Extracto
Antecedentes
El agotamiento de los factores de replicación a menudo causa la muerte celular en las células cancerosas. El agotamiento de Cdc7, una quinasa esencial para la iniciación de la replicación del ADN, induce la muerte de las células cancerosas, independientemente de su estado de p53, pero las vías precisas de inducción de muerte celular no se han caracterizado.
Metodología /Principales conclusiones
Hemos utilizado el indicador del ciclo celular desarrollado recientemente, Fucci, para caracterizar con precisión el proceso de la muerte celular inducida por el agotamiento Cdc7. También hemos generado y utilizado indicadores del ciclo celular fluorescentes similares utilizando la fusión con otros reguladores del ciclo celular para analizar los modos de muerte celular en células vivas en ambos fondos p53-positivos y negativos. Se demuestra que las respuestas del ciclo celular distintas se inducen en las células p53-positivos y negativos por el agotamiento Cdc7. Las células con p53 negativo predominantemente detienen temporalmente en G2-fase, acumulando CyclinB1 y otros reguladores de la mitosis. detención prolongada en G2-fase y la entrada brusca en fase M aberrante en presencia de CyclinB1 acumulado son seguidos por la muerte celular en el estado post-mitótico. La extinción resultante de la acumulación citoplasmática CyclinB1 disminuye parcialmente la muerte celular. La vía ATR-MK2 es responsable de secuestro de CyclinB1 con la proteína 14-3-3σ. En contraste, las células cancerosas p53-positivo no se acumulan CyclinB1, pero parecen morir principalmente a través de la entrada en la fase S aberrante después de la depleción Cdc7. La combinación de la inhibición Cdc7 con agentes anticancerígenos conocidos estimula significativamente los efectos de la muerte celular en las células cancerosas de una manera genotipo-dependiente, proporcionando una base estratégica para futuras terapias de combinación.
Conclusiones
Nuestros resultados muestran que el uso de Fucci, y los indicadores del ciclo celular fluorescentes similares, ofrece un sistema de ensayo conveniente con la que la identificación de eventos del ciclo celular asociados con la muerte de células cancerosas. También indican los modos de muerte celular específicas del genotipo inducidos por la iniciación deficiente de replicación del ADN en las células cancerosas y su explotación potencial para el desarrollo de terapias contra el cáncer eficientes
Visto:. Ito S, Ishii A, Kakusho N, Taniyama C, Yamazaki S, Fukatsu R, et al. (2012) Mecanismo de cáncer muerte celular inducida por el agotamiento de un regulador esencial de replicación. PLoS ONE 7 (5): e36372. doi: 10.1371 /journal.pone.0036372
Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Enero, 2012; Aceptado: March 30, 2012; Publicado: 4 Mayo 2012
Derechos de Autor © 2012 Ito et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones-en-Ayudas a la Investigación básica Científicas (a) y una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en el área prioritaria "Ciclo de cromosomas" del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (HM). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cdc7 es un conservado serina-treonina quinasa que desempeña un papel crítico en el disparo de los orígenes de replicación [1] - [3]. Un sustrato clave es MCM, un componente del complejo prereplicative (pre-RC), y la fosforilación de la MCM2, 4 y 6 subunidades del complejo MCM por Cdc7 desencadena la asociación de Cdc45 con pre-RC, un paso crucial para la generación de una replicación tenedor activa [4] - [6]. Cdc7 forma un complejo con Dbf4, una subunidad de activación, para generar un complejo de quinasa activa [2]. En los seres humanos, dos subunidades de activación, ASK y Drf1 /ASKL1, se sabe que existen [2], [7] - [9].
Knockout de Cdc7 en ratones causa letalidad embrionaria temprana. La inactivación de los genes Cdc7 en células madre embrionarias de ratón también es letal [10]; células dejan de síntesis de ADN, se acumulan daños de ADN, y, finalmente, se someten a la muerte celular de una manera dependiente de p53. desmontables experimentos en células de mamíferos indican que pido es esencial, mientras que Drf1 /ASKL1 puede ser prescindible para la viabilidad [9], [11]. De hecho, la inactivación de los genes ASK en células madre embrionarias de ratón también conduce a la letalidad [12]. Estos resultados indican que Cdc7-ASK es esencial para la proliferación de células de mamíferos. Por otro lado, Drf1 /ASKL1 puede jugar un papel predominante como un activador de Cdc7 en el desarrollo temprano de los anfibios [13], [14]. Un ortólogo de Drf1 /ASKL1 no ha sido identificado en ratones.
En un nivel celular, se mostró desmontables de Cdc7 para causar la muerte celular en las células cancerosas, pero no en células normales, en el que las vías de p53 dependiente de detención el ciclo celular en la fase G1, presumiblemente, [15], [16]. También se informó de que Cdc7 knockdown indujo la muerte celular dependiente de p38 en las células HeLa [17]. Sin embargo, Cdc7 agotamiento causa la muerte celular también en células p53-positivos, lo que sugiere que p53 por sí solo no puede prevenir la muerte celular inducida por el agotamiento de Cdc7 en células de cáncer. En la actualidad, no se conocen con precisión los mecanismos de muerte celular independiente de p53 en células de cáncer-agotado Cdc7. En este estudio, se analizó el efecto del agotamiento Cdc7 en las células cancerosas mediante el indicador del ciclo celular recientemente desarrollado Fucci [18], así como los indicadores del ciclo celular fluorescentes similares. Nuestro punto diferencial resultados a efectos de p53 en el modo de muerte celular en las células cancerosas-agotado Cdc7.
Resultados
El agotamiento de Cdc7 cinasa en las células humanas de cáncer causa la muerte celular
El agotamiento de Cdc7 en HeLa, U2OS u otras células de cáncer con siRNA resultó en la inhibición de la síntesis de ADN, la acumulación de daños cromosómicos [representado por focos γ-H2AX) y la eventual pérdida de viabilidad viabilidad [15], [19], [20] . La muerte celular se indujo en tanto las células cancerosas p53-p53 positivo o negativo, de acuerdo con los informes anteriores [15], [19]. FACS análisis de contenido de ADN indicó que Cdc7 agotamiento conduce inicialmente a una disminución de la población G1, seguido de aumento de la población sub-G1, indicativo de la muerte celular (Fig. S1A y la Fig. S2B).
Con el fin de investigar la modo de muerte celular inducida por el agotamiento de Cdc7, que utiliza células HeLa que expresan el indicador de ciclo celular, Fucci (fluorescente indicador del ciclo celular basada en ubiquitina; [18]), que permite la visualización del estado del ciclo celular (rojo para G1 y verde para S /G2 /M). HeLa-Fucci se transfectó con Cdc7 siRNA y se monitorizaron las células para determinar la fase del ciclo celular a la que se someten a la muerte celular. La muerte celular se produce tanto en G1 post-mitótico y durante S /G2 /M fase en HeLa-Fucci (Fig. 1A y C, las películas S1 y S2). También generó U2OS-Fucci y examinamos el modo de muerte celular en U2OS después de la depleción Cdc7. En U2OS, más de 70% de las células murió durante S /G2 /M fase (verde; Fig. 1B y C). Por el contrario, Cdc7 agotamiento no indujo la muerte celular en NHDF (normal de fibroblastos dérmicos humanos) células y llevó todo a la detención en G1 como se ha descrito anteriormente (Fig. S1 y datos no mostrados; [15]).
(A células y B) HeLa (A) o U2OS (B) que expresan Fucci fueron tratados con control o Cdc7-D siRNA, y la imagen de lapso de tiempo se registró con Olympus LCV100 (películas S1 y S2). Se presentan imágenes tomadas de los datos lapso de tiempo en los tiempos indicados. Los paneles superiores (control de siRNA) indican las células sometidas a la división celular normal. Los números en cada tiempo de la demostración del panel (horas) después de siRNA transfección. Dos paneles inferiores (A y B) Las células muestran Cdc7 siRNA tratada. Algunas células murieron en color rojo (fase G1, a), y otras células murieron en verde (S /G2 /M fase, b). Las longitudes de las fases del ciclo celular se indican en los paneles (G1, flechas líneas discontinuas; S /G2 /M, arrowed líneas continuas). Bar, 20 micras. (C) Las células muertas en siRNA tratada con Cdc7 HeLa-Fucci (izquierda, 324 células) o U2OS-Fucci (a la derecha, 180 células) fueron contadas a partir de los datos de lapso de tiempo para determinar las fracciones de las células muertas en rojo y en verde. La muerte celular se produce en ambos G1 y S /G2 /M fases en las células cancerosas tratadas Cdc7 siRNA. células (D, E y F) HeLa fueron transfectadas con control o Cdc7-D siRNA y se cosecharon a las 48 horas (D) o en los tiempos indicados (E y F). Los extractos de células enteras (D) o extractos de CSK-solubles (E) se analizaron por transferencia Western usando los anticuerpos indicados. actividad de la quinasa (F) Cdc2-CyclinB1 se midió utilizando los extractos de CSK-solubles. Los inmunoprecipitados (IP) utilizadas para los ensayos y los extractos de entrada se analizaron por Western Blot. El grado de agotamiento Cdc7 fue similar entre HeLa y U2OS. Cdc7 no era detectable por Western después del tratamiento siRNA tanto en las células. células (G) HeLa fueron tratados con control o Cdc7-D siRNA durante los tiempos indicados, recogen, se lavan con PBS, se hincha en KCl 75 mM durante 20 min a 37 ° C, y se fijaron con ácido glacial acético /metanol (01:03) solución tres veces. cromosomas fijos se dejaron caer sobre un portaobjetos de vidrio, se secaron al aire y se tiñeron con solución al 5% de Giemsa en 1/15 M PBS. Se observaron cromosomas en virtud de propagación Todo-en-Uno de microscopía (Keyence). Las células mitóticas con cromosomas condensados de manera aberrante se contaron y se presentan las fracciones. Los recuadros muestran imágenes representativas de los cromosomas condensados de forma aberrante observados en un Cdc7 siRNA tratados de células HeLa (izquierda) y los cromosomas condensados correctamente observados en una célula de control (derecha). Bar, 50 micras. células (H) HeLa fueron tratados con control o Cdc7-D siRNA durante 48 horas, se lavaron con PBS, se fijaron con 4% de paraformaldehído durante 10 min a temperatura ambiente y después se tiñeron con Hoechst 33342. Las células se examinaron con microscopía confocal LSM510 (1427 células [Cdc7] y 1023 células [control]), y se marcaron las células en etapas M fase. Se presentan las fracciones de células en cada fase mitótica. (I) Spread y cromosomas fijos preparados en U2OS como se describe anteriormente se observaron por microscopía FSX100 Olympus. No se observó ninguna diferencia significativa en las células mitóticas después de la depleción Cdc7. Sin embargo, el número de células apoptóticas aumentó en células U2OS-agotado Cdc7. Bar, 32 micras. En C, G y H, "n" representa el número de experimentos independientes realizados.
acumulación citoplasmática de la proteína CyclinB1 en Cdc7 empobrecida en células HeLa
El análisis FACS de Cdc7- agotadas las células HeLa no mostraron acumulación de G2 /M población (Fig. S1 a y Fig. S2 B). Sin embargo, los análisis de Western de varias proteínas después de la depleción Cdc7 en células HeLa se indica que los niveles de CyclinB1, proteínas AuroraA y Plk1 aumentaron (Fig. 1D, E y F). Los niveles tanto de Cdc25C, Cdc25CS216 (Fig. 1E) y la fosforilación de la tirosina 15 de Cdc2 también aumentaron (Fig. 1F), lo que sugiere que punto de control G2 /M puede ser inducida en células HeLa-agotado Cdc7. Aunque el nivel de proteína CyclinB1 aumentado, la actividad de la quinasa Cdc2 CyclinB1-dependiente fue casi la misma que la del control (Fig. 1F). Esto puede ser debido a la asociación con las proteínas 14-3-3, que puede inhibir la actividad de la quinasa (véase a continuación), así como a la 15 fosforilación puesto de control inducida por tirosina inhibidora. Por otro lado, en U2OS p53 positiva, el agotamiento de Cdc7 no causó acumulación CyclinB1, y no afectó a la actividad de quinasa Cdc2 CyclinB1-dependiente o la tirosina 15 de la fosforilación de Cdc2 (Fig. 1F).
La tinción y la observación de los cromosomas M fase indica un aumento de los cromosomas condensados de manera aberrante en las células tratadas con siRNA Cdc7 (Fig. 1G). Alrededor del 50% de las células mitóticas exhibió los cromosomas condensados de forma aberrante en las células HeLa-agotado Cdc7. Además, la metafase a telofase poblaciones de células se redujo en las células HeLa tratadas con siRNA Cdc7 (Fig. 1H). Estos resultados indican que una gran población de células detener o ralentizar en G2 después de la depleción de Cdc7 quinasa en las células HeLa con los cromosomas condensados de manera aberrante, y una parte de las células mueren durante la fase G2 /M, posiblemente por la metafase. Sin embargo, el momento preciso de la muerte celular durante la fase M no se ha determinado. En U2OS, no hay ninguna diferencia significativa para los cromosomas M fase entre Cdc7-agotado y las células de control. Sin embargo, el número de núcleos apoptóticos aumentaron después de la depleción de Cdc7 en U2OS (Fig. 1I). Por lo tanto, estos resultados también muestran que el momento de la muerte celular inducida por el agotamiento de Cdc7 puede diferir en células HeLa y U2OS.
A continuación, analizamos la localización celular de la proteína CyclinB1 por inmunotinción. Hemos tomado nota del aumento de las células CyclinB1-positivo en las células tratadas con siRNA Cdc7, como se espera de un aumento del nivel de proteínas en general CyclinB1. También hemos observado que una población sustancial de células HeLa-agotado Cdc7 contiene proteínas CyclinB1 en el citoplasma (Fig. 2A y B). Para confirmar este resultado, hemos examinado el efecto del agotamiento Cdc7 utilizando células HeLa que expresan de forma estable la proteína fusionada CyclinB1-mKO2. En esta línea celular, las señales fluorescentes rojas aparecieron por primera vez en el citoplasma en alrededor de 10-14 horas después de la división celular. Las señales fueron detectables durante aproximadamente 5-6 horas. Puesto que los experimentos de sincronización sugieren que G2 /M fases en las células HeLa duran alrededor de 3-5 horas, CyclinB1 es probable que se expresa desde finales de la fase S a través de la metafase. Estas señales se translocan en núcleos y desaparecen después de la metafase (Fig 2C, panel superior; película S3.), Consistente con el comportamiento esperado de la proteína CyclinB1 endógena, como se muestra anteriormente [21] - [23]. Cuando las células se trataron con Cdc7 siRNA, la población de las células con fuertes señales rojas citoplasmáticos aumentó, y estas señales se quedó en el citoplasma por un período más largo (Fig. 2C, panel inferior y la película S4). El tiempo necesario para la translocación de las señales de color rojo en los núcleos después de su aparición en el citoplasma era unos hrs en las células de control, mientras que aumentó en empobrecido en Cdc7 células (Fig. 2C y D, las películas S3 y S4). Esto también se observó con diferente Cdc7 siRNAs (Fig. S2 y datos no presentados). Estos resultados son consistentes con la idea de que CyclinB1 acumula en el citoplasma en las células HeLa tratadas con Cdc7 siRNA. También hemos generado células HeLa que expresan mKO2-AuroraA. Expresión y actividad de AuroraA, una de las quinasas mitóticas, se conoce a pico en la fase G2 /M [24]. Consistentemente, las señales AuroraA aparecieron en la fase G2, y desaparecieron al final de la fase M en las células de control, mientras que la duración de las señales AuroraA se convirtió en mucho más tiempo después de la depleción Cdc7 (Fig. S3, S5 y S6 películas). Este efecto se observó de nuevo con otra Cdc7 siRNAs (Fig. S3C y datos no presentados). Estos resultados indican que el agotamiento de Cdc7 provoca el retraso del ciclo celular G2 en células HeLa concomitantes con el aumento de los niveles de proteína y CyclinB1 AuroraA.
células (A) HeLa se cultivaron en cubreobjetos, transfectadas con el control o Cdc7-D siRNA para 48 horas, se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron por el anticuerpo anti-CyclinB1 seguido por conjugado con FITC anti-IgG de ratón y Hoechst33342. Izquierda, Cdc7 siRNA; derecho, el control de siRNA. Green, CyclinB1; azul, ADN. Las fotografías fueron tomadas por microscopía FSX100 Olympus. Bar, 16 micras. (B) Se examinaron más de 3.000 células y se marcaron las células con señales CyclinB1 nucleares y se presentan las fracciones. "N" representa el número de experimentos independientes realizados. células (C) HeLa que expresan mKO2-CyclinB1 fueron tratados con Cdc7-D siRNA o control de siRNA. imágenes de lapso de tiempo se registraron por Olympus LCV100 (películas S3 y S4). Se presentan imágenes tomadas de los datos lapso de tiempo en los tiempos indicados. Superior, control de siRNA; inferior, Cdc7 siRNA. señales rojas muestran mKO2-CyclinB1. Las células tratadas con siRNA control indican los sometidos aparición periódica citoplasmática, la transferencia nuclear, y la degradación (panel superior), mientras que las células tratadas con siRNA Cdc7 muestran fuertes señales cytoplamic persistentes durante un largo período (panel inferior). Los números en cada tiempo de la demostración del panel (horas) después del tratamiento con siRNA. Bar: 20 micras. (D) El tiempo (h) entre la primera aparición de la señal mKO2-CyclinB1 citosólica y su translocación en el núcleo se midió en las imágenes de lapso de tiempo de control o Cdc7-D siRNA tratados células HeLa. El valor P de la prueba t no pareada de dos colas fue calculado por el software Prism.
Muchas Cdc7 reducida en las células con alta CyclinB1 citoplasmática bruscamente entrar en mitosis tras una larga detención en G2, y muy a menudo se someten aparente la muerte celular en las siguientes horas. Esto es similar a la catástrofe mitótica se informó anteriormente [25], pero las células se contuvo de proceder a la fase M por inhibición de la translocación nuclear de CyclinB1, no en la etapa de husillo de control, como se informó anteriormente en un sistema diferente [26]. En efecto, la supresión de la husillo de control de siRNA dirigido a Mad2 no afectó a la retención CyclinB1 en el citoplasma que se produce en respuesta al agotamiento Cdc7 en células HeLa (datos no mostrados).
14-3-3σ secuestra CyclinB1 en el citoplasma después de Cdc7 agotamiento
la siguiente pregunta es cómo CyclinB1 acumula en el citoplasma. 14-3-3σ se conserva, factores bien caracterizados, sabe que se unen a varios reguladores del ciclo celular y retenerlos en el citoplasma en algunas circunstancias [25]. Cada uno de los siete 14-3-3 isoformas se expresó, y se examinó su interacción con Cdc2-CyclinB1. 14-3-3σ fue uno de los ligantes más fuertes (datos no mostrados). Hemos examinado si la CyclinB1 acumulado está obligado a 14-3-3σ en células HeLa-agotado Cdc7 y encontramos que CyclinB1 obligado-14-3-3σ aumentado significativamente en las células agotadas-Cdc7 (Fig. 3A, carril 2). Además, la inmunoprecipitación de transitoriamente expresó 14-3-3σ después de Cdc7 agotamiento mostró que CyclinB1 y Cdc2 se asocian con 14-3-3σ (Fig. 3B). Sin embargo, no se logró detectar la asociación de 14-3-3σ y Cdc25C, tal como se describe anteriormente [25], [27]. Estos resultados sugieren que 14-3-3σ secuestra el complejo Cdc2-CyclinB1 en el citoplasma después de la depleción Cdc7 en células HeLa.
células (A) HeLa fueron tratados con control o Cdc7-D siRNA durante 24 hrs. Los extractos se prepararon y los inmunoprecipitados con anticuerpo anti-CyclinB1 (carriles 1 y 2) y extrae de entrada (carriles 3 y 4; 20% del extracto usado para la inmunoprecipitación) se analizaron por transferencia de Western. células (B) HeLa fueron tratados con control o Cdc7-D siRNA, seguido de la transfección de un plásmido que expresa 14-3-3σ bandera de etiquetado. Se prepararon extractos a las 48 horas después de siRNA transfección y los inmunoprecipitados con anti-Flag anticuerpo (carriles 1 y 2) o normal (control) de IgG (carriles 3 y 4) y extractos de entrada (carriles 5 y 6; 17% del extracto utilizado para la inmunoprecipitación) se analizaron por transferencia de Western. La unión de Cdc2 /CyclinB1 con 14-3-3σ aumenta después de tratamiento Cdc7 siRNA, lo que sugiere que 14-3-3σ conserva CyclinB1 en el citoplasma después de la depleción Cdc7 en células HeLa. células (C y D) HeLa fueron tratados con Cdc7-D siRNA, 14-3-3σ y Cdc7-D siRNAs, 14-3-3σ siRNA y control de siRNA durante 48 horas. (C) Análisis de transferencia Western de los extractos celulares enteros. contenido (D) de ADN de las células en C se analizaron por FACS (10.000 células para cada uno) y se presenta la fracción de las células en cada fase del ciclo celular. las células (E) HeLa que expresan mKO2-CyclinB1 fueron tratados con Cdc7-D y /o 14-3-3σ siRNA como se indica. El tiempo (h) entre la primera aparición de señales mKO2-CyclinB1 citosólicas y su translocación en el núcleo se midió usando las imágenes de lapso de tiempo, que se inició a las 24 horas después de la transfección de siRNA. El valor P de la prueba t no pareada de dos colas fue calculado por el software Prism. Co-agotamiento de 14-3-3σ llevado a una disminución en el nivel de proteínas en general CyclinB1 (C), la reducción de la muerte celular (D), y la reducción de la duración de su citoplasmática de retención (E).
reducción de la acumulación citoplasmática de CyclinB1 reduce parcialmente la muerte celular
Dado que las células que se acumulan en el citoplasma CyclinB1 son propensos a la muerte celular, se analizó si la reducción de CyclinB1 citoplasmática antagoniza el efecto de la muerte celular de agotamiento Cdc7. Co-agotamiento de tanto Cdc7 y 14-3-3σ en células HeLa redujo el CyclinB1, AuroraA, Plk1 y los niveles de proteína Cdc25C (Fig. 3C). El tiempo requerido para la translocación nuclear de CyclinB1 acortado y la población de células sub-G1 disminuyó (Fig. 3D y E). Estos resultados sugirieron que la ausencia de 14-3-3σ facilita la transición G2-M y la progresión a la siguiente etapa del ciclo celular, el rescate parcial de las células de la muerte celular.
A continuación expresamos mKO2-NLS-CyclinB1, constitutivamente, que se localiza en los núcleos de las células HeLa a finales del S a través de la metafase. En estas células, el tiempo requerido para la transición desde finales de S a G2 /M se redujo en comparación con mKO2-CyclinB1 células que expresan y la muerte celular fue eludido parcialmente a las 48 horas después de la depleción Cdc7 (Fig. 4A y B). Esto es coherente con un informe anterior de que la expresión ectópica de NLS-CyclinB1 en células HeLa redujo la G2-retardo que ocurre en respuesta a la irradiación de rayos X [28]. Sin embargo, las células que expresan mKO2-NLS-CyclinB1 todavía sufrió la apoptosis en puntos de tiempo posteriores después de la depleción Cdc7. Esto puede esperarse ya que la expresión de CyclinB1 nuclear se sabe que inducen apoptosis en células de cáncer [29]. Co-agotamiento de CyclinB1 reduce G2-elongación y rescató parcialmente la muerte celular inducida por el agotamiento de Cdc7 (Fig. 4C, D). Estos resultados apoyan la idea de que la acumulación citoplásmica de CyclinB1 y su translocación abrupto en núcleos son al menos parcialmente responsable de la muerte celular observada en células HeLa inducidas por el agotamiento de Cdc7 y que la muerte celular se puede prevenir, al menos parcialmente, al facilitar la mitosis.
células (A) HeLa que expresan mKO2-NLS-CyclinB1 (izquierda) o mKO2-CyclinB1 (derecha) fueron tratados con control o Cdc7-D siRNA y fueron monitoreados por Olympus LCV100. Las células muertas se contaron en el tiempo de lapso de imágenes en los tiempos indicados. La muerte celular se suprime en mKO2-NLS-CyclinB1 que expresan las células HeLa hasta 72 horas (en el que la mitad de las células HeLa-agotado Cdc7 son por lo general muerto). mKO2-NLS-CyclinB1 plásmido se construyó mediante la inserción de la secuencia NLS (PPKKKRKVEDP) a partir del antígeno T grande de SV40 en el plásmido mKO2-CyclinB1 entre mKO2 y CyclinB1. Alrededor de 200 ó 60 células que expresan mKO2-NLS-CyclinB1 o mKO2-CyclinB1, respectivamente, se contaron. "N" representa el número de experimentos independientes realizados. células (B) HeLa que expresan mKO2-CyclinB1 (WT) o mKO2-NLS-CyclinB1 (NLS) fueron tratados con control o Cdc7-D siRNA y la duración de la expresión CyclinB1 antes de la entrada en la fase M se midió en las imágenes de lapso de tiempo. Tras el agotamiento de Cdc7, las células NLS no acumularon el CyclinB1 etiquetado en el citoplasma, y continuaron a través del ciclo celular más o menos normalmente. las células (C) HeLa fueron tratadas con siRNAs indicados durante 48 hrs. contenido de ADN se analizaron por FACS (10.000 células para cada uno) y las fracciones de población sub-G1 se calculan y presentan. Co-agotamiento de CyclinB1 reduce la muerte celular inducida por Cdc7-D siRNA en células HeLa. (D) las células HeLa que expresan mKO2-CyclinB1 (WT) fueron tratados con Cdc7-D o Cdc7-D + CyclinB1 siRNA y el tiempo (hr) entre la primera aparición de la señal mKO2-CyclinB1 citosólica y su translocación en el núcleo se midió en las imágenes de lapso de tiempo de cada población celular. Baja regulación de la expresión CyclinB1 acortado la detención en G2 inducida por el agotamiento Cdc7. En (B) y (D), los valores de p de la prueba t no pareada de dos colas fueron calculados por el software Prism.
elongación G2 es causada por el agotamiento de Cdc7 en las células p53-negativos a través de la activación de MK2
se informó previamente que la vía de p38-MK2 se activa en las células HeLa por el agotamiento de Cdc7 [17]. Por lo tanto, hemos examinado si esta vía está involucrada en la acumulación citoplasmática de CyclinB1 en células HeLa-agotado Cdc7. En primer lugar, se confirmó que MK2 se hiperfosforila por el agotamiento Cdc7 en células HeLa, pero no en células U2OS o NHDF (Fig. 5A). Esta activación de MK2 en las células HeLa-agotado Cdc7 podría ser debido a la activación directa de MK2 por el estrés replicación inducida por Cdc7. Alternativamente, el aumento de células en la fase G2 por el agotamiento Cdc7 puede contribuir a la activación de MK2, ya MK2 se sabe que es más activo en G2 y M fases. Co-agotamiento de Cdc7 y MK2 redujo los niveles de proteína ciclina B1 y AuroraA y la fosforilación de Ser216 Cdc25C, lo que sugiere que la mitosis está parcialmente restaurada (Fig. 5B). También redujo la unión de 14-3-3σ y CyclinB1 /Cdc2 (Fig. 5C). Sin embargo, co-agotamiento de Cdc7 y MK2 no evitó la muerte de células HeLa, presumiblemente porque MK2 agotamiento solo indujo muerte celular significativa (datos no mostrados).
(A) HeLa (carriles 1, 2, 7 y 8 ), U2OS (carriles 3 y 4) y NHDF (carriles 5 y 6) las células fueron tratadas con el control o Cdc7 siRNA y enteros los extractos celulares se ejecutan en un phosgel y se analizaron por Western Blot. Carriles 7 y 8, los extractos de células HeLa tratadas con siRNA Cdc7 fueron no tratadas (-) o tratados con λ-fosfatasa (+). Las puntas de flecha indican la banda MK2 fosforilada. las células (B) HeLa fueron tratadas con ARNsi de control (carriles 1 y 5), Cdc7 siRNA (carriles 2 y 6), Cdc7 y MK2 siRNAs (carriles 3 y 7) y MK2 siRNA (carriles 4 y 8) durante 48 hrs, y CSK-solubles (carriles 1-4; Sup) y -insoluble (carriles 5-8; PPT) proteínas se analizaron por transferencia de Western. Tubulina y LaminB se muestran como controles de carga. perlas (C) Glutatión Sepharose 4B que llevan la proteína GST-14-3-3σ se incubó durante 1 hora a 4 ° C con extractos de CSK-solubles de células HeLa tratadas con ARNsi, como se muestra. Las proteínas unidas se analizaron por Western Blot. "Entrada" representa sólo los extractos sin proteína GST-14-3-3σ añadido. Cdc7 y co-MK2 agotamiento reducen la unión entre 14-3-3σ y Cdc2 /CyclinB1. las células (D) HeLa que expresan mKO2-CyclinB1 fueron tratados con siRNAs indicados. El tiempo (h) entre la primera aparición de la señal mKO2-CyclinB1 citosólica y su translocación en el núcleo se midió en las imágenes de lapso de tiempo. Co-agotamiento de MK2, p38 (quinasa aguas arriba de MK2) o ATR reduce la retención citoplásmica de CyclinB1 (alargamiento G2) se observó en células HeLa-agotado Cdc7. Los valores de P de la prueba t no pareada de dos colas fueron calculados por el software Prism. Cdc7-D siRNA se utilizó en todos los experimentos.
El tiempo requerido para la translocación nuclear después de co-agotamiento de Cdc7 y MK2 se acortó cerca del nivel de control. Además, el alargamiento G2 observado después de la depleción Cdc7 fue cancelada también por co-agotamiento de ATR o p38 con Cdc7 (Fig. 5D). Estos resultados indican que este punto de control G2 depende de la activación MK2 regulado ATR.
acumulación citoplasmática de CyclinB1 no ocurre en U2OS p53 positiva o HCT116 después de Cdc7 agotamiento
Aunque agotamiento Cdc7 en células U2OS (osteosarcoma humano), la muerte celular inducida vigorosa, los niveles de las quinasas mitóticas no aumentó (Fig. 1). Por lo tanto, hemos establecido U2OS expresan de forma estable mKO2-CyclinB1, y examinó el efecto de Cdc7 siRNA en la dinámica CyclinB1. En esta línea celular, no se observó ninguna acumulación de CyclinB1 en el citoplasma después de la depleción Cdc7. El tiempo requerido para la translocación nuclear en células U2OS-agotado Cdc7 fue similar a la de las células control (Fig. 6A). Sin embargo, se hizo más largo cuando p53 se co-agotada (Fig. 6A). El nivel de proteína CyclinB1 aumentó ligeramente después de co-agotamiento de Cdc7 y p53 en U2OS (Fig. 6B). A continuación examinó una línea celular de cáncer de colon, HCT116. En las células cancerosas HCT116 p53 positivo, los niveles de proteínas de la mitosis tales como CyclinB1 y Plk1 disminuyeron después de la depleción Cdc7 presumiblemente debido a la detención en G1 (Fig. 7A). Al mismo tiempo, la actividad /CyclinB1 Cdc2 también se redujo en las células HCT116 p53-positivos-agotado Cdc7 (Fig. 7B). El tiempo requerido para la translocación nuclear en las células HCT116 p53-positivo-agotado Cdc7 fue similar a la de las células control (Fig. 7C, panel izquierdo). En contraste, la actividad /CyclinB1 Cdc2 en HCT116 p53-negativos después de la depleción Cdc7 era casi la misma que la del control (Fig. 7B). Además, como se ve en las células HeLa, el tiempo requerido para la translocación nuclear en las células HCT116 p53 negativo-agotado Cdc7 era más larga que la del control (Fig. 7C, panel derecho). Este alargamiento G2 fue cancelada por co-agotamiento de Cdc7 y MK2 en las células HCT116 p53-negativos (Fig. 7C, panel derecho). Estos resultados indican que el alargamiento fase G2 después de la depleción Cdc7 depende de la ausencia de la proteína p53 [15], [30] - [32]
células U2OS (A) que expresan mKO2-CycinB1 fueron tratados con siRNAs y tiempo. imágenes de lapso se registraron por LCV100. El tiempo (h) entre la primera aparición de la señal mKO2-CyclinB1 citosólica y su translocación en el núcleo se midió en las imágenes de lapso de tiempo de cada población celular. En U2OS-agotado Cdc7, CyclinB1 no se acumula en el citoplasma. Sin embargo, co-agotamiento de Cdc7 y p53 causada acumulación CyclinB1 en el citoplasma por un período más largo. Los valores de P de la prueba t no pareada de dos colas fueron calculados por el software Prism. (B) Análisis Western de los extractos de células enteras de células U2OS tratadas con siRNAs indicados durante 48 horas. A phosgel se utilizó para la detección de MK2. Otras proteínas se detectaron en un gel de gradiente de 4-12%.
células p53 positivas o HCT116 -negativo (A) fueron tratados con control o Cdc7-D siRNA durante 48 hrs, y los extractos de células enteras se analizaron por Western Blot. (B) los extractos de CSK-solubles se prepararon a partir de las mismas células que en (A) y la inmunoprecipitación se llevó a cabo con el anticuerpo anti-CylinB1. la actividad de quinasa Cdc2-CyclinB1 se midió con la histona H1 como sustrato (panel superior), como se describe en "Materiales y Métodos". El siguiente gráfico muestra la cuantificación del nivel de fosforilación. panel inferior, los análisis de Western Blot de proteínas CyclinB1 en los inmunoprecipitados utilizados para ensayos de quinasa. (C) p53 positivo (izquierda) o (derecha) células HCT116 negativos al expresar mKO2-CyclinB1 fueron tratados con siRNA indicados imágenes de lapso de tiempo y se registraron. El tiempo (h) entre la primera aparición de la señal mKO2-CyclinB1 citosólica y su translocación en el núcleo se midió en las imágenes de lapso de tiempo. Los valores de P de la prueba t no pareada de dos colas se calculó mediante el software Prism.
Recientemente, se informó de que el factor de transcripción FoxO3 está implicado en la detención de G1, causada por el agotamiento de Cdc7 en las células normales [16]. FoxM1, otro miembro de la familia Fox, se sabe que regulan la expresión de los reguladores de la mitosis como PLK, CyclinB1 y ciclina A después de daño en el DNA [33] - [36]. Expresión de FoxM1 está regulada negativamente por p53 [37], [38]. En HeLa, se muestra que los niveles de mRNA de FoxM1 aumentaron después de Cdc7 agotamiento (Fig. 8A), que también puede ser en parte responsable de un aumento de los niveles de proteína FOXM1 bajo la misma condición. Estos hallazgos sugieren que estos factores de transcripción de la familia Fox pueden estar implicados en la detención del ciclo celular y la inducción de la muerte celular por el agotamiento Cdc7 en las células p53-negativos. Doble caída de Cdc7 y FoxM1 en células HeLa reduce drásticamente el nivel de ARNm CyclinB1 en comparación con el agotamiento Cdc7 solo. El nivel de proteína CyclinB1 también disminuyó por co-agotamiento de Cdc7 y FoxM1, pero no en la medida del nivel de mRNA (Fig. 8B). agotamiento FoxM1, sin embargo, no abrogar la detención G2 o reducir la muerte celular (Fig. 8D, los datos no se muestra).