Extracto
cáncer de páncreas (CP) sigue siendo una de las neoplasias humanas más letales con mal pronóstico . A pesar de todos los avances en la investigación preclínica, no ha habido traducción significativo de nuevas terapias en las clínicas. El desarrollo de ratón genéticamente modificado (GEM) modelos que producen adenocarcinoma pancreático espontánea (PDAC) han incrementado nuestra comprensión de la patogénesis de la enfermedad. Aunque estos modelos de ratón PDAC son ideales para estudiar posibles terapias y mutaciones genéticas específicas, existe una necesidad para el desarrollo de líneas de células singénicas de estos modelos. En este estudio, se describe el establecimiento exitoso y caracterización de tres líneas celulares derivadas de dos (PDAC) modelos de ratón. La línea celular de ONU-KC-6141 se derivó de un tumor pancreático de un Kras
G12D; Pdx1-Cre (KC) de ratón a las 50 semanas de edad, mientras que ONU-KPC-960 y ONU-KPC-961 líneas celulares eran derivadas de tumores pancreáticos de Kras
G12D; Trp53
R172H; Pdx1-Cre (KPC) ratones a las 17 semanas de edad. Las mutaciones del cáncer de estos ratones padres traspasadas a las líneas de células hijas (es decir,
Kras
G12D
se observó mutación en las tres líneas celulares, mientras que
Trp53
mutación se observó sólo en células KPC líneas). Las líneas celulares mostraron típica morfología del epitelio de adoquines en la cultura, ya diferencia de la línea celular de ratón PDAC previamente establecido Panc02, expresaron el marcador CK19 ductal. Por otra parte, estas líneas celulares expresan los marcadores epiteliales-mesenquimales E-cadherina y N-cadherina, y también mucinas, MUC1 y Muc4. Además, estas líneas celulares eran resistentes al fármaco quimioterapéutico gemcitabina. Su implantación
in vivo
producido subcutánea, así como tumores en el páncreas (ortotópico). Las mutaciones genéticas en estas líneas celulares imitan el compendio de la genética humana PDAC, que los hacen valiosos modelos con un alto potencial de relevancia de traslación para el examen de marcadores de diagnóstico y medicamentos terapéuticos
Visto:. Torres MP, Rachagani S, Souchek JJ, Mallya K, Johansson SL, Batra SK (2013) las líneas celulares del cáncer pancreático Novel derivados de Ingeniería Genética modelos de ratón de adenocarcinoma pancreático espontánea: Las aplicaciones en diagnóstico y terapia. PLoS ONE 8 (11): e80580. doi: 10.1371 /journal.pone.0080580
Editor: H. Fazlul Sarkar, Wayne Facultad de Medicina de la Universidad del Estado, Estados Unidos de América
Recibido: 20 Agosto, 2013; Aceptado: 14 Octubre 2013; Publicado: noviembre 20, 2013
Derechos de Autor © 2013 Torres et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue, en parte, con el apoyo de subvenciones del NIH (U54 TMEN CA163120, EDRN UO1, CA111294, CA127297 SPORE P50, RO1 CA133774, RO1 CA78590 y CA167342 SR3). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de muchos avances en la comprensión de los mecanismos moleculares implicados en la patogénesis del cáncer de páncreas (PC) durante las últimas cuatro décadas, la enfermedad sigue siendo una de las principales enfermedades malignas con peor pronóstico [1]. Estas sombrías estadísticas son un recordatorio constante de la necesidad urgente de elucidar los mecanismos aún no descubiertas de la patología PC que contribuirán a mejorar los regímenes de diagnóstico y tratamiento. Para este propósito, el desarrollo de modelos preclínicos es de vital importancia, ya que son críticos para la evaluación de nuevas estrategias terapéuticas [2]. tumores de xenoinjertos en ratones desnudos atímicos son modelos preclínicos útiles, pero no pueden proporcionar la función de los mecanismos inmunológicos que pueden añadir a, o interferir con la acción de los candidatos terapéuticos. Más recientemente los ratones, genéticamente manipulados (GEM) modelos que producen los adenocarcinomas de páncreas espontáneas (PDAC) han avanzado en gran medida nuestra comprensión de la patogénesis de PC y también, permitió el examen de nuevos enfoques terapéuticos [3] - [6]. Además, las líneas celulares singénicas pueden ser aislados de tumores pancreáticos producidos por los modelos GEM y se utilizan para
in vitro
y
in vivo
ensayos de cribado en. El análisis de las funciones y características de las mutaciones genéticas específicas y biomarcadores de PC presentes en estas líneas celulares puede arrojar luz sobre el diseño de estrategias diagnósticas y terapéuticas prometedoras.
Las mutaciones en
KRAS
,
CDKN2A
,
TP53
, y
SMAD4 /DPC4
genes son comúnmente observados en los tumores de pacientes PDAC PC [7]. En consideración de estos resultados, varios modelos de ratón que producen PDAC espontánea, han sido diseñados en la última década [3], [4], [6]. El presente estudio se centra en ratones portadores de
Kras Opiniones y
Trp53
mutaciones. El papel oncogénico de
Hoteles en Ras PC fue examinado por dirigir la expresión endógena de
Kras
G12D Hoteles en las células progenitoras de páncreas en Kras
G12D; Pdx1-Cre (KC ) ratones [3], mientras que el papel de la expresión endógena de
Trp53
R172H
y
Kras
G12D
fue examinado en el páncreas de Kras
G12D; Trp53
R172H; Pdx1-Cre (KPC) los ratones [4]. Los resultados indican que los tumores pancreáticos espontáneos producidos por estos modelos de ratón recapitulan las características clínicas, histopatológicas y genómicos de PDAC humano.
líneas celulares de ratón PDAC con mayor relevancia clínica de PC son muy necesarios. La línea celular Panc02 disponibles en la actualidad se ha utilizado en los últimos tres decenios [8]. Fue derivado de tumores PDAC inducidos mediante la implantación de 3-metil-colantreno (3-MCA) saturados hilos de algodón en el páncreas de ratones C57BL /6. A pesar de su uso generalizado en la evaluación de diferentes estrategias terapéuticas, las células carecen de Panc02 fuerte importancia clínica para PC debido a la ausencia de espectro mutacional en comparación con la enfermedad humana. En consecuencia, el éxito en la traducción de las terapias indicadas por este modelo ha sido limitada. En este manuscrito, se describe la generación y caracterización de tres nuevas líneas de células PDAC derivadas de los modelos espontáneos de ratón de PC. Una línea celular se deriva de un ratón KC a 50 semanas de edad, y otros dos fueron derivados de ratones KPC a las 17 semanas de edad. El establecimiento exitoso y
in vitro e
in vivo
caracterización de estas líneas celulares están ampliamente descritas, incluyendo los marcadores actualmente conocidos para los tumores pancreáticos.
Materiales y Métodos
establecimiento de líneas celulares
El medio completo consistía en DMEM que contenía FBS inactivado por calor, L-glutamina (200 mM), 100x aminoácidos no esenciales (100 mM), bicarbonato de sodio, tampón HEPES, gentamicina (50 mg /ml), y penicilina /estreptomicina (100 mg /ml). Inmediatamente después de la resección del tumor, 200 mg de tejido tumoral pancreática se transfirió a una placa de Petri que contiene PBS estéril y gentamicina (20 mg /ml).
Los tejidos recogidos se lavaron 3 veces con PBS-gentamicina y se transfiere a una placa de Petri que contiene el medio completo. El tumor fue finamente picada con un bisturí estéril y se transfiere a un tubo de centrífuga estéril con medio completo que contenía colagenasa P (Roche, Indianapolis, IN) (10 mg /ml) .La mezcla se incubó a 37 ° C durante 30 min. Los tubos se invierten cada tres minutos para asegurar una mezcla adecuada. Después de dos ciclos de lavado en medio completo, el sedimento obtenido después de centrifugación se suspende en el medio completo. Después de dejar reposar el tubo durante 2 min, la suspensión de células sin restos de tejido se transfirió a un nuevo plato estéril 10 cm Petri
.
Después de incubar durante la noche a 37 ° C en 5% de CO
2, el medio se reemplazado con medio fresco. Las células se trataron con tripsina una vez confluentes. Para evitar el crecimiento de fibroblastos, tripsinización diferencial se llevó a cabo, en que se añadió tripsina a las células y después de 10 segundos, las células se lavaron con PBS y se añadió medio fresco. Además, el medio se complementa con la toxina del cólera (400 ng /ml) durante los primeros 7 pasajes como lo ha sido previamente informado de que tiene un efecto mitogénico mejorada en las células epiteliales, pero no en células de fibroblastos [9]. Después de 10 pasajes, las líneas de células se transfirieron a medio completo normal (es decir, medio DMEM suplementado con 10% FBS, 100 g /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina) y se mantuvieron a 37 ° C y 5% de CO
2 en un incubador humidificado. Tres líneas celulares se establecieron con éxito. La línea celular derivada de un Kras
G12D; Pdx1-Cre (KC) de ratón fue nombrado ONU-KC-6141 y las dos líneas celulares derivadas de Kras
G12D; Trp53
R172H; Pdx1-Cre (KPC ) ratones fueron nombrados ONU-KPC-960 y ONU-KPC-961 (de la ONU designa la Universidad de Nebraska Medical Center).
in vitro
su caracterización y estudio oncogénicas fueron hechas después de 35 pases en cultivo celular. La línea celular murina PDAC Panc02 se incluyó en los
ensayos funcionales in vitro
.
La secuenciación de Líneas Celulares para
Kras
y
p53
mutaciones
Los cultivos sub-confluentes de ONU-KC-6141, ONU-KPC-960, y ONU-KPC-961 se lisaron con una solución de lisis celular que contiene beta-mercaptoetanol y el ARN total se aisló con RNeasy Minikit (Qiagen, Germantown , MD). Se sintetizó ADNc a partir del ARN total usando oligo (dT) 18 del cebador y transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies ™, Carlsbad, CA). amplificación por PCR de murino
Kras
codón 12 (exón 1) y
p53
codones 172 (exón 5) se llevó a cabo mediante el uso conjunto de cebadores para cada gen (
Kras
-seqF: 5'-ACTTGTGGTGGTTGGAGCTG-3 ',
Kras
-seqR: 5'-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3',
p53
-seqF: 5'-CACGTACTCTCCTCCCCTCA-3 'y
p53
-seqR: 5'-ATTTCCTTCCACCCGGATAA-3 '), que resulta en un BP 168 (
Kras
) y 229 pb (
p53
) productos de PCR. Los productos de PCR se purificaron con el kit de purificación de producto de PCR (Qiagen, Germantown, MD) y los productos de PCR purificados fueron secuenciados utilizando
Kras
-seqR: 5'-TGACCTGCTGTGTCGAGAAT-3 'para
Kras
y
p53
-seqF: 5'-CACGTACTCTCCTCCCCTCA-3 'para
p53
gen
crecimiento Cinética
para los estudios de cinética de crecimiento, cada línea celular. se sembró por cuadruplicado en una placa de 96 pocillos (1.000 células /pocillo) en medio completo. Después de la incubación durante la noche, el medio se reemplazó con medio suplementado con 1% de FBS y penicilina /estreptomicina (100 mg /ml). Cada día, 10 l de la proliferación de células de reactivo WST-1 (Roche, Indianapolis, IN) se añadió a cada pocillo y después de 3 h de incubación, se midieron los valores de absorbancia a 450 nm. Los valores de absorbancia se restaron de los valores registrados en la longitud de onda de referencia (600 nm), como se indica por el fabricante. El procedimiento se repitió durante 7 días. El tiempo de duplicación (T
D) para cada línea celular se calculó durante la fase de crecimiento exponencial utilizando la fórmula T
D = 0.693t /ln (N
N /T
0), donde t = diferencia de tiempo en h, N
t = valor de absorbancia en el tiempo t, y N
0 = valor de absorbancia a tiempo inicial [10].
PCR en tiempo real
ARN fue aislado y purificado a partir de la ONU-KC-6141, ONU-células KPC-960, ONU-KPC-961, Panc02, y NIH3T3 (fibroblastos de ratón) utilizando el RNeasy Minikit (Qiagen, Germantown, MD). Se sintetizó ADNc a partir del ARN total usando oligo (dT) 18 del cebador y transcriptasa inversa Superscript II (Life Technologies ™, Carlsbad, CA) como se ha descrito por nosotros en una publicación anterior [11]. PCR en tiempo real se realizó en el LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). La amplificación se realiza en un proceso de dos etapas (95 ° C durante 5 min seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 10 seg, y 72 ° C durante 10 seg) utilizando el LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) y el ADNc de cada muestra.
GAPDH
se utilizó como gen de control interno al que se normalizaron todos los genes. El factor de cambio en la expresión génica de
La amilasa
y
CK19
mRNA en líneas celulares de cáncer se compararon con respecto a los niveles de ARNm extraído de páncreas normal de ratón usando el método 2
-ΔΔCt, mientras el factor de cambio
MUC1
y
Muc4
se compararon con respecto al ARNm extraído de la línea celular de fibroblastos de ratón NIH3T3. La secuencia de los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1.
Los anticuerpos
El anti-CK19 hibridoma (TROMA-III) desarrollado por el Dr. Rolf Kemler se obtuvo a partir el Banco hibridoma Estudios del desarrollo desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido en la Universidad de Iowa (Iowa City, IA). Anticuerpo contra murino E-cadherina se obtuvo de Señalización Celular (Danvers, MA). anticuerpo N-cadherina fue una especie de regalo del Dr. Keith R. Johnson de UNMC (Omaha, NE). β-actina y los anticuerpos de amilasa se adquirieron de Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Para los estudios confocales los anticuerpos secundarios conjugados a Alexa se obtuvieron de Life Technologies ™ (Carlsbad, CA) Fluor® (568, 488). Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante utilizado para el análisis de transferencia de Western se obtuvieron de GE Healthcare Life Sciences (Uppsala, Suecia). anticuerpo anti-ratón Muc1 (anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce la cola citoplásmica de MUC1) se adquirió de Abcam® (Cambridge, MA, EE.UU.). El anti-Muc4 (policlonal de conejo-4A) de anticuerpos fue diseñado en este laboratorio y desarrollado por GenScript (Piscataway, NJ, EE.UU.) como se ha descrito anteriormente [12].
Microscopía Confocal
La expresión de proteínas se analizó por microscopía confocal. 2 × 10
5 células en suspensión en medio completo fueron sembradas en cubreobjetos de vidrio colocadas en una placa de 12 pocillos. El día siguiente, las células se fijaron en metanol frío hielo. Después de lavar en PBST y bloquear con 10% de suero de cabra (Jackson ImmunoResearch Labs, West Grove, PA), las células se incubaron con anticuerpos para la amilasa (1: 500), CK19 (1: 1000), E-cadherina (1:50 ), N-cadherina (1:20), y Muc1 (1: 100) durante la noche. Se lavaron cuatro veces con PBST, 5 min por lavado. Las células se incubaron con los respectivos anticuerpos secundarios (ratón /conejo) conjugado con Alexa Fluor (568, 488) (Life Technologies ™, Carlsbad, CA) y después de repetir las etapas de lavado, los cubreobjetos de vidrio se montaron en portaobjetos de vidrio con montaje Vectashield medio (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Las células fueron imágenes en un microscopio confocal láser LSM 510 (Carl Zeiss GmbH, Thornwood, NY) en las respectivas longitudes de onda a un aumento de × 63.
Western Blot Analysis
Para el análisis de transferencia Western , las células se sembraron en cada pocillo de una placa de 6 pocillos en medio completo. En ~ 80% de confluencia, las células se lisaron con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) que contiene la proteasa y los inhibidores de la fosfatasa. Los lisados se sometieron a varios ciclos de congelación-descongelación para asegurar la lisis completa. La concentración de los lisados se determinó con el kit de estimación de proteínas de ácido bicinconínico micro-(Bio-Rad, Hercules, CA). Las concentraciones de proteína se ajustaron y soluciones se prepararon en condiciones reductoras (es decir, β-mercaptoetanol). 2% en geles de SDS-agarosa se utilizaron para el análisis de expresión Muc4. 40 g de proteína lisados se cargaron y el gel se realizó durante fueron analizadas por SDS-PAGE 4 horas a 100 V. E-cadherina y N-cadherina niveles de expresión. 40 g de proteína lisados se cargaron y la separación se realizó a 80 mA durante 1 h. proteínas resueltas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno, bloqueados en 5% de leche en PBS, y se incubaron con los anticuerpos primarios durante la noche. Después de lavar con PBST, se añadieron los anticuerpos secundarios correspondientes y después de repetir las etapas de lavado, las proteínas se detectaron por luminol (Thermo Scientific, Middletown, VA) después de la exposición a películas de rayos X.
Ensayo citotóxico
el efecto citotóxico del fármaco quimioterapéutico gemcitabina en líneas celulares de KC y KPC se comparó con el efecto citotóxico sobre Panc02. La solución inyectable de gemcitabina, Gemzar® (Eli Lilly Company, Indianapolis, IN) fue proporcionado amablemente por la farmacia en el Centro de Trasplante de Lied en UNMC. Para el ensayo citotóxico, 1 × 10
4 células en suspensión en medio completo se sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. El día siguiente, las células se trataron con diferentes concentraciones de solución de gemcitabina (100 nM-100 M) en pocillos por cuadruplicado. Después de incubar las células con gemcitabina durante 48 h, se añadió medio que contenía bromuro de tiazolilo reactivo azul de tetrazolio (Sigma Aldrich, St Louis, MO) a las células. Después de 4 h de incubación, los cristales de formazán producidas por las células metabólicamente activas se disolvieron con 100 l de DMSO. Los valores de absorbancia a 540 nm se utilizaron para calcular los porcentajes de citotoxicidad. Se determinó la concentración inhibitoria semimáxima (IC-50) de la gemcitabina en cada línea celular a partir de la interpolación de los valores en el gráfico (% de citotoxicidad frente a gemcitabina Concentración).
estudios Tumorigenicidad
La tumorigenicidad de las líneas de células se determinó después de la implantación ortotópica de las líneas celulares de ratón de PC (ONU-KC-6141 /ONU-KPC-960 /ONU-KPC-961) en la cabeza del páncreas después de 35 pasajes. Sobre la base de los antecedentes ratones desde donde se generaron las líneas de células, las células de la ONU-KC-6141 (1 × 10
6) se inyectaron en ratones C57BL /6 ratones, mientras que ONU-KPC-960 y las células de la ONU-KPC-961 ( 1 × 10
6) fueron inyectados en el fondo mixto (es decir B6.129) ratones (N = 7). Se inyectaron células de ratón de PC en suspensión en 50 l de PBS estéril ortotópicamente usando el mismo procedimiento descrito por nosotros [13], [14]. el crecimiento de los tumores subcutáneos se evaluó con sólo la línea celular ONU-KPC-961. 5 × 10
se inyectaron 6 células (N = 12) en ratones B6.129 fondo mixto en el lateral del tórax. El crecimiento tumoral se controló mediante medidas de la pinza de palpación /Vernier en el caso de los tumores subcutáneos. A lo largo del experimento, los animales se les proporcionó comida y agua ad libitum y se sometieron a un ciclo de 12 h de oscuridad /luz. Se llevaron a cabo estudios con animales de acuerdo con el Servicio de Salud Pública de EE.UU. "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" en virtud de un protocolo aprobado por la Universidad de Nebraska Medical Center Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC). Después de la eutanasia, los tumores pancreáticos se diseccionaron, se pesaron y se fijaron en formalina al 10% (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) para H & amp; E tinción. lesiones metastásicas brutos fueron examinados en órganos distantes y se procesaron para análisis histológico
tinción con hematoxilina y eosina (H & amp; E).
Después de la fijación de los tejidos en formalina al 10% durante al menos 48 h, los tejidos se incluyeron en parafina cortes de tejido y de serie (4 m de espesor) se cortaron. Las secciones se deparaffinized utilizando EZ-DeWaxTM (Bio genex, San Roman CA, EE.UU.) y rehidratada progresivamente. Posteriormente, las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & amp; E). Manchas y examinadas por un patólogo certificado
Estadísticas
Las diferencias significativas en los valores experimentales se determinaron mediante el cálculo de los valores de p usando el descubrimiento estadístico JMP software (Cary, NC). Se utilizó la prueba t de Student para calcular el correspondiente
p-valor gratis (
los valores de p Hotel & lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos).
Resultados
in vitro
establecimiento de líneas celulares KC y KPC
líneas celulares de ratón de PC se han generado con éxito de los tumores pancreáticos espontáneas producidas por el Kras
G12D; Pdx1-Cre (KC) y el Kras
G12D; Trp53
R172H; Pdx1-Cre (KPC) los ratones a las 50 semanas y 17 semanas de edad, respectivamente. Una línea celular derivada de los ratones KC fue nombrado ONU-KC-6141, y otras dos líneas celulares derivadas de los ratones del CPK fueron nombrados ONU-KPC-960 y ONU-KPC-961. Las tres líneas celulares crecieron durante más de 50 pasajes en los medios normales sin signos de senescencia. Los cultivos monocapa de las tres líneas celulares mostraron la morfología de empedrado típico con la formación de islas contacto cerrado (figura 1A). Para verificar que estas líneas celulares mantienen las mutaciones genéticas de sus respectivos padres ratones (KC y KPC), el estado mutacional de los
Kras gratis (fig. 1B) y
Trp53 gratis (Fig. 1C ) loci se examinó. Como era de esperar, las tres líneas celulares llevan a la
Kras
G12D
mutación puntual, mientras que ONU-KPC-960 y ONU-KPC-961 llevan la mutación
Trp53
R172H
activación .
(A) imágenes microscopio invertido (4X) de ONU-KC-6141, ONU-KPC-960, y ONU-KPC-961 líneas celulares PDAC después de 35 pasajes. Las tres líneas celulares muestran la morfología del epitelio empedrado típico. análisis de la secuencia genética de (B)
Kras
G12D
y (C)
Trp53
R172H
mutación en líneas celulares de ratón de la PC. áreas sombreadas azules representan el codón de donde se encuentra la mutación. Un rectángulo amarillo indica el nucleótido responsable de la mutación. Un páncreas de un Pdx1-Cre ratón (mouse etiqueta de ONU-KPC-1207) se utilizó como control negativo para
Kras
mutación.
La cinética de crecimiento de estos tres ratón de PC líneas celulares fueron comparadas con las células Panc02 (figura 2A). ONU-KPC-961 células proliferaron el más rápido con un tiempo de duplicación (T
D) de 33 h (
p Hotel & lt; 0,0001 en comparación con Panc02). ONU-KPC-960 y Panc02 crecieron a tasas similares (T
D ≈ 60 h), mientras que ONU-KC-6141 mostró que la tasa de crecimiento más lenta (T
D de 70 h) (Figura 2B).
Las células (a) se sembraron en pocillos por cuadruplicado de placas de 96 pocillos y su crecimiento se siguió cada día por medida de la absorbancia después de la incubación con reactivo WST-1. Los datos se representan como la absorbancia media (λ
Muestra = 450 nm, λ
Ref = 600 nm) de cuatro repeticiones ± error estándar. Las estadísticas se calcularon en comparación con la curva de crecimiento para Panc02 (*
p Hotel & lt; 0,01, **
p Hotel & lt; 0,001, ***
p Hotel & lt; 0,0001 ). (B) El tiempo de duplicación (T
D) de la población de células se calculó mediante la ecuación T
D = (0.693t) /ln (N
N /T
0) donde t = Diferencia de tiempo h durante la fase de registro, N
t = valor de absorbancia en el tiempo t, y N
0 = valor de absorbancia en el momento inicial.
KC y líneas celulares derivadas de KPC tienen ductal- como características
se cree
PDAC que surgen de las células epiteliales del conducto pancreático [7]. El páncreas exocrino contiene tanto células acinares y ductales. células acinares pancreáticas se caracterizan por la expresión de la amilasa y la falta de expresión de cualquiera de citoqueratina 19 (CK19) o mucinas, y las células ductales se caracterizan por la expresión de CK19 y mucinas, pero no la expresión de la amilasa [15], [16]. De hecho, estudios previos han reportado tumores pancreáticos de los ratones KC y KPC expresan CK19 y, con frecuencia, mucina, lo que indica su patrimonio ductal [3], [4]. Para validar si nuestras líneas de células derivadas de KC y KPC tenían estas características ductales, se analizó la amilasa y la expresión de CK19 por PCR en tiempo real y microscopía confocal. células Panc02 se incluyeron en estos análisis para la comparación, y se utilizó el tejido pancreático normal para la estimación de la expresión génica relativa. En tiempo real PCR experimentos mostraron alta expresión del marcador ductal CK19 en nuestros tres nuevas líneas de células PDAC (
p
& lt; 0,005) en comparación con Panc02 (Fig. 3A). Para nuestra sorpresa, las células Panc02 no mostraron ninguna expresión de CK19, a pesar de que se ha hecho referencia como una línea celular murina PDAC ductal durante casi tres décadas [8]. Ninguna de las cuatro líneas celulares mostraron expresión amilasa, mientras páncreas normal expresan este marcador acinar. Estos resultados fueron confirmados por análisis de microscopía confocal (Fig. 3B).
(A) en tiempo real PCR análisis de
La amilasa
y
CK19 Hoteles en células de ratón PDAC. Estos transcritos de ARNm se compararon con respecto a los niveles de mRNA en páncreas normal. Los datos representan el aumento medio pliegue de tres repeticiones ± error estándar. Las estadísticas se calcularon en comparación con el páncreas normal (*
p Hotel & lt; 0,005, **
p Hotel & lt; 0,0001). (B) La expresión de la proteína de amilasa y CK19 fueron evaluados en líneas celulares de ratón por PDAC análisis confocal. La amilasa se visualizó después de la tinción con un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor® 568 (rojo fluorescente) y CK19 se visualizó después de la tinción con Alexa Fluor® 488 (verde fluorescente). Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI.
líneas celulares KC y KPC tienen características epitelio-mesénquima
La transición epitelio-mesenquimal induce la pérdida de la adhesión celular, que corresponde a la E-cadherina regulación a la baja y aumento de la expresión de N-cadherina, que conduce a la iniciación de PDAC metástasis [17]. Examinamos la E-cadherina y la expresión de N-cadherina por microscopía confocal y análisis de Western blot en las tres líneas celulares KC y del Cuerpo de Protección de nueva creación. Se observó la expresión de E-cadherina en la ONU-KC-6141, ONU-KPC-960, y las células de la ONU-KPC-961, indicativo de su naturaleza epitelial (Fig. 4A-B). En contraste, las células mostraron Panc02 mínima expresión de E-cadherina. El patrón de expresión de N-cadherina fue similar, siendo más prominente en las líneas celulares de KC y CPK, en comparación con la expresión en las células Panc02 (Fig. 4C-D).
(A) Imágenes de microscopía confocal de E -cadherin (Alexa Fluor ® 568, rojo fluorescente) expresión en líneas celulares de ratón. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI. (B) Análisis de transferencia Western de E-cadherina en líneas celulares de ratón. Proteína lisados fueron resueltas en un 10% SDS-PAGE. ß-actina se utilizó como control de carga. (C) Confocal imágenes microsocopy de N-cadherina (Alexa Fluor ™ 488, Verde Fluorescente) expresión en líneas celulares de ratón. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI. (D) Análisis de transferencia Western de N-cadherina en líneas celulares de ratón. Proteína lisados fueron resueltas en un 10% SDS-PAGE. β-actina se utilizó como control de carga.
líneas celulares KC y KPC expresan altos niveles de MUC1 y Muc4
Los diferentes tipos de mucinas se expresan en el páncreas durante la progresión del PC [12 ], [18]. Por otra parte, las lesiones precursoras de PC en modelos de ratones genéticamente manipulados PDAC tales como los ratones y KC KPC, se sabe que producen mucinas [3], [4]. Recientemente, también hemos demostrado que en el páncreas de ratones KC, la expresión de MUC1, Muc4, y Muc5AC aumentó progresivamente en correlación con el desarrollo PDAC [12]. Hemos examinado si la expresión de estas mucinas se puede corroborar en las líneas celulares derivadas de KPC y KC. Con este fin, PCR en tiempo real, transferencia de Western, y los análisis de microscopía confocal se llevaron a cabo. Los resultados indicaron que los niveles de transcripción relativos de las mucinas transmembrana
MUC1 gratis (
p Hotel & lt; 0,001) y
Muc4 gratis (
p Hotel & lt; 0,05) fueron significativamente mayores en ONU-KC-6141, ONU-KPC-960 y las células de la ONU-KPC-961 (Fig. 5A) en comparación con las células control (fibroblastos NIH3T3). En las células Panc02, los niveles de transcripción relativa de
MUC1
y
Muc4
fueron elevados, pero no fueron estadísticamente significativas. Sin embargo, las células Panc02 y las dos líneas celulares derivadas de ratones KPC mostraron niveles más altos de proteína Muc4 que la línea celular derivada-KC (Fig. 5B). Por otro lado, la proteína MUC1 en Panc02 fue menor que en las células derivadas de KPC KC y (Fig. 5C). Para nuestra sorpresa, Muc5AC no era detectable en ninguna de las líneas de células, ya sea en la transcripción o en los niveles de proteína (datos no mostrados), y esto puede ser una consecuencia de los cambios evolutivos asociados con el cultivo celular.
(A ) en tiempo real PCR análisis de
MUC1 Opiniones y
Muc4
en líneas celulares de ratón PDAC. Los transcritos de ARNm se normalizaron a los niveles de mRNA en la línea celular de fibroblastos de ratón NIH3T3. Los datos representan el aumento medio pliegue de tres repeticiones ± error estándar. significaciones estadísticas se calcularon en comparación con NIH3T3 (*
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,001, **
p * Hotel & lt; 0,0001). (B) Análisis de transferencia Western de Muc4 en líneas celulares de ratón. lisados de proteínas para el análisis Muc4 se resolvieron mediante SDS 2% en geles de agarosa. β-actina se utilizó como control de carga y se resolvió en 10% SDS-PAGE. (C) Imágenes de microscopía confocal de MUC1 (Alexa Fluor® 568, Rojo Fluorescente) expresión en líneas celulares de ratón. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI.
líneas celulares KC y KPC son resistentes a gemcitabina
A pesar de los recientes informes de que los pacientes con CP muestran una mayor supervivencia cuando se trataron con FOLFIRINOX (una combinación de oxaliplatino, irinotecán, fluorouracilo y leucovorina) en lugar de gemcitabina [19], este último sigue siendo el fármaco más utilizado en la quimioterapia del PC [20]. Por lo tanto, utilizando el ensayo MTT, se analizó la citotoxicidad gemcitabina en ONU-KC-6141, ONU-KPC-960, ONU-KPC-961 y las células Panc02 (Fig. 6A). células Panc02 fueron los más gemcitabina resistente con una concentración media máxima inhibitoria (IC-50) de 15 micras después de 48 h de tratamiento (Fig. 6B). Los IC-50 valores de las líneas celulares de KC y KPC variaron de 0,5 M a 5 M. Aunque las células Panc02 eran más resistentes a la gemcitabina, estos IC-50 valores están en el rango comparable de células PC humanos [21], [22]. Curiosamente, a concentraciones de gemcitabina más altas (30-100 M) (Fig. 6A), las células UN-KPC-961 mostraron una mayor resistencia a la gemcitabina que las células Panc02.
(A) la citotoxicidad en líneas celulares Gemcitabina PDAC ratón se determinó mediante el ensayo de MTT citotóxico. Las células se sembraron en pocillos por cuadruplicado y se incubaron con diferentes concentraciones de gemcitabina (100 nM-100 mu M) durante 48 h. Después de reemplazar los medios de comunicación con el reactivo MTT y disolución de los cristales de formazán con DMSO, la citotoxicidad se calculó basándose en los valores de absorción (λ = 540 nm) en las células tratadas con los medios de prensa. Los datos presentados son la media de citotoxicidad en los pozos por cuadruplicado ± error estándar. La significación estadística se calculó en comparación con Panc02 (*
p Hotel & lt; 0,01, **
p Hotel & lt; 0,001, ***
p Hotel & lt; 0,0001). (B) La mitad de la máxima concentración inhibitoria (IC-50) de la gemcitabina en cada línea celular se determinó después de la interpolación en los gráficos de% de citotoxicidad frente a la concentración.
líneas celulares KC y KPC trasplantados de páncreas inducen tumores en ratones
el establecimiento de las líneas celulares de KC y KPC en la cultura proporcionaron la oportunidad de examinar su tumorigenicidad en el fondo apropiada de ratón del que se derivaron. Las células de la ONU-KC-6141 se probaron en los ratones C57BL /6, mientras que ONU-KPC-960 y las células de la ONU-KPC-961 se examinaron en ratones de fondo B6.129 mixta. Un mes después de la implantación de las células ortotópico UN-KC-6141 en ratones C57BL /6, los tumores formados en su páncreas (Fig. 7A), y lesiones metastásicas en el hígado, no se observaron el bazo, intestino delgado, ganglios linfáticos mesentéricos y la pared peritoneal. la incidencia de tumores de las células de la ONU-KC-6141 fue del 100%. Las dos células derivadas-KPC (ONU-KPC-960 y ONU-KPC-961) también formaron tumores después de la implantación ortotópico (Fig. 7A), pero los que aparecieron a ritmos más lentos y los tumores se hicieron cargo de dos meses para crecer. La cinética de crecimiento del tumor comparativamente más lentas de las células KPC pueden haber sido causadas por las diferencias genéticas entre células KC y KPC, así como los diferentes orígenes de sus respectivos ratones receptores. Curiosamente, las células UN-KPC-961 parecían ser más tumorigénico (la incidencia de tumores 86%) que las células UN-KPC-960 (la incidencia de tumores 43%).