Extracto
actividad antitumoral sinérgico fuerte y
anti-HER2 murino 1E11 anticuerpo monoclonal tiene en HER2-overexpressing células de cáncer gástrico cuando se utiliza en combinación con trastuzumab. actualmente hemos optimizado este anticuerpo para la terapéutica humana. En primer lugar, las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) del anticuerpo murino se injertan en genes variables de la línea germinal de inmunoglobulina humana. No se observó ninguna diferencia en la afinidad y la actividad biológica entre 1E11 quimérico (ch1E11) y 1E11 humanizado (hz1E11). A continuación, la maduración de afinidad de hz1E11 se realizó mediante la aleatorización de los residuos de CDR-L3 y H3, seguido por la selección biopanning estrictas. Milder presión de selección a favor de la selección de más diversos clones, mientras mayor rigor de selección resultó en la convergencia de la salida de la panorámica a un número menor de clones con afinidad mejorada. Clone 1a12 tenía cuatro sustituciones de aminoácidos en CDR-L3, y mostró un aumento de 10 veces en la afinidad en comparación con el clon parental y el aumento de la potencia en un
vitro
ensayo de actividad anti-proliferativa en con cáncer gástrico HER2-overepxressing Células. 1a12 clon inhibe el crecimiento de tumores de NCI-N87 modelo de xenoinjerto con una eficacia similar a trastuzumab solo, y el tratamiento de combinación de 1a12 y trastuzumab eliminado por completo los tumores establecidos. Estos resultados sugieren que humanizada y madurados por afinidad anticuerpo monoclonal 1a12 es una molécula altamente optimizado para el futuro desarrollo terapéutico contra los tumores HER2 positivos
Visto:. Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang, Kim KT, et al. (2015) maduración de la afinidad del anticuerpo monoclonal 1E11 por aleatorización selectiva en CDR3 Regiones Optimiza terapéutico Anticuerpos que actúan de HER2-positivo cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10.1371 /journal.pone.0134600
Editor: Mitchell Ho, Instituto Nacional del Cáncer, NIH, Estados Unidos |
Recibido: 14 de abril de 2015; Aceptado: 12 de julio de 2015; Publicado: July 30, 2015
Derechos de Autor © 2015 Ko et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por AbClon Inc., y por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) subvención a HS Medicinal Bioconvergence Centro de Investigación (NRF-2013M3A6A4044991) . El patrocinador comercial (AbClon Inc.) prestado apoyo en forma de salarios de los autores (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, y JSL), pero no tienen ninguna función adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK, y JSL son todos empleados por AbClon Inc. y pueden ser propietarios de su valores. SA es en la consultoría pagados a AbClon Inc. y también es propietaria de sus acciones. Abclon está llevando a cabo patentes y desarrollo de productos de compuestos que se mencionan en este documento. BKK, Carolina del Sur, LGC, YHL, ISH, KTK, y JSL están actualmente empleados por el patrocinador comercial de esta investigación AbClon Inc. y pueden ser propietarios de sus acciones. SA se paga actualmente en consultoría de AbClon Inc. y también es propietaria de sus acciones. AbClon tiene una patente registrada en Corea (KR10-1453462, anticuerpos capaces de unirse específicamente a HER2) y presentó una solicitud PCT (PCT /KR2014 /004317, anticuerpo se une específicamente a HER2) en la que BKK, YHL, ISH, KTK, y JSL se enumeran como inventores. AbClon también está llevando a cabo el desarrollo de productos en los anticuerpos humanizados, afinidad de maduración que se mencionan en este documento. Estos cambios no afectan la adherencia de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Los anticuerpos monoclonales son los tratamientos convencionales en oncología y enfermedades autoinmunes, y se espera que juegue un papel importante en el futuro del tratamiento de la enfermedad [1, 2]. Más de 30 anticuerpos recombinantes están actualmente aprobados por la Food and Drug Administration, de los cuales aproximadamente la mitad son anticuerpos anti-cáncer. El cáncer gástrico es uno de los cánceres más comunes y es la tercera causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [3]. En el cáncer gástrico, la sobreexpresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), factor de crecimiento epidérmico humano receptor 2 (HER2), y HER3 se correlaciona con mal pronóstico [4, 5]. Recientemente, la orientación HER2 anticuerpo monoclonal trastuzumab fue aprobado para el tratamiento del cáncer metastásico unión gastroesofágica gástrico y HER2-positivo basado en los resultados del Trastuzumab con quimioterapia en HER2-positivo avanzado ensayo clínico del cáncer gástrico (TOGA) [6].
las combinaciones particulares de anticuerpos mutuamente no competitivos dirigidos a la actividad antitumoral mismo incremento del receptor
in vitro
y
in vivo
. La combinación de la orientación HER2 anticuerpos, trastuzumab y pertuzumab, muestra una mayor eficacia en los cánceres de mama que sobreexpresan HER2-[7]. Los beneficios de la combinación pertuzumab y trastuzumab se han demostrado en ensayos preclínicos y clínicos [8, 9]. Otros anticuerpos HER2-focalización que muestran una mayor eficacia en combinación de agentes individuales, y han mostrado consistentes baja regulación de los niveles de HER2 y combinaciones de efectos beneficiosos en modelos de ratón [10]. El aumento de la eficacia de combinaciones de anticuerpos también se ha demostrado con anticuerpos dirigidos al EGFR [11, 12] y vascular del receptor del factor de crecimiento endotelial 3 (VEGFR3) anticuerpos -targeting [13].
anticuerpos terapéuticos típicamente están diseñados ampliamente para poseer propiedades biológicas y físico-químicas deseables, tales como baja inmunogenicidad, de alta afinidad y especificidad, funciones efectoras óptimas, y una buena solubilidad y la estabilidad [14]. Especialmente, la humanización de anticuerpos y la maduración de la afinidad son dos de los procesos de ingeniería aplicados más frecuentemente durante el desarrollo de anticuerpos terapéuticos candidatos. La inmunogenicidad del anticuerpo terapéutico limita la utilidad clínica y la eficacia de la producción de anticuerpos contra las drogas [15], y la humanización de los anticuerpos de ratón o de otras especies ahora es un procedimiento estándar para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos. Unos procedimientos de humanización se han desarrollado enfoques que emplean ya sea racionales o empíricos [16]. La región determinante de complementariedad (CDR) enfoque de injerto como un método para superar el anticuerpo anti-quimérico humano (HACA) respuesta [17] es un método bien establecido humanización. Sin embargo, el injerto directo de CDR murinas en una secuencia aceptora de marco conservado humana a menudo resulta en una pérdida de afinidad, por lo que una copia de mutaciones de residuos de la región marco (residuos de la zona de Vernier) que soporta la estructura de bucles de CDR a menudo es necesario [18]. Para
in vitro
maduración de afinidad, tres enfoques de diversificación se utilizan normalmente: por ejemplo, mutagénesis al azar PCR propensa a error, la aleatorización de los residuos específicos utilizando oligonucleótidos degenerados, y mezcla de cadenas. En el enfoque de aleatorización específica, CDRs son el blanco lógico para la aleatorización en la mayoría de los casos debido a la hipermutación somática ha evolucionado para favorecer mutaciones en los CDRs de anticuerpos [19], y CDR-H3 y CDR-L3 tienden a dominar la interacción anticuerpo-antígeno [ ,,,0],20]. Uno de los principales problemas asociados a la aleatorización específica es la selección de las posiciones que no son esenciales para la unión al antígeno, pero que puede mejorar la afinidad cuando se realiza una sustitución óptima de aminoácidos. barrido de alanina puede ayudar a determinar los residuos de seleccionar al azar, especialmente cuando CDR son mucho tiempo. A veces, la propia mutación alanina aumenta la afinidad de anticuerpos [21].
Anteriormente desarrolló un anticuerpo murino dirigido HER2 (clon 1E11) que muestra la actividad antitumoral sinérgica en combinación con trastuzumab en HER2 sobreexpresión de líneas celulares de cáncer gástrico [22 ]. En este informe se describe la forma en que el 1E11 optimizado para un anticuerpo terapéutico mediante injerto de CDR de genes variables de inmunoglobulina de línea germinal humana y la maduración de afinidad a través de aleatorización específica de CDR-H3 y CDR-L3. El anticuerpo 1E11 optimizado (clon 1a12) muestra actividad antitumoral sinérgico en modelos de xenoinjertos de cáncer gástrico HER2-positivo en combinación con trastuzumab. Se observó que para el 1E11 clon, genes variables de la línea germinal humanos son aceptores adecuados para la humanización sin reducción de afinidad, y la sustitución de los residuos de CDR-L3 que no son esenciales para la unión al antígeno fue suficiente para mejorar la afinidad por más de 10 veces.
materiales y Métodos
líneas celulares y materiales
células NCI-N87 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y las células OE-19 se obtuvieron de la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC, Porton Down, Reino Unido). El medio de cultivo celular era RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y antibióticos y las células se cultivaron a 37 ° C bajo 5% de CO
2. Trastuzumab y palivizumab fue producido por Genentech (South San Francisco, CA, EE.UU.) y MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, EE.UU.), respectivamente. ChromPure IgG humana (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE.UU.) se utilizó como anticuerpo de control IgG humana de
in vitro
ensayos. Los anticuerpos IgG se produjeron utilizando el sistema de Freestyle 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y se purificaron usando una proteína de cromatografía de afinidad (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.). La endotoxina se eliminó con un kit de eliminación de endotoxina (GenScript, Piscataway, NJ, EE.UU.), y los niveles de endotoxina se determinaron utilizando un kit de detección de endotoxina (GenScript). Las proteínas recombinantes se produjeron como proteínas secretadas utilizando el sistema de Freestyle 293 y se purificaron usando proteína A o cromatografía Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.) para Fc-etiquetados o Su-etiquetados proteínas, respectivamente.
mutagénesis de barrido de alanina y Fab purificación
La mutagénesis dirigida por barrido de alanina se realizó mediante PCR utilizando mutagénesis QuickChange mutagénesis dirigida Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). proteínas Fab mutantes se expresaron y se purifica para evaluar la importancia de cada residuo para la actividad de unión al antígeno. En resumen,
Escherichia coli DH5a
células transformadas con el vector pComb3X que alberga los genes Fab mutantes fueron cultivadas a 28 ° C en caldo de SB. La expresión se indujo con 1 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido cuando la densidad óptica (600 nm) del cultivo alcanzó 0,8. Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de extracción enfriado (120 mM Tris, pH 8,0, EDTA 0,3 mM, y 300 mM de sacarosa) y se incubaron en hielo durante 30 minutos para la extracción periplásmica. Se añadió cloruro de magnesio (2,5 mM) al extracto clarificado después de la centrifugación para secuestrar EDTA libre antes de la purificación cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC). proteínas Fab purificados se utilizaron para el ensayo de unión ELISA y
k
off análisis mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR).
maduración de la afinidad
humanizado 1E11 clonó en el vector de pComb3X como formato Fab se utilizó como molde para la reacción en cadena de la polimerasa de extensión por solapamiento de mutagénesis (PCR) como se describe anteriormente [23]. Los oligonucleótidos degenerados (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, EE.UU.) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(inverso) y 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Hacia adelante) se utilizaron para la biblioteca L-NNK y H-XXS, respectivamente. N indica A, C, G o T; M es C o A; y S es G o posiciones de base C. numeradas indican nucleótidos mezclado a mano compuestas de 70% de una base y 10% cada uno de los otros tres bases: base de la frecuencia de 70% es G, A, T, y C para 1, 2, 3, y 4, respectivamente. Para la biblioteca H-2AA, se utilizaron una mezcla equimolar de los siguientes oligonucleótidos mutagénicos hacia adelante: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 'y 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K denota G o T. Después de dos rondas de extensión por solapamiento PCR, el ADN de la biblioteca Fab con un CDR aleatorizado se cortó con SfiI, se ligó en el vector fagémido digerido con SfiI pComb3X, y electroporación en
E
.
coli cepa ER2537
(New England Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.).
ligantes de alta afinidad fueron seleccionados utilizando la proteína soluble biotinilado HER2-ECD. aglutinantes del grano fueron pre-agotado mediante la incubación de la biblioteca de fagos de anticuerpos con 100 l de pre-bloqueado Dynabeads M-280 de estreptavidina (Invitrogen) durante 1 hora con rotación lenta a temperatura ambiente. Se añadió proteína biotinilada HER2-ECD (100 NM- 24:01) a la biblioteca de anticuerpos pre-agotado y se incubó durante 1 hora con rotación a temperatura ambiente. Después, se añadieron 50 l de perlas de estreptavidina-magnético bloqueados y se incubaron en el rotador durante 15 minutos. Las perlas se lavaron 10 veces con 1 ml de solución salina tamponada con Tris-Tween 20 (TBST) y dos veces con 1 ml de PBS. Los fagos unidos se eluyeron mediante incubación de las perlas con 1 ml de trietilamina 100 mM durante 8 minutos después se neutralizó con 0,5 ml de 1 M Tris, pH 7,4.
ELISA la actividad de unión de prueba
se añadieron anticuerpos a placas de 96 pocillos Costar mitad de la superficie (Corning, Corning, NY, EE.UU. Producto Nº 3690) recubiertas con 1 mg /ml del antígeno. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 1 hora, las placas se lavaron tres veces con TBST y se incubaron con peroxidasa de conejo anti-humana de anticuerpos de rábano picante (HRP) (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.) para anticuerpos IgG y de rata anti-HA-HRP (clon F10, Roche Ciencias de la vida, Basilea, Suiza) para los anticuerpos Fab, respectivamente. Las placas se lavaron tres veces, (SurModics, Eden Prairie, MN, EE.UU.) se añadió sustrato de peroxidasa tetrametilbencidina (TMB) y las reacciones fueron detenidos por la adición de ácido sulfúrico 1 N (DukSan, Ansan, Corea). Absorbancia a 450 nm se midió utilizando un instrumento Victor X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, EE.UU.).
Superficie análisis de resonancia de plasmones
Para k
análisis
off de las proteínas Fab, HER2-ECD-His proteína se inmoviliza sobre la superficie de un chip sensor CM5 (GE Healthcare) usando el método de acoplamiento de amina en aproximadamente 2.000 unidades de respuesta (RU). proteínas Fab purificadas se inyectaron en 2 mg de concentración /ml y una velocidad de flujo de 50 l /minuto. Para
k
off análisis de anticuerpos IgG, anticuerpo de cabra anti-humano IgG (γ) (Invitrogen, Cat. No. H10500) se inmovilizó sobre el chip sensor CM5 utilizando acoplamiento de amina, y los anticuerpos fueron capturados en 1 mg /ml durante 4 minutos y se estabilizó durante 5 minutos a una velocidad de flujo de 50 l /minuto. HER2-ECD-His proteína se inyectó a una concentración de 160 nM. Para las mediciones de afinidad, los anticuerpos fueron capturados en aproximadamente 50 RU por cabra anti-humano IgG (γ) inmovilizada sobre un chip CM5. HER2-ECD-His proteína se inyectó en concentraciones que van desde 0 hasta 640 nM. Sensogramas se obtuvieron en cada concentración y se evaluaron usando el software BIAevaluation. Para hurgar en la basura epítopo, de forma IgG hz1E11 se inmoviliza sobre superficies chip sensor CM5 separados en aproximadamente 1000 unidades de respuesta. HER2-ECD-His (320 nM) y anticuerpos (1 mg /ml) se añadieron secuencialmente durante 4 minutos y se estabilizó durante 5 minutos a una velocidad de flujo de 50 l /minuto.
viabilidad de las células de ensayo
las células se sembraron en placas de 96 pocillos (Corning) en el FBS 10% que contenía medio y pre-cultivaron durante 24 horas. Las células fueron tratadas con anticuerpos en las concentraciones indicadas y la cultura durante 4 días. Reactivo WST-1 (Dogen EZ-Cytox; Servicio de Laboratorio Daeil, Seúl, Corea) se utilizó para medir la viabilidad celular. la viabilidad celular relativa se calcula dividiendo la absorbancia de cada pocillo por la absorbancia media de los pozos tratados con PBS en cada placa.
estudio de xenoinjerto
ratones hembra desnudos atímicos (Daehan Biolink, Chungbuk, Corea ) se inyectaron por vía subcutánea en el área del flanco izquierdo con 5 × 10
6 de las células NCI-N87 en Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Los tumores se dejaron crecer hasta aproximadamente 200 mm
3 de tamaño, y los ratones fueron aleatorizados en grupos. Los animales recibieron la administración intraperitoneal de anticuerpos a las dosis indicadas dos veces por semana. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando la fórmula (L x W x W) /2, donde L representa el diámetro mayor del tumor y W representa el diámetro del tumor más pequeño. De dos vías de medidas repetidas ANOVA seguido del test de Bonferroni se llevó a cabo para el análisis estadístico de los estudios en animales growth.All tumorales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales" del NIH y un protocolo aprobado recibida por Institución Comité de Cuidado de Animales y el empleo de la empresa.
resultados
Humanización de 1E11 realizado por injerto de CDR a los genes de la línea germinal humana
para desarrollar el anticuerpo humanizado, el VH y VL secuencias de murino 1E11 fueron comparados con los de la línea germinal humana V y J de genes repertorios utilizando herramientas de análisis /IMGT V-QUEST [24]. Para la cadena pesada, IGHV3-48 * 03 y * 01 IGHJ4 mostraron la más alta homología con las contrapartes 1E11, compartiendo 85% y 87% de identidad, respectivamente. Para la cadena ligera, humanos IGKV1-39 * 01 y * 01 IGKJ1 genes muestran identidad de 80% y 81%, respectivamente. Estos genes humanos se seleccionaron como secuencias aceptora para el injerto de las CDR murinas. Entre la zona de Vernier, que consiste en los residuos de la región marco que están implicados en la presentación de estructuras de CDR mediante el apoyo al bucles CDR [18, 25], sólo un resto en la posición 49
H de cadena pesada diferente entre murino y secuencias humanas. En consecuencia, humanizado 1E11, hz1E11, tiene sólo un residuo de murino en las regiones de marco (Fig 1).
cadena pesada (A) y la cadena ligera (B) la alineación de secuencias de aminoácidos de murino, la línea germinal humana, y humanizado 1E11. Los residuos de CDR, que se definen de acuerdo con la definición de Kabat, se muestran en negrita. Los aminoácidos se numeran de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat. Los dos puntos representan residuos comunes entre las secuencias murinas y de la línea germinal humana.
actividad de unión de hz1E11 a la región extracelular (ECD) de HER2 era equivalente a la de ch1E11 (Fig 2A), y la afinidad de trastuzumab, ch1E11 y hz1E11 era 3 nM, 23 nM, y 23 nM, respectivamente. También confirmó que hz1E11 obligado a subdominio IV como el ch1E11 los padres. Trastuzumab también se une al subdominio IV [26]. Los
in vitro
actividades anti-proliferativos de hz1E11 como agente único y en combinación con trastuzumab también fueron equivalentes a los de ch1E11 (Figura 2C). En el estudio anterior [22] Se informó que tenía ch1E11
in vivo
actividad antitumoral comparable a la de trastuzumab como agente único, y la combinación de trastuzumab y ch1E11 resultó en el índice de regresión del tumor (TGI) de 95,1%. Del mismo modo, hz1E11 como agente único tenía similares
in vivo
actividad antitumoral al trastuzumab (S1 figura) y la combinación de hz1E11 con trastuzumab también mostró actividad antitumoral dependiente de la dosis en el modelo NCI-N87 xenoinjerto de ratón ( Fig 2D). Anticuerpo tratamiento de combinación a 1 mg /kg cada uno de hz1E11 y trastuzumab resultó en la actividad anti-tumor similar con trastuzumab tratamiento único a 10 mg /kg, y en el 2,5 mg /combinación kg y por encima del tumor establecido estabilizado o comenzó la regresión (No estadísticamente se observó entre 2,5, 5, y 10 mg /kg combinaciones); diferencia significativa [0.05
P
& lt]. Estos resultados muestran que hz1E11 tiene la afinidad y la actividad biológica equivalente a ch1E11, y que hz1E11 potencia la actividad anti-tumor de trastuzumab cuando se utiliza en combinación.
A, Las actividades de unión de hz1E11 y ch1E11 a HER2-ECD proteína se analizaron por ELISA. Trastuzumab (TRA) se utilizó como un anticuerpo de control positivo contra la proteína HER2. B, La actividad de unión de los anticuerpos se analizó mediante ELISA usando proteínas de dominio de sub-HER2 recombinante. células C, NCI-N87 fueron tratados con anticuerpos para 4 días en el medio de crecimiento completo y la viabilidad celular se midió por duplicado (media ± SD) usando reactivo WST-1. La viabilidad 100% se definió como la viabilidad de los pocillos de anticuerpos sin tratar. D, ratones portadores de xenoinjertos de tumores NCI-N87 fueron tratados con dosis indicada de anticuerpo de control, trastuzumab, hz1E11, o trastuzumab más hz1E11. Palivizumab se utilizó como anticuerpo de control de isotipo. El volumen del tumor (mm
3) se expresó como media ± desviación estándar (
n
= 6 ratones /grupo). Para mayor claridad, se muestran barras de error solamente positivos. **,
P Hotel & lt; 0,01; ns: no significativo según lo determinado por dos vías ANOVA de medidas repetidas seguido del test de Bonferroni.
barrido de alanina de CDR-H3 y CDR-L3
Para identificar los restos críticos para la antígeno-anticuerpo interacción, mutagénesis de barrido con alanina se llevó a cabo en las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera (CDR-H3 y CDR-L3). Los efectos de las mutaciones se evaluaron mediante el análisis de la actividad de unión de las proteínas Fab purificados mediante ELISA indirecto. En CDR-H3, la sustitución de alanina en la posición Gly98
H abolió la unión del Fab de HER2, y G97
HA y T99
mutantes HA demostraron una reducción de la actividad de unión (Fig 3A). En CDR-L3, las sustituciones de alanina tenían efectos mucho más pequeñas (Fig 3B). El
k
Fuera de los valores de los mutantes de barrido de alanina se analizaron mediante SPR contra la proteína HER2-ECD immbolized. Se confirmó que el mutante G98A cadena pesada pierde por completo las actividades de unión, y la vecina T99
HA y G97
mutantes HA dio lugar a 32 veces y 17 veces mayor
k
de valores , respectivamente (figura 3C). Estos resultados indican que la cadena pesada Gly98
H es funcionalmente crítico y sus residuos adyacentes también son funcionalmente importante para la interacción antígeno-anticuerpo.
Las actividades de unión de mutantes de exploración de alanina de CDR-H3 (A) y CDR -L3 (B) se analizaron por ELISA. C, cinética de disociación cuantitativas de mutantes indicados se analizaron mediante resonancia de plasmones superficiales. proteína HER2-ECD se inmovilizó sobre un chip sensor CM5 seguido por la exposición a los anticuerpos Fab mutantes indicados. La asociación 100% se definió como la unidad de respuesta (RU) a 200 segundos desde el comienzo de la inyección de Fab.
k
Fuera de los valores se calcularon utilizando el software BIAevaluation.
Affinity maduración de hz1E11
maduración de la afinidad de hz1E11 se llevó a cabo mediante la construcción de pesada o bibliotecas de variantes CDR3 de cadena ligera, seguido de la selección de equilibrio de las bibliotecas de anticuerpos de fagos. Para la cadena ligera, los residuos de glutamina en las posiciones 89
L y 90
L no fueron diversificados porque glutamina se encuentra comúnmente en estas posiciones de las secuencias de nueve amino ácidos longCDR-L3 en el 59% y el 73% frecuencias, respectivamente [ ,,,0],27]. Posiciones 91
L-94
L se asignaron al azar usando un codón NNK degenerada (NNK-L). Para la cadena pesada, las posiciones 95
H -100A
H fueron asignados al azar usando un codón XXS (H-XXS), diseñado de manera que en la primera y segunda posiciones de nucleótidos del codón diversificado la base de tipo natural producido con el 70 % de probabilidad, cada uno de los otros tres bases se produjo a 10% de frecuencia, y la tercera cartas de los codones se sintetizaron usando una mezcla equimolar de G y C (Fig 4A). aglutinantes de alta afinidad se seleccionan de alta rigurosidad o de baja rigurosidad panning (Tabla 1).
A, Diseño de las bibliotecas de CDR-L3 y CDR-H3 para la maduración de afinidad. Véase el texto para una explicación detallada. B, logotipo de la secuencia se generó usando el programa WebLogo acerca de las secuencias únicas CDR-L3 de 4
ª ronda paneo-2 (panorámica de baja rigurosidad) de salida de la biblioteca de CDR-L3 (
n
= 39). C, La hz1E11 se inmovilizó sobre un chip sensor CM5 seguido por la exposición secuencial para HER2 ECD-His-e indicados anticuerpos usando BIAcore2000. D, Trastuzumab se inmovilizó sobre un chip sensor CM5 seguido de exposeure secuencial para HER2-ECD-His y se indica anticuerpos usando BIAcore 3000. E, Las actividades de unión de los anticuerpos se analizaron mediante ELISA utilizando proteínas HER2 sub-dominio recombinantes.
en comparación con el de baja rigurosidad panorámica de la biblioteca-L NNK en la que el 100% de los terceros, y los clones de salida del cuarto de segunda ronda fueron seleccionados ELISA positivo, por la alta rigurosidad paneo la salida de la cuarta ronda no produjo ningún aglutinante en absoluto, y sólo un tercio de los clones de salida de la tercera ronda fueron ELISA positivo (Tabla 1). Los clones seleccionados de la biblioteca de CDR-L3 incluyen muchas secuencias que tenían las cuatro posiciones aleatorias CDR-L3 mutados, a diferencia de las bibliotecas de CDR-H3 de la cual la mayoría de los clones seleccionados conservado la secuencia de tipo salvaje en las posiciones 97
H -100
H (véase a continuación). Diferentes estrategias de panorama produjeron diferentes patrones de secuencia de enriquecimiento. Por ejemplo, el clon variante de cadena ligera 1a12 (Q
89LQNAYAPWT
97L) se aisló de la alta rigurosidad paneo pero no de la baja rigurosidad paneo, y la pesada variante de la cadena clon 1B12 (N
95HYGGTASFDY
102H) también fue seleccionado sólo de la alta rigurosidad paneo. Curiosamente, el 59% de los anticuerpos únicos en 4
ª salida con la panorámica de la librería L-NNK de baja rigurosidad tenía una alanina en la posición 92
L, de acuerdo con el análisis de barrido con alanina (Figura 4B).
Casi todos los clones que se aislaron de la biblioteca H-XXS tenían la misma secuencia en 97
H -100
H como el clon parental, y mostró una clara enriquecimiento de la secuencia Asn-Tyr en 95-96. A fin de evaluar la contribución de los residuos de CDR-H3 de unión antígeno-anticuerpo, una biblioteca adicional CDR-H3 fue construido con doble NNK de exploración codón aleatoria de CDR-H3 (H-2AA, figura 4A). En baja rigurosidad paneo, mutantes en las posiciones 95
H, 96
H, 99
H, 100
H, y el artículo 100
H fueron seleccionados en el panorama de primera ronda, pero sólo mutantes en las posiciones 95
H y 96
H fueron enriquecidos en la salida de la cuarta ronda (tabla 1). No hemos podido detectar los mutantes en las posiciones Gly97
H y Gly98
H en cualquier estrategia y salidas de panorama.
La afinidad y la actividad de unión de los clones seleccionados
Para evaluar el efecto de la combinación de las variantes de la cadena pesada y ligera afinidad de maduración, los anticuerpos IgG con combinaciones de cadenas pesadas y ligeras afinidad de maduración fueron producidos y su
k
valores
off fueron determinar mediante análisis de SPR (Tabla 2). Entre dos variantes de cadena ligera y dos variantes de cadena pesada, 1a12 derivado de L-NNK mostró la mayor mejora (16 veces). La combinación de la cadena ligera de 1a12 con la cadena pesada optimizado del clon 1B12 resultó en una mejora de 24 veces en
k
off sobre el hz1E11 de los padres, mientras que para las otras combinaciones, la
Los valores k
off fueron similares o mayores que la de 1a12. Debido a que el 1,5 veces mejora adicional de la combinación L-1a12 + H-1B12 no fue significativamente grande, clones 1a12 y 1F11 (variantes de la cadena ligera) se eligieron para una caracterización adicional para minimizar la diferencia en la secuencia de los anticuerpos por afinidad madurado desde el parental clon. Las constantes de disociación para la afinidad madurada clones, también determinados por análisis de SPR, eran más de 10 veces menor que la de la hz1E11 clon parental y comparable a la de trastuzumab (Tabla 3).
para determinar si los clones hz1E11 afinidad madurada se unen al mismo epítopo que el hz1E11 parental, la unión de 1a12 y 1F11 a la HER2-ECD que fue pre-obligado a hz1E11 se analizó por SPR. Ambos clones fueron incapaces de unirse al monomérica HER2-ECD-His proteína capturada por inmovilizada 1E11 mientras que trastuzumab podría (Fig 4C). Además, se confirmó que el epítopo 1a12 no se solapa con el de trastuzumab (Fig 4D). Los clones 1a12 y 1F11 también se unen a la sub-dominio IV como su clon parental hz1E11 (Figura 4E). Estos datos indican que los epítopos de 1a12 y 1F11 no se modificaron por el proceso de maduración de afinidad.
Eficacia de afinidad madurada hz1E11 clones
Tanto 1a12 y 1F11 anticuerpos mostraron un ligero aumento de las actividades anti-proliferativos como agente único en comparación con hz1E11 en las líneas celulares de cáncer gástrico que sobreexpresan HER2 (Fig 5A y 5B) NCI-N87 y OE-19, mientras que en combinación con trastuzumab, sus actividades anti-proliferativas fue superior a la que trastuzumab solo y equivalente a hz1E11 más trastuzumab . La actividad anti-proliferativa de 1a12 y 1F11 se confirmó
in vivo Hoteles en NCI-N87 modelo de xenoinjerto. actividad antitumoral Superior fue evidente en combinación con trastuzumab a la de cada agente por sí solo en ambos modelos de xenoinjerto (Fig 5C).
células NCI-N87 (A) y la OE de 19 células (B) fueron tratados con anticuerpos para 4 días en el medio de crecimiento completo. La viabilidad celular se midió por duplicado (media ± SD) usando reactivo WST-1. La viabilidad 100% se definió como la viabilidad de los pocillos de anticuerpos sin tratar. C, NCI-N87 (
n
= 5 ratones /grupo) las células fueron inoculadas en ratones y tratamientos con anticuerpos comenzaron cuando el volumen del tumor alcanzó aproximadamente 200 mm
3. Los ratones recibieron una dosis de 20 mg /kg para el tratamiento de agente único y 10 mg /kg de cada anticuerpo para el tratamiento de combinación. día de administración se indican mediante flechas. El volumen del tumor (mm
3) se expresó como la media ± SD. Para mayor claridad, se muestran barras de error solamente positivos.
Discusión
Pese a los alentadores resultados clínicos obtenidos con la orientación HER2 anticuerpo trastuzumab en el tratamiento del cáncer gástrico, todavía hay necesidad de más potentes terapias dirigidas HER2 [6]. La combinación de los anticuerpos no compiten con los receptores, tales como HER2, EGFR, y VEGFR3 de orientación, puede aumentar la actividad antitumoral en modelos preclínicos [11-13, 28]. Pertuzumab, otro anticuerpo HER2-focalización, está aprobado para su uso en combinación con trastuzumab en el tratamiento del cáncer de mama metastásico [29]. En un estudio anterior, hemos desarrollado un novedoso anticuerpo dirigido HER2, 1E11, que fue demostrado tener actividad antitumoral significativa como agente único y efecto sinérgico en combinación con trastuzumab
in vitro
y
in vivo
[22]. La actividad anti-tumor de la 1E11 más la combinación de trastuzumab es superior no sólo a trastuzumab tratamiento único, sino también a la combinación de pertuzumab y trastuzumab. En este informe, se describe la humanización y la afinidad posterior maduración del anticuerpo monoclonal 1E11 derivado de hibridoma de ratón.
enfoques iniciales para reducir la inmunogenicidad potencial de las regiones variables no humanos por injerto de CDR en un marco humano disminuir significativamente la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos [15, 17].