Extracto
Antecedentes
Ezrin es un miembro de la ezrin, radixina, y la familia moesina que proporciona una funcionalidad vínculo entre la membrana plasmática y el citoesqueleto de actina cortical. Una correlación entre la sobreexpresión ezrin y el comportamiento agresivo del cáncer se ha informado recientemente en diversos tipos de tumores. Sin embargo, su papel en los mecanismos de progresión del carcinoma de células escamosas lengua (SCC) subyacentes no están claros.
Método
Se utilizó SCC de lengua humana y microarrays de tejidos cancerosos inmunohistoquímica para analizar el nivel de expresión y ezrin su relación con la actividad proliferativa. Se utilizó la línea celular SCC lengua humana HSC-3 para determinar los efectos de RNA ezrin interferencia (RNAi) en las células cancerosas durante MTT; herida ensayos curativos y de invasión; inmunofluorescencia del citoesqueleto de actina; y el Western Blot de E-cadherina, N-cadherina, β-catenina, y el total de activo y RhoA /Rac1 /Cdc42.
Resultados
Ezrin se sobreexpresa en el 46,4% de los tumores examinados en microarrays de tejidos humanos lengua SCC. Ezrin expresión se correlacionó con el índice Ki-67. Ezrin agotamiento de RNAi en las células HSC-3 reduce significativamente la proliferación celular, la migración, y la invasividad y perturbado reorganización de la actina durante la formación podia. Sus efectos sobre la expresión de RhoA /Rac1 /Cdc42 no fueron significativas, mientras que mejora E-cadherina y β-catenina expresión y la disminución de la expresión de N-cadherina.
Conclusiones
Ezrin a menudo se sobreexpresa en primaria los CCE lengua y puede tener un papel importante en su crecimiento, la migración y la invasión posiblemente a través de su relación con el /complejo de β-catenina e-cadherina y el interruptor de cadherina. Por lo tanto, ezrin podría ser una diana terapéutica en SCC de lengua
Visto:. Saito S, Yamamoto H, Mukaisho K-i, S Sato, Higo T, Hattori T, et al. (2013) mecanismos subyacentes a la progresión del cáncer causados por Ezrin sobreexpresión en Tongue Carcinoma de células escamosas. PLoS ONE 8 (1): e54881. doi: 10.1371 /journal.pone.0054881
Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Septiembre, 2012; Aceptado: 17 de diciembre de 2012; Publicado: 24 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Saito et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) es Actualmente el séptimo cáncer más común, con 260.000 nuevos casos diagnosticados cada año y aproximadamente 128.000 muertes anuales en todo el mundo [1], [2]. La lengua es uno de los sitios más comunes de origen de CECC en Japón [3]. Cuello de los ganglios linfáticos metástasis es uno de los determinantes más importantes de la supervivencia y proporciona una buena guía para las estrategias de tratamiento [4] - [8]. Sin embargo, la calidad de vida y la tasa de supervivencia de cinco años son bajos en cánceres avanzados de la lengua, incluso con terapia multimodal actual y la escisión quirúrgica acompañada por la quimioterapia y la radioterapia. Para mejorar los resultados de los cánceres avanzados de la lengua, es necesario desarrollar nuevas terapias dirigidas basadas en la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a la conducta agresiva de cáncer de lengua.
Ezrin se aisló inicialmente como un componente del citoesqueleto de las microvellosidades intestinales, y se sabe que es un sustrato de tirosina quinasa [9]. Ezrin es un miembro de la familia ezrin, radixina, y la proteína que une moesina F-actina a la celda proteínas de la membrana después de la fosforilación [10] - [13]. Esta función enlazador sugiere que ezrin es esencial para muchos procesos celulares fundamentales, incluida la determinación de la forma de la célula, la polaridad, la estructura superficial, la adhesión celular, la motilidad, la citocinesis, la fagocitosis, y la integración de transporte de membrana a través de vías de señalización [14] - [17] . Se espera que estos aspectos funcionales de ezrin para promover la progresión tumoral. De hecho, estudios recientes han revelado que ezrin puede tener un papel importante en la tumorigénesis, el desarrollo, invasión y metástasis, probablemente a través de la regulación de moléculas de adhesión, la participación en la transducción de señal de la célula, y la señalización a otros canales de la membrana celular en el tumor [18] - [22]. Ezrin es un factor indispensable para la metástasis de células tumorales en osteosarcomas [23], cáncer de mama [24], carcinomas nasofaríngeos [25], y el cáncer de próstata [26]. expresión Ezrin también se ha relacionado con la supervivencia pobre en varios tipos de cáncer, incluyendo los carcinomas de mama [21], [27], endometrio [28], y ovario [29]; cutáneos y melanomas de úvea [30]; y sarcomas de tejidos blandos [31], [32]. Sin embargo, su papel en el cáncer oral no están claros. Este estudio tuvo como objetivo aclarar las funciones de ezrin en la progresión del SCC de lengua con la interferencia de ARN Ezrin (RNAi) en una línea celular derivada de SCC de lengua. Utilizamos SCC lengua primarios para determinar la frecuencia de la sobreexpresión ezrin y las correlaciones de expresión ezrin con el índice Ki-67 y el índice de apoptosis, que reflejan las contribuciones de la proliferación celular y la pérdida de células, respectivamente, para el crecimiento del tumor y la agresividad. Nuestros resultados sugieren que ezrin puede ser adecuado para la terapia génica dirigida en los CE de la lengua.
Materiales y Métodos
tinción inmunohistoquímica de Ezrin y el examen histológico
El tejido normal y tumoral lengua microarrays de seres humanos utilizados en este estudio se obtuvieron de los Estados Unidos Biomax Company (MD, EE.UU.). De las 79 muestras, 10 eran tejidos normales de la lengua y 69 fueron tejidos SCC de lengua. EE.UU. Biomax Compañía obtuvo los recursos de tejido de los bancos de tejidos que garantizaron que todas las colecciones de tejidos humanos se llevaron a cabo en los hospitales certificados de acuerdo a los más altos estándares éticos. Todos los tejidos humanos, también se recogieron de acuerdo con los protocolos que cumplieron con la Ley de Responsabilidad y Portabilidad del Seguro Médico (HIPAA). Se certificó que todos los bancos de tejidos que proporcionaron los recursos de tejido humano cumplen los siguientes requisitos del Acuerdo de transferencia de material humano: se anónimos identidad del donante y todos los tejidos y los datos fueron etiquetados utilizando un código de identificación para proteger la identidad de los donantes de tejidos. El consentimiento informado se mantiene en los bancos de tejidos y no proporcionada a US Biomax Company, protegiendo así la privacidad del donante
La tinción inmunohistoquímica de los microarrays de tejidos humanos lengua SCC se realizó mediante un anticuerpo de conejo anti-Ezrin (# 3145;. Cell Signaling, MA, EE.UU.) y un ratón monoclonal anti-Ki-67 anticuerpo (clon: MIB-1; Dako, Glostrup, Dinamarca). La tinción se realizó utilizando un descubrimiento automatizado XT IHC Stainer con un kit de detección Ventana DABMap (Nº 760-124; Ventana Medical System, AZ, EE.UU.). Cada paso del procedimiento de kit de detección Ventana DABMap se optimizó en el instrumento de descubrimiento XT, y fueron ajustados a las condiciones. la recuperación de antígenos de las secciones de tejido se realizó utilizando el calor
La intensidad de la tinción del tejido de la lengua humana SCC se clasificó de la siguiente manera:. 0, negativo; 1+, débil; 2+, moderada; y 3+, intenso. Esta clasificación utiliza los siguientes criterios: 1+ indican una intensidad similar a la encontrada en el tejido de la lengua normales; 3+ indica una tinción intensa de la membrana y el citoplasma; 2+ indica una intensidad entre 1+ y 3+. Dicotomizamos las categorías durante el análisis estadístico. Por lo tanto, una intensidad de tinción débil-moderada indica una baja expresión ezrin, mientras que una intensidad de tinción intensa indica la expresión de alto Ezrin.
Ki-67 se expresa generalmente en el núcleo de la célula. El índice Ki-67 (es decir, el número de células tumorales Ki-67-positivos dividido por el número total de células tumorales × 100%) se determinó contando el número de células tumorales en tres campos de alta potencia seleccionados al azar (× 400 ).
El índice de apoptosis se midió utilizando un kit de apoptosis in situ de detección (Takara Bio, Otsu, Japón). Los procedimientos de tinción siguieron las instrucciones del fabricante. Después de la desparafinación de rutina, el tejido fue digerido con proteinaseK (20 mg /ml en PBS) durante 15 min a temperatura ambiente y se lavó con PBS. Los portaobjetos se incubaron a continuación en peróxido de hidrógeno al 3% durante 5 min y se lavaron con PBS. enzima TdT y el sustrato se pipetearon sobre las secciones, que se incubaron luego a 37 ° C durante 90 min. Después del lavado, se añadió anti-FITC conjugado HRP a los portaobjetos durante 30 min. Los portaobjetos se lavaron, se tiñeron con diaminobenzine (Nichirei, Tokio, Japón), y el contraste con hematoxilina. El índice apoptótico (el número de células tumorales positivas dividido por el número total de células tumorales × 100%) se determinó contando el número de células tumorales en tres campos de alta potencia seleccionados al azar (× 400). También se evaluaron las correlaciones entre la expresión ezrin, Ki-67, y el índice de apoptosis en los tejidos humanos lengua SCC.
Cultivo de células
La línea celular SCC de lengua HSC-3 fue adquirido de JCRB Cell Bank y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de solución de antibiótico-antimicótico (Invitrogen, CA, EE.UU.) a 37 ° C en una atmósfera humidificada suplementado con
2.
pequeños ARN de interferencia (siRNA)
Ezrin siRNA (5'-GAUUUCCUACCUGGCUGAAGCUGGA-3 ') y el control nonsilencing (NSC) siRNA fueron adquiridos de Invitrogen 5% de CO . Las células fueron transfectadas usando el reactivo Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron los transfectadas con siRNA ezrin HSC-3 células (ezrin-siRNA) y transfectadas con NSC HSC-3 células (NSC) en todos los
in vitro
experimentos.
transcripción inversa cuantitativa reacción en cadena de polimerasa (QRT-PCR)
En la qRT-PCR, el ARN total fue aislado de las líneas celulares usando RNeasy (Qiagen, Tokio, Japón) y se sintetizó ADNc a partir de 2 g del ARN total. ADNc se sometió a PCR (LightCycler480, Roche, Tokio, Japón) usando cebadores y SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara Bio). Todos los cebadores de PCR se adquirieron de Takara Bio y sus secuencias se muestran en la Tabla 1. La PCR se realizó usando las siguientes condiciones: desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de PCR a 95 ° C durante 5 s, hibridación a 60 ° C durante 20 s, y elongación a 72 ° C durante 10 s. Los niveles de expresión de ARNm se normalizaron contra los niveles de expresión de ARNm del gen estándar interno gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).
Western Blot
Las células confluentes se lisaron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, cloruro de sodio 150 mM, EDTA 0,5 mM, 0,09 unidades /ml de aprotinina, 1 mg /ml de pepstatina, 10 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y 1 mg /ml de leupeptina). lisados de proteínas (20 g por carril) detectados en el ensayo de proteínas BCA se separaron usando un -12% en gel de gradiente de SDS-PAGE 4% (NuPAGE, Invitrogen) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Invitrogen). Las membranas se bloquearon con 4% de leche sin grasa seca en TBS-T (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 g /L de cloruro de sodio, y 0,1% de Tween 20) antes de incubar con anticuerpos primarios.
Anti- anticuerpo de conejo ezrin (# 3145) fue adquirido de Señalización celular Tecnología. Anti-β-actina anticuerpo monoclonal de ratón (SC-47778) y el anticuerpo de ratón anti-N-cadherina (sc-7939) fueron adquiridos de Santa Cruz Biotechnology (CA, EE.UU.). El anticuerpo anti-E-cadherina de ratón (clon 36) y el anticuerpo de ratón anti-β-catenina (clon 14) se adquirieron de Becton Dickinson and Company (BD; NJ, EE.UU.). De cabra anti-IgG de conejo (# L3012; Signalway de anticuerpos, TX, EE.UU.) y conjugado con peroxidasa de cabra conjugado con peroxidasa anti-IgG de ratón (# AP124P; Millipore, MA, EE.UU.) fueron utilizados como anticuerpos secundarios. β-actina se utilizó como control positivo interno. Las proteínas se visualizaron utilizando sustrato HRP (Millipore) y se escanean con un sistema de quimioluminiscencia potenciada (Las 4000; Fuji Film, Tokio, Japón). Las intensidades de las bandas se normalizaron a ß-actina.
Ciclo celular y apoptosis ensayo
Las células (1 × 10
5) fueron sembradas en 75-cm
2 frascos y se transfectaron con ezrin o control negativo siRNA. Las células se recogieron tres días después de la transfección y se prepararon para análisis de citometría de flujo. Las células se fijaron durante 30 min en 70% de etanol y se tiñeron con yoduro de propidio. Las mediciones del contenido celular de ADN se realizaron utilizando un FACSCalibur (BD).
El crecimiento celular ensayo
Un ensayo de MTT se utilizó para evaluar el crecimiento celular. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos (1 x 10
4 células /pocillo), y se añadió al medio después de la incubación durante 24, 48, 72, o 96 h, la solución de MTT (0,25 mg /ml). cristales de formazán se disolvieron en DMSO, y la absorción se midió a 570 nm usando un lector de microplacas Infinito 200 (TECAN, Kawasaki, Japón).
La migración de células de ensayo
migración se evaluó utilizando una cicatrización de la herida ensayo. Las células se cultivaron en placas de 12 pocillos a un nivel casi confluentes en DMEM que contenía 10% de FBS. rayas cruzadas se hicieron en el cultivo en monocapa utilizando puntas de pipeta 200 microlitros. Las células se lavaron inmediatamente con DMEM que contiene 10% de FBS para retirar las células desprendidas. Las células se incubaron en un medio que contiene la mitomicina (3 mg /ml; Nacalai Tesque) durante 1 h para inhibir la proliferación. Por lo tanto, el aumento observado en el número de células no era atribuible a un aumento de la proliferación celular. La migración celular se controló durante 0, 12, 24, y 48 h, y las imágenes se capturaron en cada punto de tiempo usando una cámara digital (Nikon, Tokio, Japón) unido a un microscopio de contraste de fases invertido (Nikon).
invasión de ensayo
Los ensayos de invasión utilizaron 24 pocillos cámaras de invasión de Matrigel BD BioCoat con insertos de 8 micras de poro (BD). Las células (5 × 10
4) suspendido en DMEM libre de suero se sembraron en los insertos superiores, mientras que DMEM que contiene 10% de FBS se añadió a las cámaras inferiores como un quimioatrayente. Las células se retiraron de la superficie superior del filtro por raspado con un hisopo de algodón después de 22 h en cultivo. Las células que se infiltraron a través del filtro se fijaron y se tiñeron con hematoxilina-eosina (H /E). Los valores medios de los resultados obtenidos con las tres cámaras se utilizaron en el análisis.
inmunofluorescencia
Las células cultivadas en portaobjetos de cultivo de ocho pocillos se fijaron con 3,7% de formaldehído en PBS durante 30 min, permeabilizaron con 0,25% de Triton X-100 (Merck Calbiochem, Darmstadt, Alemania), y se bloquearon con 1% de FBS en PBS. La actina se tiñó con rodamina-faloidina (Invitrogen). Inmunofluorescencia imágenes se visualizaron utilizando una Olympus BX-61 microscopio de fluorescencia (Olympus, Tokio, Japón), y las imágenes fueron capturadas con una cámara CoolSNAP-HQ (NIPPON Roper, Tokio, Japón).
ensayo de actividad de la familia Rho
Rho activación familia ensayo también se realizó utilizando un Kit de RhoA /Rac1 /Cdc42 activación Combo (célula Biolabs, San Diego, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las células se lavaron, se lisaron en tampón de ensayo, y se centrifugaron a 10.000 x
g
durante 1 minuto para eliminar los restos celulares. Para determinar el total de los niveles de expresión de RhoA /Rac1 /Cdc42 por Western Blot, 20 l de cada muestra se almacenó a -80 ° C para análisis por separado. Un lisado celular que contiene 500 g de proteína total se incubó durante 1 h a 4 ° C con rotación con 40 l de las perlas de agarosa, que se unió activan RhoA, Rac1, Cdc42 y. perlas de agarosa unidos a activa RhoA /Rac1 /Cdc42 se lavaron tres veces usando tampón de ensayo, se resuspendieron en 40 l de 2 x tampón de muestra LDS, y se hirvieron a 70 ° C durante 10 min. El activo niveles de proteína total RhoA /Rac1 /Cdc42 (unida a GTP) y en cada muestra se determinó por Western Blot.
Los análisis estadísticos
Cada experimento se realizó por triplicado. Todos los datos se expresan como la media ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó utilizando Excel (Microsoft, WA, EE.UU.). Las comparaciones entre grupos se realizaron utilizando de Student
t-test
. La correlación de los niveles de expresión Ezrin con SCC de lengua y de la metástasis de los ganglios linfáticos se analizó mediante la prueba exacta de Fisher, mientras que los grados de la etapa de diferenciación y se analizaron utilizando el método de comparación múltiple de Tukey. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a
P
. & Lt; 0,05
Resultados
Ezrin expresión en el cáncer de lengua y tejidos cancerosos
No se observó inmunoreactividad en el Ezrin membranas celulares, mientras que fue débilmente positiva en el citoplasma de mucosa normal lengua (Fig. 1A). En contraste, las muestras de SCC lengua demostraron tinción ezrin la membrana citoplasmática y, y la tinción citoplásmica fue mayor en estas muestras que en las muestras normales de la mucosa lengua (Fig. 1B). La Tabla 2 presenta los resultados de la tinción Ezrin. En los tejidos humanos no cancerosos de la lengua, los 10 muestras expresaron ezrin en niveles bajos. En los tejidos de la lengua SCC humanos, sin embargo, se detectó una elevada expresión ezrin en 32/69 tumores (46,4%), mientras que la baja expresión se detectó en 37/69 tumores (53,6%). La expresión de alto ezrin fue significativamente más frecuente en los tejidos de la lengua SCC humanos que en los tejidos no cancerosos (
P = 0,0046)
. Alta expresión ezrin tendía a ser detectado con mayor frecuencia en los casos con metástasis en los ganglios linfáticos (62,5%) que en con aquellos sin metástasis ganglionar (44,3%), pero no hubo correlación significativa entre los niveles de expresión ezrin y el grado etapa, regional metástasis en los ganglios linfáticos y el grado de diferenciación (
P Hotel & gt; 0,05)
(a) expresión Ezrin fue baja en los tejidos no cancerosos (magnificación × 40 y 200 ×).. (B) Ezrin fue altamente expresado en la lengua carcinomas de células escamosas (ampliación × 40 y 200 ×). Ezrin inmunoreactividad fue evidente en la membrana del epitelio de la lengua normal, mientras que la tinción positiva para ezrin fue principalmente en el citoplasma o en la membrana y el citoplasma de las células de carcinoma de células escamosas de la lengua.
Las correlaciones entre ezrin expresión y los índices de Ki-67 y la apoptosis en los tejidos SCC de lengua humana
Se evaluaron las correlaciones entre la expresión ezrin y el Ki-67 y los índices de apoptosis en los tejidos humanos lengua SCC. El índice Ki-67 fue 33,0 ± 19,3% en los tejidos con bajos niveles de expresión Ezrin y el 48,1 ± 15,0% en los tejidos con altos niveles de expresión Ezrin (Fig. 2A). Hubo una correlación positiva entre los niveles de expresión Ezrin y el índice Ki-67 (
P = 0,0003
). El índice apoptótico fue de 0,60 ± 0,74% en los tejidos con bajos niveles de expresión Ezrin y 0,70 ± 0,78% en tejidos con alta Ezrin niveles de expresión (Fig. 2B). No hubo correlación significativa entre los niveles de expresión Ezrin y el índice de apoptosis (
P = 0,5776
).
(A) El índice Ki-67 fue 33,0 ± 19,3% en los tejidos con baja ezrin expresión y 48,1 ± 15,0% en tejidos con una expresión de alto ezrin. No se observaron diferencias significativas en la correlación entre la expresión Ezrin y el índice Ki-67 (
P = 0,0003
). (B) No hubo correlación significativa entre la expresión ezrin y los índices de apoptosis (
P = 0.5776)
.
Ezrin la expresión génica en la línea celular SCC lengua humana HSC-3 después de RNAi
para examinar los efectos del tratamiento ezrin siRNA en las células HSC-3, se utilizó QRT-PCR y Western Blot para medir el ARNm ezrin y los niveles de proteína, respectivamente, en las células HSC-3 que se transfectaron con siRNA. Como se muestra en la Figura 3A, la expresión de mRNA ezrin fue claramente inhibida en las células ezrin-siRNA que en las células NSC (0,10 ± 0,03 vs 1,06 ± 0,21;
P
& lt; 0,05). El análisis de transferencia Western demostró que la RNAi redujo los niveles de proteína ezrin (Fig. 3B).
(A) expresión Ezrin mRNA se analizó mediante PCR a tiempo real después de RNAi. La inhibición de la expresión de ARNm ezrin se observó claramente en ezrin siRNA transfectadas HSC-3 células en comparación con la de las células de control HSC-3 (0,10 ± 0,03 vs 1,06 ± 0,21;
P
& lt; 0,05). expresión de la proteína (B) Ezrin se detectó por Western Blot después de RNAi. La expresión de ezrin se redujo drásticamente en las células HSC-3 transfectadas con siRNA Ezrin.
Efectos de ezrin RNAi en la progresión del ciclo celular y la apoptosis
transfectaron las células 3-HSC con ezrin siRNA y las recogió después de tres días para el análisis del ciclo celular. La citometría de flujo mostró que la fracción G0 /G1 se incrementó de 37.7% ± 4,9% a 54,1% ± 0,5% (
P
= 0,0046) en las células HSC-3 después de RNAi (Fig. 4). En contraste, la G2 fracciones /M S y se redujeron en la HSC-3 células después de RNAi. En particular, las proporciones de células en fase S se redujo de 50,8% ± 1,6% a 36,6% ± 0,4% (
P
= 0,0018), mientras que la proporción de la G2 /M células disminuyeron de 11,5% ± 3,3% al 9,3% ± 0,9% (
P = 0,1155
). No se observaron células preG0 /G1 o cuerpos apoptóticos en el control y las células siRNA transfectadas. Estos resultados sugieren que ezrin siRNA puede inhibir la proliferación celular al interferir con la mitosis celular y la progresión del ciclo celular.
La proporción de HSC-3 células en la fase S se redujo de 50,8 ± 1,6% a 36,6 ± 0,4% después de RNAi (
P = 0,0018
). La proporción de células en la fase G0 /G1 también aumentó de 37,7 ± 4,9% a 54,1 ± 0,5% después de RNAi (
P
= 0,0018). La apoptosis no se detectó.
Efectos de ezrin RNAi sobre el crecimiento celular
Los efectos de la expresión de la proteína ezrin sobre el crecimiento celular se ensayaron usando un ensayo MTT. La tasa de crecimiento de las células tratadas con ARNsi ezrin disminuyó de una manera dependiente del tiempo (Fig. 5). Los valores de absorbancia del ensayo MTT después de 72 horas fueron 0,36 ± 0,02 y 0,30 ± 0,01 para el NSC- y células HSC-3 transfectadas con siRNA ezrin, respectivamente. Estos datos indican que hubo una reducción significativa en el crecimiento celular en las células transfectadas con siRNA ezrin que en las células de control.
El crecimiento de las células HSC-3 transfectadas con siRNA ezrin disminuyó de una manera dependiente del tiempo. (24 h:
P = 0,6727
; 48 h:
P = 0,5314
; 72 h:
P = 0,0122
; 96 h:
P
= 0,0065).
Efectos de ezrin RNAi sobre la migración celular y la invasión
cicatrización de heridas ensayos se llevaron a cabo para evaluar la motilidad de las células de la NSC- y las células transfectadas con siRNA ezrin. Una herida fue creado en una monocapa de células, y cierre de la herida fue evaluada en diversos puntos temporales. Ezrin silenciamiento en las células HSC-3 deteriora su capacidad para curar una herida en comparación con la de las células control que expresaban ezrin (Fig. 6). Invasión ensayos también se realizaron usando cámaras de cultivo Transwell con recubrimiento de Matrigel, y se contaron las células invasoras después de 22 h. Las células transfectadas con siRNA ezrin exhibieron un pliegue de cuatro tasa más baja de células invasión de las células transfectadas con NSC que expresa Ezrin (564,7 ± 111,8 vs 126,6 ± 1969,8;
P Hotel & lt; 0,05; Fig. 7).
las células fueron heridos por el rascado con una punta de pipeta, y mitomicina se añadió (3 mg /ml) al medio durante 1 h para inhibir la proliferación de células cancerosas. Las células se incubaron a continuación con DMEM durante 48 h. Las células se fotografiaron usando microscopía de contraste de fase. la migración de células HSC-3 se redujo mediante el tratamiento ezrin siRNA.
(A) cámaras Transwell con recubrimiento de Matrigel se utilizaron para analizar la invasión de células. Las células que se infiltraron a través del filtro se fijaron y tiñeron, y se fotografiaron campos representativos. (B) Las células se cuantificaron mediante recuento con un microscopio de luz. En comparación con las células control HSC-3, las HSC-3 células transfectadas con siRNA ezrin mostraron una disminución significativa de invasión (1969,8 ± 126,6 vs 564,7 ± 111,8;
P Hotel & lt; 0,05).
efectos de ezrin RNAi en la reorganización del citoesqueleto de actina
Se analizaron los efectos de la regulación a la baja ezrin en la organización del citoesqueleto de actina. Los análisis de las células con faloidina manchado mostraron que la formación podia fue claramente inhibida en las células transfectadas con siRNA ezrin (Fig. 8). Estos resultados indican que la ausencia de ezrin provocó cambios morfológicos en las células de cáncer a través de la remodelación del citoesqueleto de actina
.
NSC- y células HSC-3 transfectadas con siRNA ezrin se marcaron con un anticuerpo contra actina. Ezrin agotamiento de HSC-3 células condujo a los niveles de proteína ezrin reducidos. Esta regulación a la baja se asoció con la pérdida de salientes (flechas).
proteínas de la familia Rho, E-cadherina, N-cadherina, y la expresión β-catenina en las células ezrin-agotado
No hubo diferencias en el total de los niveles de proteína de RhoA, Rac1, Cdc42 y (Fig. 9), y los niveles de sus formas activas eran demasiado bajo para ser detectado en las células transfectadas con siRNA NSC- y ezrin.
la expresión de e-cadherina y β-catenina se incrementó y la expresión de N-cadherina se redujo en ezrin siRNA-transfectadas HSC-3 células en comparación con la de las células transfectadas con NSC. No hubo diferencia significativa en el total de los niveles de proteína de RhoA, Rac1 y Cdc42.
Hemos probado si los niveles de expresión de E-cadherina, N-cadherina y β-catenina se vieron afectados por el agotamiento ezrin en las HSC-3 células mediante la cuantificación de su expresión mediante Western Blot. Como se muestra en la Figura 9, E-cadherina y expresiones β-catenina se aumentaron, mientras que la expresión N-cadherina se redujo en las células transfectadas con siRNA ezrin que en las células transfectadas con NSC. Estos resultados indican que la supresión de la expresión de la proteína ezrin inducida por la regulación al alza de E-cadherina y β-catenina, pero la regulación a la baja de N-cadherina en las células HSC-3.
análisis Discusión
microarrays de tejidos mostró que la expresión de alto ezrin fue significativamente más frecuente en los tejidos lengua SCC humanos que los tejidos no cancerosos (
P = 0,0046
). También había una correlación positiva entre la expresión de ezrin y el índice Ki-67 en este estudio. El antígeno Ki-67 se expresa por la proliferación de células durante la G1, S, G2, y M fases, pero no durante la fase G0 (células en reposo) [33]. Ki-67 se utiliza como un marcador de la proliferación de tumor y la agresividad, y puede tener un efecto importante en el pronóstico de pacientes con HNSCC [34]. Alta expresión ezrin tendía a ser detectado con mayor frecuencia en los casos con metástasis en los ganglios linfáticos (62,5%) que en los pacientes sin metástasis en los ganglios linfáticos (44,3%). Nuestro
in vitro
experimentos usando la línea celular SCC lengua humana HSC-3 con y sin tratamiento con ARNi también detectaron una asociación entre la sobreexpresión ezrin y un comportamiento más agresivo, mientras que no hubo correlaciones significativas entre los patrones de expresión ezrin y TNM puesta en escena en los tejidos humanos lengua SCC. Nicolas et al. También informó que no hubo diferencia significativa en la expresión ezrin en tumores avanzados e inferior estadio TNM, mientras que los altos niveles de ezrin y moesina expresión se asociaron con una baja supervivencia del cáncer [35], [36]. Estos hallazgos sugieren que la sobreexpresión ezrin puede ser utilizado como un marcador pronóstico independiente de la estadificación TNM.
El
in vitro
papeles de ezrin en el comportamiento celular no han sido evaluados en los CE de la lengua. Nuestros experimentos de ARNi detectaron fuerte supresión del crecimiento celular, la motilidad y la invasión en las células SCC lengua HSC-3. El análisis del ciclo celular reveló que el agotamiento ezrin aumentó la fracción G0 /G1, pero disminuyó la fracción G2-M al interferir con la mitosis celular y la progresión del ciclo celular. Estos resultados coinciden con los reportados por Zhang et al. en el carcinoma hepatocelular [37]. También indicaron que ezrin podría mejorar el crecimiento de las células cancerosas mediante el apoyo a la división celular y la progresión del ciclo celular de G0 /G1 a la G2 /M fases S y. Esto está de acuerdo con los resultados de los microarrays de tejidos índice Ki-67. También observamos que el agotamiento ezrin inhibe el crecimiento celular en un ensayo de MTT.
migración celular y la invasión son procesos esenciales en la metástasis de las células cancerosas. las células cancerosas migratorias sufren una serie de cambios morfológicos a través de la reorganización de las moléculas de adhesión y las fibras de actina [38]. Ahora es ampliamente aceptado que el proceso de migración de las células del cáncer implica cuatro etapas principales, la formación y la extensión de filopodios y lamelipodia en el borde delantero, el establecimiento de nuevos sitios de adhesión en la parte delantera, la contracción del cuerpo de la célula, y el desprendimiento de las adherencias en el posterior [39]. Hemos observado que el agotamiento ezrin disminución de la motilidad de células de cáncer y la invasión y la formación podia inhibido. Estos resultados indican que la inhibición ezrin perturbado remodelación del citoesqueleto de actina, lo que redujo la motilidad e invasividad de las células HSC-3. Estos hallazgos están de acuerdo con los informes anteriores, que mostraron que los cambios en el citoesqueleto pueden ser un factor clave en la regulación de la progresión neoplásica y el crecimiento del tumor [24], [40] - [43]. Un estudio previo también detectó una reducción dramática en el número de células de cáncer pancreático con rosetas podosomal después del tratamiento ezrin RNAi e informó de que la formación de podosomes y sus rosetas fue impulsado por una interacción ezrin-cortactin, que tiene un papel en la invasión del cáncer de páncreas [44 ]. Otro informe reveló que la formación de pseudópodos se disminuye claramente por el tratamiento ezrin RNAi en cuatro líneas celulares de carcinoma hepatocelular [37]
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Nuestros resultados sugieren que ezrin juega un papel importante en el crecimiento invasivo de los CE de la lengua. También se examinó la actina, proteínas de la familia Rho, E-cadherina, N-cadherina y β-catenina para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a estas observaciones. Se encontró que la supresión inducida por ezrin la mayor expresión de E-cadherina y β-catenina en las células HSC-3. Se sabe que la E-cadherina juega un papel central en la adhesión célula-célula epitelial y el mantenimiento de la integridad epitelial de colonias de células [45]. Está bien documentado que la pérdida o inhibición de la función E-cadherina, catenina o sus asociados, conduce a la adhesión intercelular reducida y un mayor potencial invasivo [46]. Por otra parte, varios estudios de tumores malignos epiteliales, incluyendo SCC bucal, han sugerido que el complejo de E-cadherina /β-catenina regula la invasión del cáncer y la metástasis [47], [48]. complejos de adhesión cadherina interactúan con el citoesqueleto de actina de una manera compleja, que es poco conocido. La opinión actual es que la E-cadherina está vinculado al citoesqueleto de actina a través de su interacción con β-catenina, que a su vez se une a la proteína de unión a actina-α-catenina [49]. La evidencia reciente sugiere que ezrin es importante para la localización de E-cadherina en la membrana plasmática [24]. Por lo tanto, la hipótesis de que la E-cadherina y β-catenina regulación a la baja vinculado a Ezrin sobreexpresión puede haber sido asociada con la remodelación de la actina y la formación de extensiones podios.
Es ampliamente conocido que la reorganización de la actina está regulada por la Rho familia GTPasas pequeñas tales como Rho, Rac y Cdc42 [50], es decir, Rho regula de fibras de estrés y el montaje de adhesión focal, Rac regula la formación de salientes lamellipodia y ondulaciones de la membrana, y Cdc42 desencadena extensiones filopodial en la periferia de la célula [51]. Se examinó la expresión y la actividad de RhoA, Rac1, Cdc42 y en el ezrin siRNA- y células HSC-3 transfectadas con NSC.