Extracto
Distribución de drogas en las células es una variable fundamental importancia, aunque a menudo se pasa por alto, en la eficacia del fármaco. Muchos agentes anticancerígenos básicos débilmente acumulan ampliamente en los lisosomas ácidas de las células normales a través de captura de iones. atrapamiento lisosomal reduce la actividad de medicamentos contra el cáncer, ya que objetivos de medicamentos contra el cáncer a menudo se localizan en el citosol de la célula o núcleo. Algunas células de cáncer tienen la acidificación defectuosa de los lisosomas, que causa una redistribución de fármacos atrapados desde los lisosomas en el citosol. Hemos establecido previamente que tales diferencias en la localización de drogas entre células normales y cancerosas pueden contribuir a la selectividad aparente de fármacos débilmente básicos para las células cancerosas
in vitro
. En este trabajo, hemos probado si esta selectividad de fármacos basado en la distribución intracelular podría ser optimizado basado en la constante de disociación ácida (pKa) del fármaco, que es uno de los factores determinantes de la capacidad de secuestro de lisosomal. Se sintetizaron siete análogos estructurales débilmente básicos de la geldanamicina inhibidor de Hsp90 (GDA) con valores de pKa que van de 5 a 12. La selectividad de cada análogo se expresó mediante la adopción de proporciones de anti-proliferativa IC
50 valores de los inhibidores en los fibroblastos normales a la IC
50 valores en células HL-60 leucémicas humanas. evaluaciones de selectividad similares se realizaron en un par de líneas celulares de cáncer que diferían en el pH lisosomal como resultado de la alteración mediada por siRNA de protones vacuolar expresión ATPasa subunidad. Se observó una selectividad óptima para análogos con valores de pKa cerca de 8. Se observaron tendencias similares con agentes anticancerígenos comerciales con diferentes valores de pKa débilmente básicos. Estas evaluaciones avanzar en nuestra comprensión de cómo débilmente propiedades básicas se pueden optimizar para lograr la máxima selectividad medicamento contra el cáncer frente a las células de cáncer con la acidificación defectuosa lisosomal
in vitro
. Adicionales
in vivo
estudios son necesarios para examinar la utilidad de este enfoque para la mejora de la selectividad
Cita:. Ndolo RA, Luan Y, Duan S, ML Forrest, Krise JP (2012) Propiedades lisosomotrópicos de agentes contra el cáncer débilmente básico Promover Cancer Cell Selectividad
in vitro
. PLoS ONE 7 (11): e49366. doi: 10.1371 /journal.pone.0049366
Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos de América
Recibido: 1 de junio de 2012; Aceptado: 10 Octubre 2012; Publicado: 7 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Ndolo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por el NIH RO1 CA106655 subvención (http://grants.nih.gov/grants/oer.htm). La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Muchos fármacos contra el cáncer sufren de mala selectividad a las células diana, dando lugar a un alto grado de toxicidad y efectos secundarios potencialmente peligrosas para la vida; Por lo tanto, la quimioterapia a menudo se detuvo antes de tiempo, lo que reduce las posibilidades de que un fármaco que realice su pleno potencial. Los fármacos anti-cáncer típicamente poseen algún grado de selectividad intrínseca hacia las células de cáncer debido a la bioquímica y /o diferencias metabólicas entre las células normales y transformadas [1] - [3]. La selectividad intrínseca de un agente contra el cáncer se puede mejorar adicionalmente usando una variedad de enfoques de administración de fármacos basado en propuesto "bala mágica" de Ehrlich [4], [5]. Todas estas estrategias dirigidas comparten un requisito común, que es que el agente citotóxico activo debe acumularse en mayor medida en o alrededor de las células transformadas en relación con las células normales. A pesar de numerosas estrategias creativas han sido examinados, tales como las estrategias de profármaco y conjugados anticuerpo-fármaco, su utilidad terapéutica ha sido un tanto limitado [6].
La distribución intracelular de un fármaco es una consideración de importancia fundamental para la eficacia del fármaco. Las células de mamíferos son ampliamente compartimentada, y ambos fármacos y sus dianas pueden tener patrones de localización intracelulares específicos y discretos. Por consiguiente, para el efecto terapéutico deseado que se produzca, el sitio intracelular de localización de medicamentos debe ser la misma, a un cierto grado, como la de la diana de fármaco. Nosotros y otros han demostrado previamente que las propiedades físico-químicas de las drogas pueden influir en su patrón predecible localización intracelular [7] - [10]. Además, hemos demostrado que un solo fármaco puede tener sustancialmente diferentes patrones de localización y tráfico intracelular en diferentes tipos de células [11], [12].
La selección intencionada de medicamentos contra el cáncer a los compartimentos intracelulares en células de cáncer representa un área emergente de exploración [13], [14]. Por ejemplo, las mitocondrias tienen un potencial de membrana negativo asociado a su membrana interna, que se ha demostrado para impulsar la acumulación de fármacos con carga catiónica deslocalizado [15]. En este sentido, los derivados de los inhibidores de Hsp90 se han desarrollado para explotar este hallazgo y por lo tanto orientar selectivamente una forma mitocondrial de Hsp90 [16].
Alternativamente, muchos fármacos débilmente básicos con cargas catiónicas localizadas han demostrado ser ampliamente secuestradas en lisosomas ácidas de las células a través de un mecanismo de captura de iones, y las propiedades de la célula y de medicamentos que influyen en este han sido revisados [17]. Brevemente, el pH de los lisosomas, en relación con el pH de la citosol, es uno de los parámetros fisiológicos clave que dicta el grado previsto de acumulación lisosomal [12], [17]. Cuanto mayor es el gradiente de pH-lisosoma-a citosol, mayor es el grado de secuestro de lisosomal es. Para muchas aminas, atrapamiento lisosomal ha demostrado ser bastante amplia, y se cree que la aproximación de la acumulación celular total [18]. Desde objetivos de medicamentos rara vez se localizan en los lisosomas, el extenso captura de bases débiles en este compartimiento puede reducir en gran medida las interacciones de destino, reduciendo así la actividad del fármaco.
Curiosamente, nosotros y otros han demostrado que varios tipos de células cancerosas tienen una lisosomal acidificación defecto [19] - [22]. En algunos casos, el pH lisosomal de las células cancerosas se ha informado de que 2 unidades de pH mayor que el pH lisosomal de las células normales [22]. Esta elevación del pH lisosomal se predice que tienen un profundo impacto en la distribución intracelular de aminas débilmente básicas que son sustratos para atrapar iones en los lisosomas (agentes lisosomotrópicos). Específicamente, la concentración de dichos fármacos disminuirá en los lisosomas de tales células y aumentar de forma concomitante en el citosol, así como en otros compartimentos extralysosomal. Proponemos que esta diferencia en el comportamiento de distribución de drogas facilitará una mejora en la actividad del fármaco en las células cancerosas con respecto a las células normales.
Hemos establecido previamente las bases de este fármaco basado en la distribución intracelular (BID) dirigidos a la plataforma utilizando tanto
in vitro
y
in vivo
enfoques [12], [23], [24]. El uso de células que crecen en cultivo, se midió cuantitativamente las relaciones de concentración-lisosoma-a citosol de las drogas en las células con bajo o elevado pH lisosomal. Débilmente fármacos básicos contra el cáncer, se mostró a redistribuir de los lisosomas al citosol cuando el pH lisosomal fue elevado. Esta redistribución intracelular de fármacos dio lugar a citotoxicidad más pronunciada hacia las células con niveles elevados de pH lisosomal. Es importante destacar que estos cambios en la distribución intracelular y la toxicidad no se observaron para medicamentos contra el cáncer sin propiedades lisosomotrópicos. Más recientemente, hemos establecido la base para la orientación por plataforma del BID en ratones mediante la evaluación del grado de toxicidad inducida por el fármaco en ratones con bajo o elevado pH lisosomal experimentalmente [24].
En este informe, en concreto cuestionado si el lysosomotropic potencial de un medicamento contra el cáncer correlacionado con el grado de selectividad BID. Esta es una consideración muy importante que podría guiar el diseño racional de nuevos agentes contra el cáncer con propiedades que optimizan lysosomotropism y selectividad, por tanto, BID, o la modificación de los medicamentos existentes para impartir estas propiedades.
Resultados
selección y síntesis de análogos de geldanamicina con un rango de valores de pKa débilmente básicas
Hemos demostrado anteriormente que los medicamentos contra el cáncer débilmente básicas con propiedades lisosomotrópicos exhiben una mayor selectividad hacia las células cancerosas que sus contrapartes no-lisosomotrópicos [12]. En el presente trabajo, hemos probado la predicción de que el potencial lysosomotropic de drogas débilmente básicas se correlaciona con el grado de selectividad diferencial hacia las células cancerosas.
Al abordar esta cuestión, hemos considerado los factores asociados a los fármacos que se sabe que contribuir a lysosomotropism. Todos los sustratos para lysosomotropism basada en la captura de iones son débilmente básico, pero no todas las moléculas débilmente básicas son lysosomotropic. En su comentario sobre el tema, de Duve propuso que dos propiedades independientes asociados con las drogas influyen en el potencial lysosomotropic de un determinado fármaco. El primer parámetro se denomina alfa y representa la relación de permeabilidad de la membrana lisosomal por el medicamento ionizado en su contra formas sindicalizados. Hemos previamente experimentalmente estimado alfa para un número de compuestos mediante la medición de los coeficientes de reparto octanol /tampón como una función del pH y correlacionado estos valores con el secuestro de lisosomal [7]. El segundo parámetro importante asociada a la droga es el pKa del ácido conjugado de la base. Hemos previamente establecida experimentalmente cómo pKa de drogas influyen en el secuestro de los lisosomas en células cultivadas [8].
En este trabajo, se optó por evaluar la influencia de la PKA en la selectividad usando inhibidores de la proteína kD 0 de choque térmico (Hsp90 ) que sistemáticamente varió en su base débil pKa. Elegimos para modificar la posición 17 de la GDA inhibidor de Hsp90 para crear derivados con pKa variada ya que los informes anteriores habían demostrado que las modificaciones a esta posición no alteraron la actividad [25].
Para ayudar a guiar a nuestra selección de derivados con diferentes pKa, se consideró que una relación teórica previamente descrita entre débil pKa base y alfa de la relación-lisosoma-to extracelular concentración [17], que viene dada por la siguiente expresión.
el ácido conjugado de la base débil constante de disociación se denota como K
a, y [H
+] denota la concentración de protones (subíndice e representa extracelular y el subíndice L representa lisosomal). El término alfa (α) denota la relación de las permeabilidades de membrana lisosomal para la base ionizado dividido por el de la especie no ionizada [26]. Usando esta ecuación, se calculó el coeficiente de concentración teórico-lisosoma para extracelular de una serie de fármacos con valores de pKa de 4 a 14. Para los cálculos, se utilizó valores de pH extracelular de 4,4 y 7,4, respectivamente, que son típicos y lisosomal valores para las células normales [27], y un valor alfa de 0,01, lo que habíamos medido previamente para el 17-DMAG, un derivado débilmente básica de GDA [12]. Para demostrar la influencia potencial de la alfa en el secuestro lisosomal, hemos incluido parcelas en las que se varía este parámetro. Trazado de las relaciones de concentración-lisosoma-a extracelular predichos contra pKa dio una curva en forma de campana, por lo que el grado máximo de secuestro lisosomal y el pKa en la que esto ocurrió fueron sensibles a la magnitud del parámetro alfa (véase la figura 1). Sobre la base de estas simulaciones, que postula que los agentes contra el cáncer que varían en pKa de aproximadamente 5 a 12 serían caracterizar adecuadamente la influencia de secuestro lisosomal en la selectividad del tumor.
La ecuación utilizada para estas simulaciones se puede encontrar en el texto. El pH de los lisosomas y el espacio extracelular se ha fijado en 4,4 y 7,4, respectivamente. El parámetro alfa se varió como se indica.
Por lo tanto, sintetizado un número de análogos débilmente básicos de GDA en un intento de desarrollar de pequeño conjunto de los derivados que tenían valores de pKa que abarcan este rango. Los derivados de GDA se sintetizaron como se describe en Materiales y Métodos y se caracteriza por
1H-NMR (véase el texto S1). Los valores de pKa para los análogos de 1, 2, 3, 5 y 6 (ver Figura 2 para estructuras químicas) se midieron a 37 ° C utilizando
1H NMR. Para determinar el pKa utilizando este método, los desplazamientos químicos de protones alfa a la amina ionizable se representaron frente al pH, dando curvas sigmoideas (Figura S1) de los que proceda pKa. Para los compuestos 4 y 7, pKa que no se podía medir por
1H NMR ya sea debido a una solubilidad limitada en D
2O y /o picos de protones mal resueltas. Por lo tanto, se presenta un valor de pKa medido previamente para el compuesto 4 que se adquirió usando un enfoque alternativo [12], y se presenta un valor calculado para el compuesto 7 (ver Materiales y Métodos). El compuesto 5 tuvo dos valores de pKa de 9,9 y 4,2. Sólo el valor de pKa más alto se informa en la Figura 2 debido a que el segundo es demasiado baja para contribuir teóricamente a iones atrapar en los lisosomas. En conjunto, los valores de pKa para cada uno de los derivados variaron de 5.8 a la 12.4 (Figura 2).
Los siete derivados con diferentes modificaciones de bases débiles en la posición 17 de la GDA se muestran. Los valores de pKa para los derivados de 1, 2, 3, 5 y 6 se midió experimentalmente usando RMN de protón (n = 1). El pKa para el compuesto 4 se midió experimentalmente en un manuscrito anterior (ver Resultados). El pKa para el compuesto 7 se estimó usando el software (ver Materiales y Métodos). Se muestra la afinidad de unión para cada uno de los inhibidores con rHsp90 (n = 2), y se basó en un ensayo de polarización de fluorescencia previamente establecido (ver Materiales y Métodos).
Para probar adecuadamente la influencia de pKa base débil en la selectividad, todos los derivados de GDA debe conservar cierta capacidad de unión de Hsp90 y actuar como inhibidores. Para evaluar esto, se evaluó la afinidad de unión de cada uno de los derivados para Hsp90 recombinante y comparó la afinidad de unión con la de GDA no modificado. afinidades de unión se estimaron usando un ensayo de polarización de fluorescencia que mide la capacidad de los compuestos de ensayo para desplazar competitivamente GDA conjugado con FITC de Hsp90. Los valores de polarización (MP) se convirtieron a porcentaje de control (sin fármaco) y se representaron frente a la concentración de compuestos de ensayo, produciendo curvas sigmoideas de la que se determinó el IC
50 valor a través de ajuste de curvas (Figura S2). El K
i valores se calcularon a partir del IC
50 valores como se describe anteriormente [28] utilizando una calculadora en línea (disponible gratuitamente en http://sw16.im.med.umich.edu/software/calc_ki/). El calculado IC
50 para GDA no derivatizado fue 230 nM, que es similar a los valores reportados previamente obtenidos utilizando este ensayo [29]. Una comparación de los valores de Ki para GDA y sus derivados sugiere que todos ellos conservan alguna capacidad de unirse Hsp90 y por lo tanto son adecuados para las evaluaciones descritas aquí (Figura 2).
Evaluación de la selectividad basada en la distribución intracelular
Para expresar cuantitativamente la selectividad, que evaluó comparativamente antiproliferativos IC
50 valores en células normales y cancerosas que tenían bajo y elevado pH lisosomal, respectivamente. Para estas evaluaciones, se utilizó la línea celular humana HL60 leucémico, que ya hemos demostrado tener un pH elevado lisosomal [22]. Para las células no transformadas, se utilizó fibroblastos de prepucio humanos normales que previamente se había determinado que tienen un pH lisosomal de 4,4 [22]. Las curvas de citotoxicidad y IC
50 valores obtenidos a partir de ellos se muestran en la Figura S3. Al dividir el IC
50 determinó en las células normales por el IC
50 en células de cáncer, se obtuvo la selectividad global (Figura 3). El inhibidor de la GDA no lysosomotropic tenía una selectividad general de casi dos, lo que indica que la GDA fue casi dos veces más activo en la línea celular leucémica como lo fue en las células normales. Curiosamente, los inhibidores de la PKA débilmente básicas con valores cercanos a 8 tenían varias veces mayor actividad en las células leucémicas con elevado pH lisosomal en comparación con las células normales. Los análogos de GDA que tenían valores de pKa por encima o por debajo de 8 tenían ningún aumento aparente de la selectividad hacia las células cancerosas en comparación con GDA no derivado. En general, la influencia de pKa en la selectividad tiende a producir una distribución en forma de campana que fue similar a la trama teórica correlacionar pKa con lysosomotropism (Figura 1).
Selectividad global representa la IC
50 para un derivado de fibroblastos humanos normales, dividido por el valor obtenido en células leucémicas humanas HL60. Las barras representan la media ± S.D.. (N = 3); *,
p
. & Lt; 0,05 en comparación con GDA
La selectividad es multifactorial, y cualquier medicamento contra el cáncer con éxito debería exhibir mayor actividad hacia las células cancerosas con respecto a las células normales a través de mecanismos que no están relacionados a los cambios en el comportamiento de la distribución intracelular que se evalúan en este manuscrito [2], [3]. Para directamente al examinar la selectividad que pueden ser atribuidos específicamente a los cambios en el comportamiento de la distribución intracelular entre las células normales y transformadas, consideramos que es imprescindible para comparar la actividad antiproliferativa de un fármaco administrado en dos líneas celulares que son por lo demás idéntica pero tienen baja (normal) y elevado (similar al cáncer) lisosomal pH. Este enfoque sería más deseable ya que cualquier variabilidad entre células en los factores que pueden influir en la actividad del fármaco (por ejemplo, la expresión de transportadores de salida de drogas) sería mitigado.
Aunque muchas líneas celulares de cáncer han demostrado tener la acidificación defectuosa de los lisosomas, se encontró que un número de ellos a mantener los lisosomas normalmente acidificadas. Por ejemplo, la línea celular de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 mantiene un pH lisosomal de 4,2, similar al pH lisosomal de la mayoría de las células normales [27]. El uso de esta línea celular, se exploró un enfoque de siRNA para elevar transitoriamente el pH lisosomal. Lisosomal pH está regulado por la ATPasa vacuolar de protones (VH
+ - ATPasa) [30], y Lu y colaboradores han demostrado previamente que la reducción de la expresión de una subunidad de esta enzima, utilizando siRNA, las células dio con alterada V-ATPasa bombeo de protones actividad, sin ningún efecto sobre la proliferación celular [31]. Hemos utilizado una técnica similar para crear MDA-MB-231 células con niveles elevados de pH lisosomal. En concreto, nos centramos en la subunidad V1E1 de V-ATPasa de caída usando vector lentiviral shRNA. La transferencia lentiviral mediada fue elegido porque este enfoque permite una eficiente, de alto rendimiento y la caída estable de proteínas diana [30]. MDA-MB-231 células que fueron tratadas con partículas lentivirales que contienen no objetivo (codificado) secuencia shRNA retenido bajo pH lisosomal y sirvió como un control importante para los efectos no específicos de la infección lentiviral sobre la viabilidad celular. Desmontables expresión V1E1 en las células que reciben partículas virales diana se confirmó mediante análisis de Western blot (Figura 4A). Es importante destacar que, desmontables de la subunidad V1E1 llevó a efectos perceptibles sobre el crecimiento de las células durante el curso temporal de la IC
50 evaluaciones (Figura 4B). Evaluación experimental de pH lisosomal después de eliminar a la V-H
+ - ATPasa subunidad mostró que lisosomal pH fue significativamente elevado desde pH 4,4 a pH 5,8 (Figura 4A)
A.. Western blot de la expresión de la subunidad V1E1 se muestra junto con el control de carga de actina. determinar experimentalmente los valores de pH en lisosomales sin tratamiento, las células se muestra revueltos (los valores representan la media ± SD, n = 3) B. V-ATPasa subunidad desmontables no altera la tasa de crecimiento de las células MDA-MB 231 shRNA- y V1E1 shRNA-tratada . Los círculos rellenos representan las células tratadas con el vector de shRNA revueltos y los círculos abiertos representan células tratadas con el V-ATPasa V1E1 shRNA. Las células se sembraron a una densidad de 3 x 10
5 células /pocillo en una placa de 6 pocillos y se trataron con tripsina, se contaron y se volvieron a sembrar cada 24 horas durante 3 días (puntos de datos representan la media ± SD, n = 3).
posteriormente evaluó el CI
50 de los inhibidores de Hsp90 en ambos tipos de células (Figura S4) y se calculó la selectividad como IC
50 en MDA-MB-231 células con bajo pH lisosomal dividido por IC
50 en MDA-MB-231 células con niveles elevados de pH lisosomal. En consonancia con nuestras expectativas, la actividad de GDA no lysosomotropic no fue influenciado por el estado lisosomal pH de la célula y, por tanto, no tenía selectividad BID aparente (es decir, valor de selectividad BID cerca de uno, véase la Figura 5). Las tendencias en la selectividad BID como una función de Hsp90 inhibidor de PKA siguieron un perfil similar en forma de campana al igual que los resultados globales de selectividad mostrados en la Figura 3. Por otra parte, la comparación de la magnitud de la BID con selectividad global sugieren que BID selectividad es un importante que contribuye factor a la selectividad global de estos agentes.
selectividad BID se define como la IC
50 en células MD-MB-231 tratadas con shRNA codificados, que tienen un pH bajo lisosomal, dividido por el valor obtenido de la misma línea celular tratados con shRNA contra la subunidad V1E1 de la ATPasa de protones vacuolar, que han elevado pH lisosomal. Las barras representan la media ± S.D.. (N = 3); *,
p
. & Lt; 0,05 en comparación con GDA
Nuestros resultados anteriores son consistentes con la idea de que los inhibidores de Hsp90 con propiedades óptimas lisosomotrópicos (es decir, valores de pKa cerca de 8) poseerá el mayor grado de selectividad BID hacia las células transformadas. A fin de evaluar esto, se evaluó la selectividad del BID de clases adicionales de agentes anticancerígenos que hacen o no posean propiedades lisosomotrópicos.
La mitoxantrona y la daunorrubicina son agentes anticancerígenos débilmente básicas que tienen objetivos nucleares y los valores de pKa cerca de 8 [32 ], que debe promover lysosomotropism y selectividad BID. Alternativamente, el antimetabolito 5-fluorouracilo es débilmente ácido, con un pKa de 8 [33], y por lo tanto no se considera un sustrato para la captura de iones en los lisosomas ácidos. por lo tanto, 5-fluorouracilo, además de no tener distribución intracelular ni actividad que está influenciado por el estado lisosomal pH de una célula. Del mismo modo, los agentes anticancerígenos que son de ion híbrido, con ambos grupos débilmente ácidos y débilmente básicas, tales como clorambucil [34], no se lisosomotrópicos y no debe exhibir selectividad BID. En consonancia con el razonamiento, los agentes anticancerosos no lisosomotrópicos 5-fluorouracilo y clorambucil tenían valores de selectividad BID cerca de uno, similar a la GDA (Figura 6). Alternativamente, los agentes lisosomotrópicos mitoxantrona y daunorrubicina ambos mostraron grados significativos pero diferentes de selectividad BID (Figura 6). Las curvas de citotoxicidad de estas evaluaciones se muestran en la Figura S5
.
La mitoxantrona y la daunorrubicina son débilmente básico con pKa valores cerca de 8 y tienen selectividad BID significativo. agentes contra el cáncer no lisosomotrópicos 5-fluorouracilo y clorambucil tienen valores de selectividad BID cerca de 1, lo que demuestra que su actividad no se ve influenciada por el pH lisosomal. Las barras representan la media ± S.D.. (N = 3).
Discusión
En este estudio hemos, por primera vez, investigado sistemáticamente cómo el pKa de agentes anticancerígenos influencias débilmente básicas del grado de selectividad hacia BID las células cancerosas con niveles elevados de pH lisosomal. Proponemos que el fármaco BID focalización plataforma presenta un cambio de paradigma en el enfoque de diseño de nuevos agentes contra el cáncer con selectividad mejorada y optimizada para las células tumorales. Tradicional SAR enfoques para la mejora de la selectividad enfoque principalmente al diseño de fármacos con mayor potencia contra las células cancerosas, prestando poca atención a la actividad del fármaco en las células normales. La mayoría de los enfoques basados en la administración de fármacos que tratan de aumentar la selectividad se basan en la acumulación del fármaco /entrega específico de tumor, que ha demostrado ser muy desafiante y difícil de alcanzar. El enfoque de dirección de fármaco BID descrito aquí permite que el fármaco para distribuir por igual a ambas células normales y transformadas; sin embargo, el índice terapéutico de drogas se ensancha mediante el diseño a propósito el medicamento tener desfavorables propiedades de distribución intracelular en células normales, lo que reduce la actividad del fármaco en estas células.
Nuestro estudio anterior había establecido que las moléculas lisosomotrópicos tenían selectividad BID medible, pero no quedó claro si el grado de lysosomotropism correlaciona con el grado de selectividad BID. Nuestra hipótesis principal en este estudio fue que los agentes contra el cáncer con propiedades óptimas lisosomotrópicos tendrían selectividad BID óptima. Inicialmente se utilizaron los principios de captura de iones para establecer teóricamente las relaciones entre las propiedades de base débil de fármacos, específicamente la permeabilidad (alfa) y pKa, y el secuestro de los lisosomas (véase la Figura 1). Estos cálculos fueron reveladores y sugirió que las moléculas débilmente básicas con baja alfa y pKa cerca o por encima neutralidad tendrían propiedades óptimas lisosomotrópicos
Nuestras predicciones teóricas ilustran que el parámetro alfa permeabilidad representa un importante predictor de secuestro lisosomal.; sin embargo, no es un parámetro físico que puede ser racionalmente y sistemáticamente cambió para poner a prueba la relación entre lysosomotropism y selectividad BID. Hemos previamente experimentalmente estimado alfa mediante la medición de los coeficientes de reparto octanol /agua como una función del pH y se encontró que las moléculas ya sea tendían a tener parámetros alfa cerca de cero o cerca de uno [7]. Aunque la alfa puede variar de cero a uno, nuestras predicciones teóricas revelado que cambios relativamente pequeños en los valores de alfa cerca de cero tuvieron un profundo impacto en la relación entre la base débil de pKa y la magnitud de la captura de lisosomal (Figura 1). Actualmente no está claro cuáles son las características estructurales podrían ser responsables de tales perturbaciones menores en el parámetro alfa (es decir, 0,01 frente a 0,001).
A diferencia del parámetro alfa, pKa representa una propiedad física que puede ser modificado de forma racional para probar la relación entre lysosomotropism y selectividad. Para investigar sistemáticamente la influencia de base débil pKa en la selectividad del BID, se sintetizó una pequeña biblioteca de análogos de GDA generados mediante la modificación de GDA en la posición 17. Estos análogos de GDA fueron particularmente adecuado para tal aplicación porque numerosos análogos formados por modificaciones sintéticas en esta posición se ha demostrado que conservan su capacidad de unirse e inhibir con Hsp90 [25]. Además, GDA tiene un objetivo citosólica, y por lo tanto, la actividad de análogos de GDA debe ser sensible a los cambios en el secuestro de lisosomal. Se sintetizaron análogos débilmente básicos de GDA con valores de pKa que varían desde 5,8 hasta 12,4, y se observó que todos ellos parecían retener cierta capacidad para unirse rHsp90 como GDA no modificada (Figura 2). Es importante tener en cuenta que las diferencias en la afinidad de unión intrínseca Hsp90 entre los diversos derivados pueden influir de hecho la magnitud de un IC
50 valor observado experimentalmente en una única línea de células; Sin embargo, estas diferencias no deben influir en teoría, nuestras comparaciones de selectividad que se presentan en las figuras 3 y 5. Esto se debe a que se presenta la relación de IC
50 valores para un único fármaco en las células con bajo o elevado pH lisosomal, la factorización de este modo cualquier diferencia en la actividad intrínseca que pueda estar presente.
el uso de shRNA para crear variantes de las líneas de células MDA-MB-231 que diferían en el pH lisosomal representa una valiosa herramienta para probar directamente BID selectividad. En nuestras evaluaciones publicados anteriormente, hemos utilizado comparativos IC
50 evaluaciones en dos líneas celulares diferentes con un bajo o elevado pH lisosomal [12]. Además, se utilizó un modulador farmacológica de pH lisosomal (es decir, cloruro de amonio) para lograr la elevación del pH lisosomal. Ambos enfoques tienen limitaciones debido a que las diferencias en la citotoxicidad pueden atribuirse a las diferencias en las líneas celulares o a la adición del modificador de pH y no específicamente a las diferencias en el pH lisosomal.
El análogo GDA con un medido pKa de 8,1 se encontró que tienen el máximo grado de selectividad BID. análogos de GDA con valores de pKa muy por encima o por debajo de 8 mostraron selectividad mínima, lo que es consistente con la noción de que lisosomotrópicos correlaciones potenciales con selectividad BID. Para evaluar la selectividad global de los análogos de GDA, se comparó la proporción de IC
50 valores en los fibroblastos normales frente a en-60 HL células leucémicas, que se ha demostrado que han elevado lisosomal pH [22]. Curiosamente, la tendencia de la selectividad global de los análogos de GDA fue similar en apariencia y la magnitud con los resultados de selectividad del BID. Este hallazgo sugiere que la selectividad BID puede representar un factor importante que contribuye a la selectividad general.
A fin de evaluar la influencia de lysosomotropism en la selectividad del BID, que probaron la correlación utilizando agentes anticancerígenos disponibles en la actualidad que tenían diferentes estructuras, y dianas intracelulares mecanismos de acción de las de los inhibidores de Hsp90 previamente evaluadas (Figura 5). De acuerdo con nuestra hipótesis, la agentes contra el cáncer no lisosomotrópicos 5-fluorouracilo y clorambucil no mostraron selectividad BID apreciable. En contraste, se encontró que los agentes anticancerígenos débilmente básicas con pKa valores cerca de 8 a poseer selectividad BID. Específicamente, los fármacos mitoxantrona y daunorrubicina débilmente básico, que tienen valores de pKa de 8,1 y 8,4, respectivamente, se encontraron tanto poseer grados significativos de selectividad BID. Es interesante observar que la daunorrubicina tenía una selectividad BID significativamente mayor que la mitoxantrona lo hizo. Esto podría atribuirse al hecho de que el pKa de la daunorrubicina es ligeramente mayor que el pKa de la mitoxantrona y que los cambios relativamente menores en pKa puede traducirse en aumentos bastante significativo en la selectividad BID. También es plausible que podría haber ligeras variaciones en el parámetro alfa de la permeabilidad de estos dos compuestos que podrían resultar en alteraciones dramáticas en lysosomotropism como se determinó teóricamente (Figura 1). Además de estos fármacos, muchos otros agentes anticancerosos clínicamente aprobados se pueden clasificar moléculas básicas como débilmente. Por lo que sabemos, actualmente no hay evidencia clínica para apoyar la idea de que sus propiedades débilmente básicos contribuye a su selectividad observada
.
Es importante hacer hincapié en que la plataforma de dirección de fármaco BID descrito aquí no será de aplicación universal para todos los tipos de cáncer. Un requisito obvio para la aplicación exitosa es que las células cancerosas tienen un defecto lisosomal acidificación. Nosotros y otros han demostrado que muchos tipos de células cancerosas tienen diferentes defectuoso pH lisosomal [19] - [22]; Sin embargo, como hemos ilustrado en este manuscrito, algunas células de cáncer, tales como la línea celular de MBA-MB-231, tienen valores de pH lisosómicas que son similares a los de las células normales.