datos no mostrados). Para identificar el resto lipídico de rlipo-E7M, directa infusión muestra ESI-MS de intacta rlipo-E7M se realizó en un instrumento Q-TOF. Una vez procesados los datos, cinco picos principales con masas de 15.384,5, se identificaron 15400, 15412.5, 15426, 15439 y Da (Figura 1c). En base a los estudios anteriores, hemos considerado la existencia de estos picos principales como la firma de las modificaciones de los lípidos de las lipoproteínas [4], [7].
A continuación, medimos la masa exacta de los fragmentos N-terminales de rlipo -E7m. Cinco picos con valores m /z de 1452, 1466, 1480, 1492, y 1506, fueron identificados (Figura 1d). La purificación de los typtic lipo-fragmentos para análisis de masas reveló dos picos más que no han sido previamente identificados. Con el fin de verificar que la modificación lipídica de cada pico es en el residuo cisteinil N-terminal, fragmentos N-terminales de rlipo-E7M se sometieron a análisis MALDI-TOF-TOF para determinar la secuencia de cada pico. Las secuencias de estos cinco picos eran los mismos, y la secuencia identificada de y5 a y1 fue "SQEAK" (datos no mostrados). Se confirmó que los picos de rlipo-E7M se asociaron con el residuo de cisteína lipidada y verificamos que rlipo-E7M contiene un resto lipídico bacteriana en su extremo N-terminal.
rlipo-E7M Activa médula ósea células dendríticas derivadas través TLR2
para evaluar la función de rlipo-E7M, lo primero que examinó la respuesta de proliferación de linfocitos a los inmunógenos recombinantes y controlar los agonistas. Los LPS (un agonista de TLR4) y el lipopéptido sintético palmitoil-3-Cys-Ser- (Lys) 4 (pAM3, un agonista de TLR2) indujo la proliferación de esplenocitos de una manera dependiente de la dosis. rlipo-E7M se encontró para estimular los esplenocitos a concentraciones de 10 nM y 100 nM [rlipo-E7M agregada a 1000 nM en solución salina tamponada con fosfato (PBS)]. Por el contrario, rE7m no inducir la proliferación de esplenocitos. Estos resultados demuestran que el resto lipídico de rlipo-E7M es capaz de activar las células inmunes (Figura 2A) guía.
(a) Se aislaron esplenocitos de los ratones de tipo salvaje y se sembraron a una densidad de 2 × 10
5 células /pocillo en placas de 96 pocillos. Las células se incubaron con varias concentraciones de LPS (0 a 1000 g /ml), pAM3 (0-1.000 mg /ml), rlipo-E7M (0-100 mg /ml) o rE7m (0-1.000 mg /ml) para 48 hrs. Durante las últimas 24 horas, 1 Ci de [
3H] -timidina se añadió a cada pocillo para medir la síntesis de ADN. Los datos se representan como la media ± desviación estándar de muestras por triplicado. (B) BM-DC de ratones de tipo salvaje se cultivaron en medio suplementado con LPS (0,01 mg /ml), rE7m (10 g /ml) o rlipo-D1E3 (10 mg /ml) en presencia o ausencia de polimixina B (20 mg /ml). Después de una incubación de 24 h, la expresión de la CD40 marcadores de superficie de células dendríticas y CD86 se analizó mediante citometría de flujo. Los experimentos se realizaron por triplicado y la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las células cultivadas en medio solo se definió como 100%. (C) Para los estudios de secreción de citoquinas, BM-DC se cultivaron en medio suplementado con LPS (0,01 mg /ml), pAM3 (0,15 g /ml), rE7m (0,1-10 mg /ml) o rlipo-E7M (0,1- 10 mg /ml) en presencia o ausencia de polimixina B (20 mg /ml). Después de una incubación de 24 horas, los sobrenadantes se cosecharon y se analizaron para TNF-α y la IL-12 de producción (p40) por ELISA. Los datos se presentan como la media ± SD de tres experimentos independientes. (D) BM-DC de tipo salvaje, TLR1-knockout (TLR1-KO), los ratones TLR2 KO o TLR6-KO fueron cultivadas ya sea en solitario o en medio suplementado con LPS (0,01 mg /ml), pAM3 medio (0,15 g /ml), rE7m (10 g /ml), o rlipo-E7M (10 mg /ml). Después de una incubación de 24 horas, los sobrenadantes se recogieron y se analizaron para la producción de TNF-α por ELISA. Los datos se representan como la media ± desviación estándar de muestras triplicadas.
A continuación, utilizamos BM-DC como un modelo para estudiar las propiedades inmuno-estimuladoras de rlipo-E7M. Se añadió polimixina B para monitorizar cualquier interferencia causada por LPS residuales en ensayo funcional. rlipo-E7M regulados hasta la expresión de los marcadores de superficie tales como CD40 y CD86 en BM-DC, mientras que rE7m no tuvo ningún efecto (Figura 2b). Se obtuvieron resultados similares en estudios de secreción de citoquinas. La secreción de TNF-αand IL-12p40 fue inducida por rlipo-E7M pero no por grupo rE7m (Figura 2c). Polimixina B inhibe la estimulación mediada por LPS de BM-DC, pero no tuvo ningún efecto significativo sobre las propiedades estimulantes de rlipo-E7M. Estos resultados indican que la activación de BM-DC por rlipo-E7M no era debido a LPS residuales y que la actividad inmuno-estimuladoras de rlipo-E7M fue ligado a su resto lipídico.
Debido a que la estructura de los lípidos de rlipo -E7m es un agonista para TLR1 /TLR2 y /o TLR2 /TLR6, el siguiente examinado cuál de estos TLRs es esencial para la actividad inmuno-estimuladoras de rlipo-E7M. Para abordar esta cuestión, BM-DC desde wild-mecanografiado, se utilizaron ratones knock-out para TLR6 (KO) TLR1-, TLR2 y. rlipo-E7M y pAM3 indujeron la secreción de TNF-α en BM-DC de ratones TLR1-KO y TLR6-KO, pero no lograron estimular BM-DC de ratones TLR2-KO, lo que indica que TLR2 es necesario para la actividad inmuno-estimuladoras de rlipo- E7M (Figura 2d). Estos datos demuestran que el inmunógeno fusionado con resto lipídico bacteriana activa la maduración de las CD a través de BM-TLR2.
inmunización con rlipo-E7M anticuerpos Mejora de antígenos específicos y genera una respuesta Th1-sesgada
para evaluar las propiedades adyuvantes intrínsecas de rlipo-E7M
en
in vivo
, analizamos la magnitud de la respuesta de anticuerpos específica de antígeno en los ratones inmunizados con rE7m o rlipo-E7M (Figura 3a) . Los títulos de anticuerpos provocados por rlipo-E7M eran 100 veces mayores que los provocados por rE7m en la semana 4, 6 y 8. A continuación, para analizar los isotipos de anticuerpos provocados tras la inmunización con rE7m o rlipo-E7M, los niveles inducidos de IgG1 e IgG2b se midieron. Los niveles de IgG1 fueron comparables en ambos rE7m- y ratones rlipo-E7M-inmunizados; sin embargo, los niveles de IgG2b en los ratones immunzed-rlipo-E7M fueron más altos que los de los ratones inmunizados con rE7m (Figura 3b). Este fenómeno se puede observar claramente mediante la comparación de las relaciones /IgG1 IgG2b en estos ratones (Figura 3b, inserto)
.
(a) C57BL /6 ratones (n = 5) fueron inmunizados dos veces por inyección subcutánea de 30 mg de rE7m en PBS o de 30 mg de rlipo-E7M en PBS a intervalos de dos semanas. Se recogieron los sueros y IgG o (b) las respuestas de IgG2b /IgG1 contra rE7m se evaluaron por ELISA. Las relaciones de IgG2b /IgG1 en los dos grupos se muestran en la inserción. (C) Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea de 30 mg de rE7m o rlipoE7m dos veces a intervalos de dos semanas. Siete días después de la segunda inmunización, se aislaron los esplenocitos y se estimularon con rE7m (10 g /ml) durante 4-5 días. Se recogieron los sobrenadantes, y los niveles de IFN-γor IL-5 se midieron por ELISA. Los datos se expresan como medias ± SD de las muestras (n = 5).
Además, se analizó la secreción de IFN-γ e IL-5 en los esplenocitos de los ratones inmunizados con rE7m o rlipo-E7M. El nivel de INF-γinduced sobre rlipo-E7M inmunización fue 4 veces mayor que la inducida en rE7m inmunización (Figura 3c); sin embargo, la inmunización rE7m induce una secreción de 7 veces mayor de IL-5 por esplenocitos que hizo la inmunización rlipo-E7M (Figura 3c). Juntos, los resultados de la células T y ensayos de células B sugieren que la fusión de un inmunógeno a una bacterianas resultados resto lipídico en una respuesta inmune basada en Th1 inducida por el inmunógeno lipidada.
inmunización con rlipo-E7M Induce S7- específicas respuestas de células T
a continuación, investigamos si rlipo-E7M la inmunización fue capaz de inducir respuestas de CTL específica de E7. ratones C57BL /6 fueron inmunizados por vía subcutánea el día 0 y 7 con rlipo-E7M, rE7m o un control de PBS. Los esplenocitos de los ratones inmunizados se estimularon con péptido RAHYNIVTF (RAH, E7
49 a 57) y el número de células IFN-gamma secretoras de E7 específica se determinó usando el ensayo de ELISPOT (ver Materiales y Métodos). La inmunización con rlipo-E7M indujo un mayor número de células INF-γsecreting que hizo la inmunización con rE7m (Figura 4a). Además, la tinción con un RAH /H-2D
b R-ficoeritrina (PE) conjugado con tetrámero demostró un aumento dramático en células T CD8 + específicas de E7 después de la inmunización con rlipo-E7M. El número de células T CD8 + específicas de E7 inducidos por rlipo-E7M inmunización fue más de 4 veces la inducida por la inmunización rE7m (Figura 4b). Para probar la actividad de la muerte celular después de T-rlipo E7M o inmunización rE7m, se usaron células T2 pulsadas con péptido RAH como células diana en un ensayo estándar de liberación de cromo de 4 horas. rlipo-E7M inmunización indujo un alto nivel de actividad de CTL específica de E7. En contraste, la inmunización rE7m solamente indujo un nivel bajo de actividad CTL específica de E7 (Figura 4c). Estos resultados demuestran claramente que las respuestas HPV E7 CTL específicos fueron inducidos por la vacunación rlipo-E7M.
(a) Los esplenocitos (2 × 10
5 células /pocillo) de ratones inmunizados se incubaron con o sin 10 g /ml de péptido RAHYNIVTF (RAH) durante 48 horas en una placa de 96 pocillos ELISPOT anti-IFN-γ-revestido. Las manchas de IFN-γ-secretoras se midieron utilizando un lector de ELISPOT. Los datos se expresan como medias + SD de seis animales por grupo. (B) Las células T CD8 + RAH-específicas se detectaron por tinción de tetrámero y se analizaron por citometría de flujo. El porcentaje de células de tetrámero positivo entre los linfocitos T CD8 + se indica dentro de cada panel. Los números de TetraRAH-tetrámero + /CD8 + células en células totales CD8 (1 × 10
5) a partir de tres experimentos se mostraron. Los gráficos de barras que indican el porcentaje medio de células RAH tetrámero + /CD8 + entre las células CD8 +. Los datos se expresan como la media + SD. * P & lt; 0,05. (C) Para evaluar el efecto citotóxico de rlipo-E7M la inmunización en las células tumorales, se realizó un ensayo de liberación de cromo estándar. esplenocitos aislados (células efectoras) se estimularon con RAH (10 mg /ml) durante 7 días en presencia de rIL-2 (10 unidades /ml). Las células diana (5 × 10
3 /pocillo) se incubaron con diferente proporción de células efectoras (01:25, 01:50, 1:100). La lisis específica (%) se calcula de la siguiente manera:. 100 x (releasecpm la muestra - releasecpm espontánea) /(Máximo releasecpm - releasecpm espontánea) guía empresas
Evaluación de la eficacia terapéutica y profiláctica de rlipo-E7M
en el modelo profiláctico, los ratones se inmunizaron dos veces con PBS, rE7m o rlipo-E7M a las dos semanas de intervalo, y las células TC-1 se inyectaron por vía subcutánea a los 7 días después de la última inmunización. En el día 58 después del desafío, los tumores se mantuvieron apenas medible en los ratones inmunizados con rlipo-E7M. Por el contrario, el volumen promedio de tumor en ratones inyectados con PBS era más grande que 2,5 cm
3, y el volumen medio del tumor fue de 0,59 ± 0,62 cm
3 en ratones vacunados con rE7m (Figura 5a). Para evaluar el modelo terapéutico, C57BL /6 ratones fueron inyectados por vía subcutánea con células TC-1 en el dorso. Siete días más tarde, estos ratones recibieron 30 mg de cualquiera de rlipo-E7M o rE7m o recibido sólo PBS mediante inyección subcutánea del abdomen. En el día 58 después de la inoculación, los tumores eran apenas detectables en los ratones que recibieron rlipo-E7M. Por el contrario, el volumen promedio de tumor en ratones inyectados con PBS fue de 3 cm
3, y el volumen medio del tumor en ratones inmunizados con rE7m fue mayor que 2.0 cm
3 (Figura 5b). Estos resultados demuestran que tanto las eficacias profilácticas y terapéuticas de inmunógenos recombinantes se incrementan dramáticamente cuando se entregan en una forma lipidada.
(a) los ratones se inmunizaron dos veces por inyección subcutánea de rE7m /rlipo-E7M (10 g ) o PBS a intervalos de una semana. Siete días después de la inmunización final, los ratones fueron inyectados subcutáneamente con 2 x 10
5 TC-1 células en un volumen total de 200 l por vía subcutánea. (B) Los ratones fueron inoculados por vía subcutánea con TC-1 en las células (2 × 10
5 /ratón). Después de 7 días, se inyectó a los ratones portadores de tumor (5-10 ratones por grupo) una vez con rE7m /rlipo /rE7m (30 g /ratón) o PBS. El volumen del tumor se muestra como largo x ancho x ancho /2 (mm
3). Los datos se expresan como medias ± SEM. (C) Tres grupos (rlipo-E7M /CD4, rlipo-E7M /CD8 y rlipo-E7M /IgG de rata) de los ratones se inyectaron de anti-CD4, anti-CD8 y anticuerpos de control, respectivamente, un día antes de la inyección de TC células -1. Se inyectaron Estos grupos y dos grupos adicionales (rlipo-E7M y PBS) una vez con rlipo-E7M (10 g /ratón) o PBS siete días después de inoculados con TC-1 en las células (2 × 10
5 /ratón). El volumen del tumor se muestra como largo x ancho x ancho /2 (mm
3). Los datos se expresan como medias + SEM.
Se utilizaron cinco grupos de ratones C57BL /6 para identificar mejor qué subconjunto de células T contribuye a la inmunidad anti-tumor. Se inyectaron tres grupos de anti-CD4 (rlipo-E7M /CD4), anti-CD8 (rlipo-E7M /CD8) y anticuerpos de control (rlipo-E7M /IgG de rata) un día antes de la inyección de las células TC-1. Siete días más tarde, estos ratones recibieron 10 g de rlipo-E7M. Tratamientos de PBS y 10 g de rlipo-E7M se sirvieron como controles negativo y positivo, respectivamente. En el día 30 después de la inoculación del tumor, el volumen medio del tumor de PBS y grupos rlipo-E7M eran 1,1 cm
3 y 0,14 cm
3, respectivamente. No se observaron diferencias significativas entre los grupos de rlipo-E7M, rlipo-E7M /CD4 y rlipo-E7M /IgG de rata. Por el contrario, el efecto protector fue abolida cuando las células CD8 + se agotaron en grupo rlipo-E7M /CD8 (p & lt; 0,005, Figura 5c). Este resultado, evidentemente, demostró que la administración de rlipo-E7M podría generar células CD8 + mediada por efecto antitumoral.
Discusión
Hemos producido un inmunógeno lipidada, rlipo-E7M, que consiste en el E7 inactivada proteína de HPV16 biológicamente fusionado a un resto lipídico bacteriana. Nuestros resultados demuestran que la rlipo-E7M solo induce respuestas inmunes Th1, las respuestas CTL específicas de E7, y la inmunidad de tumor protectora en un modelo de tumor de ratón.
El reto de desarrollar inmunoterapias basadas en proteínas contra tumores es que la inmunógenos basados en proteínas ellos mismos tienen una baja inmunogenicidad y no provocan fácilmente reacciones de CTL. Formular el inmunógeno con adyuvantes es el método más común para el desarrollo de vacunas eficaces y superar la limitación de inmunoterapias basadas en proteínas. Hemos extendido esta idea por la unión covalente de un inmunógeno a un inmunopotenciador, la creación de una vacuna basada en la lipoproteína con actividad adyuvante intrínseca.
Los primeros estudios demostraron la potente actividad adyuvante de la lipoproteína bacteriana, lípidos sintéticos a los antígenos de péptidos y lípidos -tailed glico-péptidos [10], [11], [12]. Por ejemplo, el OspA lipidada recombinante podría inducir la inmunidad protectora en correlación con el desarrollo de anticuerpos. Esta vacuna la enfermedad de Lyme (LYMErixTM) fue autorizada por la FDA de EE.UU. en 1998 [13], [14]. Otro enfoque lipoproteína recombinante se basa en la lipoproteína de membrana externa I (OPRI) a partir de Pseudomonas aeruginosa. formulación de vacuna usando la peste porcina clásica (CSF) OPRI-basado E2 y NS3 promueven la activación de DC en el cerdo, lo que resulta en respuestas de células T mejoradas junto con las defensas inmunitarias humorales [15]. El OPRI también se ha fusionado con un antígeno 85A vacuna de la tuberculosis, mycolyl-transferasa (Ag85A). Subcutánea refuerzo con esta proteína de fusión en ausencia de adyuvante aumentó significativamente las respuestas inmunes humorales-Ag85A específicos [16]. MALP-2 (macrófagos activador de lipopéptido-2) ha demostrado estimular la actividad anti-tumoral en algunos modelos [17], [18]. Oldford y compañeros de trabajo demostraron que Pam3CSK4 inhibió el crecimiento del tumor en un IL-6 dependientes de derivado de células de mastocitos y el mástil de manera [19]. Más tarde, una vacuna de tres componentes de GLP por Ingale y compañeros de trabajo (un resto Pam3CSK4 tres ácido palmítico, un CD4 + y un epítopo de células B) mostró la inducción de fuertes respuestas IgG específicos del tumor [20]. Recientemente, Renaudet y colaboradores demostraron una de cuatro componentes HER-GLP construcción de vacuna (un epítopo de células T CD4 +, un epítopo de células T CD8 + OVA, un hidrato de carbono epítopo de células B y un incorporado en adyuvante ácido palmítico) inhibió el crecimiento del tumor en su GLP-ratones inmunizados [21].
el uso adyuvante de lipopéptidos provoca ambas citocinas Th1 y Th2, dependiendo del antígeno modelo utilizado en las vacunas. Por ejemplo, se encontraron lipopéptidos totalmente sintéticos incluyendo péptido palmitoil-lipidada y el péptido colesterol-lipidada que podría desencadenar una inmunidad protectora Th1 dependiente de [22]. En contraste, el lipopéptido diacilado FSL-1 induce TLR2 mediada por las respuestas Th2 [23]. Sin embargo, las respuestas inmunes pueden estar sesgadas por las lipoproteínas y lipopéptidos hacia las respuestas Th1 todavía se observaron muchas veces. Un lipopéptido pAM3 sintética de OspA inducir la aparición del fenotipo Th1 en ratones transgénicos αβ receptor de células T [5]. Bettahi y compañeros de trabajo encontraron que el lipopéptido provocó una respuesta polarizada Th1 inmune [24]. Imanishi y colaboradores mostraron que la pAM3-CysSK4 y MALP-2 como un activador específico de la función de las células Th1 e implican la participación en respuestas mediadas por Th1 [25].
Hemos demostrado que un lipo-inmunógeno podía con éxito mejorar la generación de anticuerpos neutralizantes contra el virus del dengue [4], [7]. Aquí, se utilizó rlipo-E7M para demostrar que los inmunógenos de lipoproteínas puede inducir respuestas de CTL específicos de tumores. Es importante destacar que este enfoque avanzado proporciona un diseño racional para inmunoterapias de cáncer para el futuro. Creemos que este lipo-inmunógeno-enfoque puede ser convertido en un nuevo bajo costo y un tratamiento eficaz para los cánceres asociados al VPH. Por otra parte, la estructura de los lípidos en sí es un agonista de TLR2 [26] y puede pasar por el proceso de despliegue y replegado durante la preparación, sin afectar su función. Esta ventaja permite lipo-inmunógenos recombinantes para retienen más flexibilidad y permite la producción de inmunógenos robusto lipidados. A pesar de la aprobación de OspA lipidada fue interrogado sobre las respuestas artritógenas causados por el mimetismo molecular de OspA, no se plantearon cuestiones de seguridad en relación con el resto lipídico de lipo-inmunógenos recombinantes [27]. En nuestra tecnología de plataforma, hemos optimizado los procesos anteriores y posteriores a la producción de lipoproteína recombinante, rAg473 de
Neisseria meningitidis del grupo B
, y caracterizado la rAg473 utilizando los procesos optimizados [28]. Los animales de toxicología y estudios pre-clínicos de rAg473 se han terminado y que ya proporcionado los datos de seguridad a Taiwán Food and Drug Administration para su aplicación nuevo fármaco en investigación (IND).
Con el fin de inducir respuestas de CTL, en proteínas inmunógenos basados normalmente debe formularse con adyuvantes (examen [3] [29]). Por ejemplo, el ISCOMATRIX basados en saponina adyuvante [30] y el liposoma-policatiónico-DNA (LPD) adyuvante [31] han demostrado mejorar las respuestas de CTL de las vacunas a base de proteínas de VPH. HPV-16 E7 se ha fusionado a un fragmento de
Haemophilus influenzae
proteína D formulado en un sistema adyuvante que contiene monofosforil lípido A y QS-21 saponina adyuvante [32]. Recientemente, Nventa biofarmacéuticos (adquiridas por Akela Pharma) informó que la eficacia de HspE7 se vio reforzada por el adyuvante Po1y-ICLC, y este hallazgo sirvió como la base para los ensayos de fase 1 clinica1 [3]. A pesar de los recientes avances en el campo adyuvante han proporcionado varios candidatos de adyuvantes potentes y útiles, el desarrollo de adyuvantes eficaces y seguros para uso humano sigue siendo un desafío [33]. Nuestro enfoque evita el obstáculo de la utilización de adyuvante, sugiriendo que podría proporcionar un nuevo método para perseguir el desarrollo de vacunas terapéuticas.
En conclusión, hemos demostrado que biológicamente la fusión de un antígeno tumoral con un resto lipídico bacteriana rendido este antígeno capaz de estimular la BM-DC a través de TLR2, la inducción de una respuesta inmune Th1, inducción de respuestas de CTL específicas de antígeno, y la generación de inmunidad de tumor protectora en un modelo de tumor de ratón. rlipo-E7M puede, pues, ser un candidato a vacuna terapéutica prometedora contra los tumores asociados al VPH. Por otra parte,
E. coli
se ha utilizado como un sistema de producción estable para productos biológicos, y esta tecnología lipidación se puede aplicar fácilmente a otros antígenos de tumor asociado con algunas limitaciones. Esta estrategia puede proporcionar un método para el desarrollo de inmunoterapias con éxito utilizando los candidatos a base de proteínas y se espera producir las vacunas de seguridad y eficaces para el uso humano.
Materiales y Métodos
Productos químicos
Todos los productos químicos fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO) y Merck (Darmstadt, Alemania). Las enzimas de restricción y la ligasa se adquirieron de New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA). Los cebadores utilizados para la clonación fueron adquiridos de Misión Biotech, Inc. (Taipei, Taiwán). La tripsina y la matriz utilizada para el análisis de espectrometría de masas se adquirieron de Promega Co. (Madison, WI).
Líneas celulares y Medio
TC-1, una línea de células epiteliales de ratón transformadas con los oncogenes Ras, HPV16 E6 y E7, fue una especie de regalo del Dr. TC Wu (Universidad Johns Hopkins). células TC-1 se cultivaron en DMEM (GIBCO-BRL, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero inactivado por calor bovino fetal (Hyclone, Logan, Utah), penicilina (100 unidades /ml) y estreptomicina (100 g /ml ). Medio completo RPMI-10 contenía RPMI-1640 suplementado con 10% (v /v) de suero inactivado por calor fetal de ternera, HEPES 25 mM, 4 mM L-glutamina, 100 unidades /ml de penicilina, 100 mg /sulfato de estreptomicina ml y 50 micras . β-mercaptoetanol
Fundamentos para el Diseño de Inactivo E7 del VPH (E7M)
el HPV E7 oncoproteína contiene tres regiones conservadas: dominios CR1, CR2, CR3 y [34].